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二代测序技术的原理与应用_图文

二代测序技术的原理与应用

测序技术的发展历程

核酸基本知识

核酸基本知识-PCR
? 聚合酶链式反应—Polymerase Chain Reaction ? 1983 Mullis 获得1993年的诺贝尔化学奖 ? Taq DNA聚合酶、引物、dNTP、模板和Mg2+

第一代测序技术-sanger法测序

第一代测序技术-sanger法测序
? 底物:模板DNA, Taq 酶, dNTPs, ddNTPs 和测序引物 ? 变性-复性-延伸-终止 ? ddNTP可以当作正常碱基参与复制,一旦链入DNA中,其后就不能再继续 连接。反应体系中dNTPs 的浓度远高于ddNTPs( 一般3~4: 1) 。

第二代测序技术
? 高通量测序技术
大大降低了测序成本的同时,还大幅提高了测序速度,并且保持了 高准确性

? 主流平台
Ilumina (Solexa, Hiseq); Roche 454; ABI(Solid)

? 测序原理
合成法测序 连接法测序

第二代测序的基本流程
? 1 将目标DNA剪切为小片段
? 2 单个小片段DNA分子结合到固相表面 ? 3 单分子独立扩增 ? 4 每次只复制一个碱基(A,C,T,G)并检测信号 ? 5 高分辨率的成像系统

二代测序技术-可逆阻断技术

二代测序技术-Ilumina测序原理

二代测序技术-Ilumina测序流程

二代测序技术-Ilumina测序流程

二代测序技术- 454 测序原理
焦磷酸测序(Pyrosequencing)
在测序时,使用了一种叫做“Pico TiterPlate”(PTP)的平板,它含 有 160多万个由光纤组成的孔,孔中载有化学发光反应所需的 各种酶和底物。测序开始时,放置在四个单独的试剂瓶里的四 种碱基,依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板,每次只进 入一个碱基。如果发生碱基配对,就会释放一个焦磷酸。这个 焦磷酸在各种酶的作用下,经 过一个合成反应和一个化学发 光反应,最终将荧光素氧化成氧化荧光 素,同时释放出光信号。 此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获 到。有一个碱基和测序模板进行配对,就会捕获到一分子的光 信号;由此一一对应,就可以准确、快速地确定待测模板的碱 基序列。

二代测序技术- 454 测序流程

二代测序技术-Solid测序流程

二代测序技术-Solid测序流程

二代测序技术-Solid测序数据分析

测序技术的比较
第X代 第一代 公司 平台名称 测序方法 桑格-毛细管电泳测 序法 检测方法 大约读长(碱基数) 荧光/光学 600-1000 优点 相对局限性 ABI/生命技术公司 3130xL-3730xL 高读长,准确度一次性达标 通量低;样品制备成 率高,能很好处理重复序列 本高,使之难以做大 和多聚序列 量的平行测序 高读长,准确度一次性达标 通量低;单个样品的 率高,能很好处理重复序列 制备成本相对较高 和多聚序列;易小型化 样品制备较难;难于 处理重复和同种碱基 在第二代中最高读长;比第 多聚区域;试剂冲洗 一代的测序通量大 带来错误累积;仪器 昂贵 很高测序通量

第一代

贝克曼

GeXP遗传分析系统

桑格-毛细管电泳测 序法

荧光/光学 600-1000

第二代

Roche/454

基因组测序仪FLX系统 焦磷酸测序法

光学

230-400

第二代

Illumina

HiSeq2000,HiSeq250 可逆链终止物和合成 荧光/光学 2x150 测序法 0/MiSeq

仪器昂贵;用于数据 删节和分析的费用很 高

第二代

ABI/Solid

5500xlSolid系统

连接测序法

荧光/光学 25-35

测序运行时间长;读 很高测序通量;在广为接受 长短,造成成本高, 的几种第二代平台中,所要 数据分析困难和基因 拼接出人类基因组的试剂成 组拼接困难;仪器昂 本最低 贵

SNP的概念
? 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),主要是指 在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 ? 它是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以 上。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每500~1000个碱基对中就有 1个,估计其总数可达300万个甚至更多。 ? SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异,也就是通常说的基因 的点突变,这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换 (transversion)所引起,也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说 的SNP并不包括后两种情况。 ? 在基因组DNA中,任何碱基均有可能发生变异,因此SNP既有可能在 基因序列内,也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说,位于 编码区内的SNP(coding SNP,cSNP)比较少,因为在外显子内,其变 异率仅及周围序列的1/5.但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义, 因此cSNP的研究更受关注。

SNP的应用
? 1.寻找致病基因
遗传疾病中已发现SNP的例子,如镰刀形细胞贫血症、晚期突 发 老年性痴呆等

? 2.诊断及预测致病风险 ? 3.药物基因体学及新药的发现
临床治疗实践清楚地表明,药物的有效剂量有著极大的个体差 异,可以视为一种基因的表型

? 4.生物芯片快速检测

第二代测序技术的应用
? 基因组测序、重测序
? 突变体的定位 ? 寻找SNP位点 ? 全基因组甲基化测序 ? 基因表达变化分析