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Gateway 技术

Gateway 技术
Gateway 技术提供以下可能: 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间,同 时将您的基因转移到多个表达系统,在任何您选择的系统――体外,细菌,酵母, 昆虫,或哺乳动物――分析表达

一、一种更好的克隆方法
Gateway 技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统(图 1)。 这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤,而同时典型的 克 隆效率高达 95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时,还可以 保证正确的方向和阅读框。Gateway 也有助于进行带不同数目纯化和检测 标签 蛋白的表达。 图 1 Gateway 技术的灵活性

目的基因克隆进入门载体后,可以同时转移目的基因到多个目的载体。 Gateway 利用了位点特异重组,所以在构建入门载体后,不再需要使用限制 性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆,就可以多次使用它,转移您的 目的基因到 Gateway 改造过的各种表达载体(目的载体)。 此外,由于在重组时 DNA 片段的阅读框和方向保持不变,因而您不必再为新 的表达克隆测序担心。在使用每一种新的表达系统时,将会节省您更多的时间。

二、一项强大而可靠的技术

Gateway 技术是克隆和亚克隆 DNA 序列的一项新颖的通用系统,便于功能基 因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统,DNA 片段可以通过 位点特异的重组在载体之间转移。 Gateway 技术是基于已研究的非常清楚的 λ 噬菌体位点特异重组系统 (attB x attP →attL x attR)。BP 和 LR 两个反应就构成了 Gateway 技术(表 1 和图 2)。BP 反应是利用一个 attB DNA 片段或表达克隆和一个 attP 供体载体之间的 重组反应,创建一个入门克隆。LR 反应是一个 attL 入门克隆和一个 attR 目的 载体之间的重组反应。 LR 反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多 个目的载体。 表 1 反应和术语总结 反 应 BP 反应 LR 反应 反应位点 attB×attP attL×attR 产 物 入门克隆 表达克隆 产物结构 attL1-基因-attL2 attB1-基因-attB2

图 2 Gateway 技术总结

在 BP 反应中基因转移形成入门克隆,在 LR 反应中入门克隆可以作为反应物 产生最终的表达克隆。 完成构建 Gateway 表达克隆仅需两步(图 2): (1)创建入门克隆,通过 PCR 或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载 体。 (2)混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及 Gateway LR Clonase 酶,构建表达克隆。(表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和 分析。) 有几种方法可以构建 Gateway 入门克隆。无论您选择何种方法,创建的入门 克隆都是准备用来与各种目的载体进行重组。 (1)PCR 克隆(定向 TOPO 克隆至入门载体或与供载体 B×P 重组) (2)限制性内切酶消化和连接进入入门载体 (3)使用 pCMV?SPORT6 或 pEXP-AD502*构建 Gateway 兼容 cDNA 文库 (4)Gateway 改造过的克隆资源* * 这些克隆资源和 cDNA 文库两边加有 attB 位点。这些克隆可以通过与供载 体及 BP Gateway 酶反应转换到入门载体。获得已有克隆资源的更多信息。

三、PCR 定向(PCR-Directional)TOPO 克隆

定向 TOPO 克隆使得克隆 PCR 产物和其它的 DNA 分子更加快速和有效。 进行 5 分钟的简单连接, 产生>90%的重组子。您不仅会比用连接酶介导的方法更快的获 得克隆,而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。 定向 TOPO 克隆提供高效的一步法克隆策略,可以定向克隆平端 PCR 产物到 入门载体。平端 PCR 产物定向克隆的效率>90%,从而简化了筛选。同时不再需要 连接酶、PCR 后续步骤或者限制性内切酶。 目前有两种定向 TOPO 克隆载体。pENTR/D-TOPO 和 pENTR/SD/ D-TOPO(表 2 和图 3)有以下特点: 位于 PCR 产物插入位点两侧的 attL 重组位点可以与 Gateway 目的载体进 行有效重组 通用 M13 位点便于测序 基于 pUC 的 ori 位点提供高产量质粒 大肠杆菌中卡那霉素(kanamycin)抗性基因筛选 表 2 两种 pENTR/D-TOPO 载体的简单比较 入门载体 pENTR/D-TOPO pENTR/SD/ D-TOPO 特 点 优 点 真核细胞中天然、N-或 C-端融合;大肠杆菌 无 SD 中 N-端融合; 如果基因包含有 SD 序列, 可在 (Shine-Dalgarno) 位点 大肠杆菌中进行 C-端或天然蛋白表达 含 SD 包含基因 10 和一个 SD 序列,可以有效的启 (Shine-Dalgarno) 位点 动天然蛋白和融合蛋白在大肠杆菌中的表达 图 3 Gateway 定向 TOPO 克隆

四、构建入门载体的各种选择
1、限制性内切酶消化 作为 PCR 克隆的替代方法,有 5 种 Gateway 入门载体可以使用传统的限制酶 切和连接的方法 产生入门克隆。这些载体配合合适的目的载体,可以用于表达 天然蛋白或带有 N 端或 C 端融合标签的重组蛋白。 为了在真核细胞中有效地翻译 蛋白,所有的 5 个 Gateway 入门载体提供了 Kozak 序列。此外,pENTR11 提供 了 SD (Shine-Dalgarno)序列,便于在大肠杆菌中有效的翻译。 2、PCR 重组克隆 重组是从 PCR 产物创建 Gateway 入门克隆的另一种方法。这种方法是通过合 并 attB 位点 到上游和下游引物上, 然后共同孵育 PCR 扩增产物和 pDONR 载体 (包 含 attP 位点)以及 Gateway BP Clonase 酶混合物。接着转化进大肠杆菌中,您 将会获得包含目的基因的入门克隆,同时目的基因两侧具有 attL 重组位点。这 个入门克隆可以与任何 Gateway 目的载体进行重组(参看图 2)。 3、Gateway 改造过的 cDNA 文库 如果您已经有了用 Gateway 兼容载体构建的 cDNA 文库, 您就可以通过 pDONR 载体和 BP Clonase 酶混合物进行一个简单的重组反应,很容易地把单个克隆转 换成 Gateway 入门克隆。 这样就不再需要亚克隆和测序, 为您节约数小时的时间。 SuperScript cDNA 文库使用 pCMVSPORT 构建,有几种人组织来源可供选择, 这些文库有很大一部分是全长的插入片段,可以完全代表来源 mRNA。 4、入门克隆的切入点——克隆资源 您可以从与 10000 个人类基因相关的 35000 个克隆中进行选择,这些克隆的 70%以上是全 长序列的。这些克隆来源于使用特殊的高级 cDNA 文库构建技术、 oligo dT 引物以及 SuperScript II 反转录酶所构建的文库。许多克隆来源于 I.M.A.G.E.协会,NCI CGAP 项目,ResGen 库或 UltimateORF 库。 克隆资源因为已克隆到 Gateway 改造过的载体,所以可以快速地将基因转到 各种表达系统中。 图 4 进入 Gateway 系统的各种路线

* 目前的克隆资源带有 attB 位点,需要与 pDONR 质粒重组

五、触手可及的最高级表达系统
一旦您构建好 Gateway 入门克隆,蛋白表达和分析的大门就会向您敞开。使 用 Gateway 技术, 您可以进入到几乎是无数种的表达系统。因为没有一个单一的 表达系统蛋白适合于每一种蛋白, 优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析 您的蛋白(图 5)。 图 5 在 Gateway 系统表达全长开放阅读框

大肠杆菌 GUS 基因、人类 MAP4 和 Eif-4E 基因平行转移进目的载体,在 Sf9 昆虫细胞 (杆状病毒)或大肠杆菌 BL21-SI 菌株表达天然蛋白、N-端 His 或 N端 GST 融合蛋白。 在所有的系统中均观察到 GUS 良好的表达,而 MAP4 只在 昆虫 细胞中表达,Eif-4E 只在大肠杆菌中表达。在 Hartley, J.L.et al. (2000) Genome Research 10(11):1788-95 可以找到更多的细节。 为了扩展表达的选择,Invitrogen 已将 Gateway 技术合并到部分最高级的 表达系统中。 无论您选择哪个系统――体外, 细菌, 酵母, 昆虫, 或哺乳动物―― 都可以获得 Gateway 目的载 体。此外,你可以很容易地把您自己最称手的表达 载体转换成 Gateway 目的载体。