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茶提取物预防离体大鼠血管对硝酸甘油耐受作用的研究


第 29卷第 4期 2009年 8月

健 康 研 究
Health Research

V o.l 29 N o 4 . A ug 2009 .

茶提取物预防离体大鼠血管对 硝酸甘油耐受作用的研究
徐月波 , 林宝钗 , 李金晶 , 林素 , 陈伟庄 , 张志文 , 1 1 2 2 梁冬施 , 汪琳彬 , 林国华 , 刘翠清
( 1 杭州师范大学临床医学院, 浙江 杭州 310036 2 杭州师范大学基础医学部 生理学教研室, 浙江 杭州 310036) . ; . 1 1 1 1 1 1

摘要: 目的

探讨茶提取物茶多酚和茶黄素预防离体大鼠血管对硝酸甘油 耐受的作用。 方法

用硝 酸甘油 30 M

预孵 90 m in的方法诱导大鼠离 体胸主动脉环对硝酸甘油产生耐受, 用苯肾上腺素预 收缩血管, 通过 organ ba th的方 法观察茶提取物茶多酚和茶黄素 处理与否对硝酸甘油舒 张血管 作用的 影响。结果 甘油的舒张反应显著减 弱, pD2由对照组的 8. 21 P < 0. 05 各组 Em ax 无显著变化。结论 ; 中图分类号: R 33. 3 预处理均使硝酸甘油耐 受血管的舒张反应 明显增 强, pD 2值 分别 为 7. 76 关键词: 硝酸甘油耐受; 氧化应激 ; 茶多酚; 茶黄素 文献标识码: A 文章编号: 1008- 4894( 2009) 04- 0259- 04 硝酸 甘油预孵 使血管 对硝酸 0 13, 与耐 受组 相比均 . 0 09降低为耐 受组的 6. 86 0. 20( P < 0. 05 ); 茶 多酚和 茶黄素 . 0. 11和 7 97 .

茶多酚和茶黄素预处理可预防离体大鼠血 管发生硝酸甘油耐受。

Prevention of nitroglycerin tolerance of in vitro rat blood vessel by tea extract
XU Yue bo , L IN Bao cha , L I Jin jin L I Su , CHEN W e i zhuang , , N ZHANG Zhi w en , L I NG Dong shi , WANG L in b ing , L I Guo hua , L I Cu i q ing A N U
1 1 1 2 2 1 1 1 1

( 1. C linicalM edica l College, B asicM edica l College, H angzhou N or al University, H anghou , Zhejiang 310036 Ch ina; m , 2. D ep ar t ent of P hy siology, BasicM ed ical College, H angzhou N ormal University, H anghou 310036 Ch ina) m , Abstrac t O bjective T o investigate the preventive effect o f tea po lyphenols and thea flav in on the n itrog lycerin to lerance o f : in v itro rat ao rta M ethod s R at aortic r ing s w ere suspended in org an bath fo r the m easurement of changes in iso etric . m tension and n itrog lycer in to le rance w as acute ly induced by preced ing exposure for 90 m in to 30 M n itrog ly ce rin. Concen tration response curves to n itrog lycerin w ere obta ined on ao rtic r ings pre contracted w ith pheny lephrine . R esu lts P re exposure o f ao rtic r ings w ith endo the lium to n itrog lycerin reduced the re laxa tions to nitrog lycer in ( pD 2 va lues 8. 21 : 0 09 in contro l g roup v s 6. 86 . 0 20 in to lerance group P < 0 05). T reat entw ith tea po lypheno ls and . , . m

收稿日期: 2009- 05- 11 基金项目: 杭州师范大学学生科研资助项目 ( N o. 2008X XM 134) 作者简介: 徐月波 ( 1986- ) , 女, 浙江慈溪人, 杭州师范大学临床医学专业本科生。 通信作者: 刘翠清 ( 1977- ) , 女, 河北盐山人, 博士, 讲师。

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健 康 研 究

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0. 11 in tea

thea flav in increased relax ation s response to nitrog ly ce rin in to lerant aortic r ing s ( pD2 values: 7. 76 po lypheno ls group and 7 97 . 0 13 in theaflavin group vs 6. 86 .

0. 20 in to lerance g roup, P < 0. 05). There is no

significant d ifference in Em ax betw een each group Con clusion N itrog ly ce rin to lerance o f in v itro aorta may be prev ented . by tea polypheno ls and thea flav in. K ey word s n itrog ly ce rin to lerance ox idativ e stress tea po lypheno ls theaflav in : ; ; ;

硝酸甘油 ( nitrog ly cer in NTG) 被广泛用于缺血 , 性心脏病的治疗。不过, 该药物长期使用时其药效 会降低, 必须增加剂量才能维持其疗效, 即引起 硝 酸甘油耐受 ! 。 100多年来, 关于其防治的解决办
[ 1]

将一根钢丝固定于标本架上, 另一根钢丝与张力换能 器连接, 平衡 90 m in 后, 调节基础张力为 2 g。待血管 平衡后, 将 Krebs液更换为 60 mM高钾溶液, 引发血管 收缩以检测血管收缩功能, 然后冲洗、 平衡 3次。加入 pheny lephrine( 3 ? 10
- 7

法一直悬而未决, 严重影响了临床硝酸酯类药物的 疗效。随着对 NTG 耐受机制的深入研究, 人们发现 NTG耐受的形成涉及多个环节。其中, 氧化应激是 所有耐受机制的 触发因素 !或者 中间枢纽 ! 效地改善 NTG 耐受
[ 3- 5] [ 1, 2]

mo l/L ), 引发血管 收缩, 然后
- 6

加入 acetylcho line ( ACh 1 ? 10 ,

m ol /L ), 血管舒张

达到 80 者, 说明内 皮功能完 好, 否 则弃之不 用。 % 然后用新鲜 K rebs液冲洗 5次。 1 2 2 . . 照
[ 9]



研究表明, 多种具有抗氧化功能的物质都能有 。天然植物中存在着很多 活性成分具有很强的保护细胞免受氧化应激损伤的 作用, 包括 茶 多酚 ( tea polyphenols, TP ) 和 茶 黄素 ( tea f la vano ls TF ) 等 ,
[ 6- 8]

建 立 离体 血 管 NTG 耐受 模 型

方法 参

, 将待用血管在含有 NTG ( 30 M ) 的 K rebs液

预孵 90 m in 然后用新鲜 Krebs液冲洗 4次, 冲洗间 , 隔 15 m in。血管用 0 3 M phenylephrine预收缩, 收 . 缩曲线达到平台后, 依次向浴槽内加入不同浓度的 NTG ( 30 n - 30 M ), 观察血管的舒张反应。对照 M 组除了不加入 NTG外, 其它处理与耐受组相同。茶 提取物 ( 茶黄素 100 1 3 数据分析 . g /m l和茶多酚 40 g /m l) 在 给予 NTG 前 10 m in加入。

。但是这些提取物是否会

通过抗氧化作用影响 NTG耐受的预防, 查阅资料未 见报道。本实验观察茶提取物对 NTG 耐受的预防 作用, 并初步探讨其机制。 1 材料与方法 1 1 仪器和药品 .

用 Gra ftpad Pr ism 4软件进行数据 SEM ) 表示。 pD2 是能 够引 发

主要仪器有: M ed lab生物信号

分析和作图处理。实验结果均以 5~ 8次实验的平 均数 标准 误 ( x 50 最大舒张反应时所需药物浓度的负对数, Em ax % 是指血管的最大舒张反应。统计检验: 多组间比较 采用单因素方差分析 ( one w ay ANOVA ) 及 Student Newm an K euls法; 不同浓度梯度曲线之间比较用多 因素方差分析 ( tw o w ay ANOVA ) 及 Bonferron i post tests法; 两组间比较用 t 检验。 2 结 果 在内皮功能完好的离

处理系统, 张力换能器 系统和恒温恒 速灌流系统。 主要药品 Pheny lephrin e Aceyt lcho lin e购自 Sigm a公 、 司, 茶多酚、 茶黄素购自杭州禾田生物制品厂, NTG 购自 Schw arz公司。 1 2 方法 . 1 2 1 离体血管张力测定 . . 选用雄性 SD 大鼠 ( 260 ~ 280 g), 吸入纯 CO2 处死后, 迅速取出胸主动脉, 并置 于充有 95 O2 + 5 CO2 混合气的低温 Krebs液 ( NaCl % % 119 0mmol /L NaHCO3 25 0 mm o l/L, KC l 4 7 mm o l/ . , . . L, KH 2 PO4 1 2 mm o l/L, M gC l ? 6 2O 1 0 mm o l/L, . H . 2 CaC l2 ? 2H 2 O 2 5 mm ol /L 和葡萄 糖 11 0 mm o l/L, . . p 值 7 4) 中, 分离并去除血管周围的结缔组织及 H . 脂肪。将分离好的动脉剪成约 2 mm 长的血管环, 将血管环通过 2 根细不锈钢丝悬挂于 organ bath槽 内, 槽内已预先放置 10 m l K rebs液, 持续通混合气, 并通过循环加热系统使槽内溶液温度维持在 37 # 。

2 1 NTG的血管舒张作用 .

体大鼠胸主动脉环, 用 pheny lephrin e( 0 3 M ) 预收 . 缩血管后, 加入 NTG( 30 n - 30 M )引发剂量依赖 M 性的血管舒张。NTG预孵 90 m in 诱导耐受后, 其舒 张血管作用的灵敏度明显减弱, 反应曲线右移, 表现 为 pD2 明显降低, 对照组与耐受组相比 P < 0 05 图 . , 1表 1 , 。虽然 NTG 预孵使最大舒张反应减小, 但和

第 4期

徐月波, 等: 茶提取物预防离体大鼠血管对硝酸甘油耐受作用的研究

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对照组相比未见显著变化。
表 1 硝酸甘油舒张血管的 pD2 和 E m ax 值 处理 对照组 耐受组 茶多酚处理组 茶黄素处理组 n 6 6 12 12 pD2 8. 21 0 09 . 6. 86 0. 20a 7. 76 0 11 . 7. 97 0 13 . E m ax (% ) 97. 6 2. 3 83. 6 0. 9 95. 9 1. 8 95. 2 3. 2

注: aP < 0. 05 vs对照 组。 ,
注: C on trol为对照组, To leran ce为耐受组, 均 n = 6 TF + Tolerance为 ; 茶黄素 100 m g/m l预处理 + 硝酸 甘油 30 M 预孵 90 m in n = 12。 , 数据用 x
* SE 表示。 P < 0 05 Tolerance vs TF+ Tolerance M . , 。

图 3 红茶提取物茶黄素 ( T F) 对硝酸甘油耐受的影响

3 讨



有学者在 实验 中发现, 将大 鼠离 体主 动脉 在 NTG 中预孵, 可以诱导血管产生 硝酸甘油耐受 !, 即血管对 NTG的舒张反应减弱。业已证实, 氧化应 激反应是众多 NTG 耐受机制的中间枢纽
[ 1, 2]

注: Con trol 为 对照 组, n = 6 To lerance为 耐 受组, NTG 30 M 预孵 ; 90 m in, n = 6。数据用
* SE 表示。 P < 0 05 vs Control M . , 。

。 NTG
-

图 1 NTG 预孵对 NTG 舒血管作用的影响

生物转化和作用过程中产生的超氧阴离子 ( O2 ) 很 容易与 NTG的活性代谢 产物 NO 发生反应产生细 胞毒性物质过 ( 氧化 ) 亚硝酸盐。一方面是 NTG 活 性代谢产物 NO 含量减少和活性降低, 另一方面是 过 ( 氧化 ) 亚硝酸盐直接收缩血管和引起脂质过氧 化, 导致 NTG扩张血管的作用减弱或消失 。这 可能是本实验中 NTG 诱导离体大鼠胸主动脉环耐 受后舒血管效应减弱的一个原因。对此, 国内外已 有不少学者展开研究。M ne l T、 魏文树、 石端正等 人的诸多研究均证实用 N 乙酞半胱氨酸、 超氧化物 歧化酶、 itam in E 和 v ita in C、 v m 卡维地洛、 , 4 5 6 3 , , 四羟基口山酮 ( 存在于植物中的多酚类化合物 ) 等 抗氧化剂与 NTG 联合 使用, 能 够有效地 改善 NTG 的耐受 。上述研究结果都从治疗方面证实 NTG 耐受过程中伴有氧化应激的增强, 充分说明氧化应 激在耐受形成中的关键作用。 茶多酚和茶黄素分别由绿茶和红茶提取而来, 含有多种单体成分, 并具有很强的抗氧化作用。本 实验中 观 察到 这两 类 茶提 取 物可 以 有 效地 增 强 NTG 对已经产生耐受的血 管的舒张作用。因为在 没有发生 NTG耐受的血管, 茶多酚和茶黄素并没有 改变血管对 NTG 的舒张反应, 表明茶类提取物的确
[ 3- 5] [ 1, 2]

2 2 茶提取物对 NTG耐受的抑制作用 . 度参照
[ 10, 11]

为了观察

茶提取物对 NTG耐受的影响, 用茶多酚、 茶黄素 ( 浓 )分别和 NTG 共同预孵内皮功能完好的 血管, 与耐受组相比结果均使曲线不同程度左移, 即 抑制了 NTG耐受的产生 (图 2 3) , pD2 值显著增加, , TP 孵育组和 TF 孵育组与耐受组相比, 均 P < 0 05 . ; Em ax无显著变化, 与对照组相比均 P > 0 05(表 1)。 .

注: Con trol为对照组, Tolerance为耐受组, 均 n = 6 TP+ To lerance为 ; 茶多酚 40 m g /m l预处理 + 硝酸甘油 30 M 预孵 90 m in, n = 12 。数 据用 x
* SEM 表示。 P < 0 05, To lerance vs TP+ Toleran ce。 .

图 2 绿茶提取物茶多酚 ( TP )对硝酸甘油耐受的影响

262

健 康 研 究
1224 - 30 .

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对 NTG 耐受的产生具有预防或抑制作用。关于其 作用机制可能与抑制氧化应激反应有关。有不少研 究支持了我们的设想。H uang Y 等人对基因敲除的 动物进行观察肯定了茶多酚的抗氧化作用与超氧化 物歧化酶和过氧化氢酶有关
[ 12]

[ 6 ] Leung LK, Su Y, Ch en R, et a l Theaflavins in B lack Tea and Cate . ch in s in G reen Tea A re Equally E ffect ive A n tioxidan ts[ J ]. 2001, 131 2248 - 51. : [ 7] M iller N J C as tel luccio C, T ijburg L, et a l. The an tioxid ant proper , t ies of theaflavin s and their gallate- esters - rad ical scavengers or m etal chelators [ J] . FEBS Lett 1996 392: 40 - 44 ? , , . [ 8] Sung H, N ah J Chun S et al. In vivo an t iox idant ef fect of green tea , , [ J] . Eur J C lin N utr 2000 54 527 - 529 . , : . [ 9] L iu CQ, L eung FP, Lee VW, et al. Prevent ion of n itroglycerin toler an ce in v itro by T0156 a selective phosphod iesterase type 5 inh ib itor , [ J] . Eur J Phar aco,l 2008, 590 250- 254. m : [ 10] Shen JZ, Zheng XF, W ei EQ, et a . G reen tea catech ins evoke a l phas ic con tract ion in rat aorta v ia H 2 O 2 m ed iated m ult ip le signal ling pathw ays[ J] . C lin E xp Phar acol Phys io, 2003, 30 88- 95. m l : [ 11] D haw an A, A nderson D, de Pascual T eresa S, et a l Evaluation of . the an tigenotox ic potent ial of m on om eric and di eric flavanols and m , b lack tea polyphen ols again st heterocyclic am ine - induced DNA dam age in human lymphocytes u sing th e Com et assay[ J] . M u tat R es 2002 515: 39 - 56 , , . [ 12] L i YM , Ch an HY, H uang Y, et a l G reen tea catech in s upregu late . superoxid e d is utase and catalase in fru it flies[ J] . M ol N u tr Food m R es 2007 51 546 - 554 , , : . [ 13] Y ing C J Sun X F, Zhang SL, et al. RO S related enzym e exp res , s ions in endothel ial cells regu lated by tea polyphenols[ J] . B iom ed En viron S c,i 2004 17: 33- 39 , . [ 14] D u ffy S J K ean ey JF Jr H olb rook M, et a l Short and long ter , , . m b lack tea consump tion reverses endoth elial dysfun ct ion in patients w ith coronary artery d isease[ J] . C irculation 2001, 104 151 - 156 , : . [ 15] Persson I Josefsson M, Persson K, et al. Tea flavanols inh ib it A, angioten sin converting enzym e activity and increase n itric oxid e p ro duct ion in hum an endothel ial cells[ J] . J Phar Ph ar aco, 2006 m m l , 58: 1139- 1144. J N u tr ,

。我国学者 Y ing C J

用免疫印迹方法检测蛋白表达, 发现茶提取物不仅 下调了 NADPH 氧化酶 p22phox and p67phox亚基的 表达, 还使过氧化氢酶水平有所提高, 从而使氧化应 激产物减少, 清除增加, 而起到了保护作用
[ 13]



另外, 还有研究表明红茶内的黄酮类物质还有 改 善 内 皮 功 能 的 作 用, 可 以 增 加 e NOS 位 点 ser
1177/1179

的磷酸化, 或者促使 T hr 去磷酸化, 从而
[ 14]

495

增强 eNOS 的活性

。 2006年, Persson I 等人也 A

证明了在人脐静脉内皮细胞无论是茶叶本身还是茶 提取物都可以抑制血管紧张素转换酶的活性, 并且 增加 NO的生成
[ 15]

。所以, 本实验中观察到血管舒

张功能增强, 可能也与改善内皮功能有关。 参考文献:
[ 1] M n zel T, D aiber A, M lsch A. Exp lain ing the phenom enon of n i trate tolerance[ J]. C irc R es 2005, 97: 618- 628. , [ 2] 聂盛丹, 胡长平, 李 元建. 硝酸 甘油耐受 机制研究 进展 [ J] . 中国 动脉硬化杂志, 2005 13: 796- 798. , [ 3] 魏文树, 孟晓波, 魏炜明, 等. 硝酸甘油耐 受机制的探讨与 卡维地 洛的预防作用 [ J] . 福建医药杂志, 2003 25 1 - 4. , : [ 4 ] 石瑞正, 张国刚, 柏勇平, 等. 硝酸甘油耐受与氧化应激和 3, 4, 5, 6 四羟基口山酮的治疗作用 [ J] . 中南 大学学报 ( 医学版 ) , 2006, 31 650- 654. : [ 5 ] M n zel T, H ink U, Y igit H, e t al. R ole of sup erox ide d is utase in m in vivo and in v itro n itrate toleran ce[ J] . Br J Phar aco, 1999 127: m l ,


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