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月季花药培养讲课tian


花的结构

雌蕊 的结构

植物的花药培养在育种上有什么意义?

花粉粒(1N) 缩短了育种周期
后代为纯合子 单倍体植株 (1N) 二倍体纯合子 植株(2N)

花 粉 粒

一、基础知识
(一)被子植物的花粉发育 花丝

1、雄蕊

花药:囊状结构,内有很多花粉
减数分裂

2、由花粉母细胞(即小孢子母细胞)



粉,

即:单倍体的生殖细胞。

3、阶段:四分体时期、单核期、双核期

4、过程:
减数 分裂 有丝 分裂

4、过程:
1花粉母细 胞(2n)

减分

即4个单倍体细胞

4个小孢子(小孢子四分体) ( n)

有分
单核居中期(n) 单核靠边期(n)

1个花粉管细胞核(n) 1个生殖细胞核(n)

有分

2个精子

说明:
1、二核花粉粒:有些成熟的花粉粒中,只含花粉管细胞 核和生殖细胞核。(精子在花粉管萌发时形成,最终也有 三个细胞核)

2、三核花粉粒:有些植物的花粉,在成熟前,生殖细胞 进行一次有丝分裂,形成两个精子,这样的花粉在成熟时, 含有一个营养核和两个精子。(两个精子和一个营养核的 基因型相同。) 4个花粉管细胞核 减数分裂 4个小 有丝分裂 1 个花粉 3、 母细胞 孢子 4个生殖细胞核
有丝分裂

8个精子

4、减数分裂中四分体:联会后一对同源染色 体中含有 四个染色单体。 小孢子细胞四分体期:花粉母细胞经减数 分裂形成的4个连在一起的单倍体细胞

(二)、产生花粉植株的两种途径
花粉 脱分化 胚状体 分化

丛芽 花粉 脱分化 愈伤组织 再分化

诱导

生根

移栽

说明:两种途径之间并没有绝对的界限, 主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。

为什么把胚状体到丛芽的 过程称 为分化,而把从愈伤组织到丛芽的 过程成为再分化?P38
胚状体的结构及其发育过程与种子相似, 所以把胚状体到丛芽的过程称为分化,而 把从愈伤组织到丛芽的过程称为再分化

胚状体发育途径

烟草花药培养

部分花药通过胚状体途径形成小植株

愈伤组织发育途径 水稻花药培养

接种在平板上的水稻花药

部分花药产生愈伤组织

愈伤组织转接种到再生(分化)培养基

愈伤组织分化形成再生植株

体细胞胚(胚状体): 在组织培养过程中,某些体细胞在 形态上转变为与合子发育成的胚非常相 似的结构,发育过程亦与合子胚类似, 被称为体细胞胚(胚状体)。

(三)影响花药培养的因素
1、材料的选择: ⑴不同种类植物的诱导成功率不同。 五月初至中旬 ⑵同一种植物,亲本植株的生理状况对诱导成功率 有直接影响。花期早期-初花期 (3)选择最合适的花粉发育时期 单核靠边期 ①不选择单核期之前花药原因:花药质地幼嫩,容 易破碎; ②不选择单核期之后花药原因:花瓣开始松动,给 材料消毒带来困难; ③挑选单核期花药方法:应当选择完全未开放的花 蕾,菌少,易消毒。

为什么花瓣松动会给材料的 消毒带来困难? 答:花瓣松动后,微生物就 可能侵入到花药,给材料 的消毒带来困难。

2、培养基的组成 花药培养所采用的培养基各成分中植物生长调节剂的 水平和配比起决定作用。 ⑴诱导愈伤组织或胚状体产生的培养基:广泛使用 2, 4-D、IAA和KT; ⑵诱导分化的培养基常除去2,4-D而以IBA或BA等代 之。 3、其他因素: 亲本植株的生长条件、材料的低温预处理、接种密度、 培养的环境条件等对诱导的成功率都有一定的影响。 据报道,低温(4 ℃ )预处理一定时间(如48小时) 可以明显促进胚状体的形成;有的经短期高温 (30~40 ℃ )处理也能够促进胚状体的形成,但是 不同作物对所需的最适处理温度和时间要求不同。

二、实验操作

材料选取

材料和 消毒

接种和 培养

(一)材料选取
1、从花药看:月季的初花期 从花粉看:单核期靠边期 从花蕾看:未完全开放的

2、通过镜检来确定是否处于适宜的发育期。 最常用的方法:醋酸洋红法 某些植物的花粉细胞核不易着色:焙花青-铬矾 法,花粉细胞核染成蓝黑色。

鉴定花粉: ①最常用的方法是醋酸洋红法: 花药(载玻片上)→1%的醋酸洋红1滴→用镊柄将花 药捣碎,盖上盖玻片→镜检(花粉粒的细胞核被染成 红色) ②某些植物的花粉细胞核不易着色,需要采用焙花 青—铬钒法: 花药(在卡诺氏固定液中处理20min)→取出,置于 载玻片上→焙花青-铬钒溶液染色→盖上盖玻片→镜 检(花粉粒的细胞核被染成蓝黑色)
?注:花粉细胞核内有染色体,染色体主要由DNA和蛋白质组成, 醋酸洋红为碱性染色剂,染色体容易被染色。通过染色,可以 确定细胞核为单核期还是双核期,是单核居中期还是单核靠边 期。一般单核靠边期的花药培养成功率最高。

(二)、材料的消毒:
花 蕾 (70% 酒精) 大约 30s (无菌 水) 清洗
(无菌吸

水纸)吸 干水分

(1%氯化 汞溶液) 2~4min

(无菌 水) 冲洗

提示: 用于培养花药的花蕾,实际上多数未 熟,由于它的外面有花萼、花瓣保护,通常处于 无菌状态,所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。 月季花蕾的消毒与菊花外植体的消毒相比 较,二者有何不同?

在酒精消毒前,花药不需要预先用流水冲洗、 洗衣粉洗涤和软刷刷洗

(三)接种和培养 灭菌后花蕾,要在无菌条件下除去萼片 和花瓣,并立即将花药接种到培养基上。 在剥离花药时,要尽量不损伤花药(否则 接种后,容易从受伤部位产生二倍体的愈伤 组织),同时还要彻底去除花丝,因为与花 丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形 成。

每瓶接种花药7-10个,温度控制在25℃ 左右,不需要光照。幼小植株形成后才需要 光照。

经过20-30天培养后,会发现花药开裂, 长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织 及时转移到分化培养基上,以便进一步分化 出再生植株。
如果花药开裂释放出胚状体,则一个花 药内就会产生大量幼小植株,必须在花药开 裂后尽快将幼小植株分开,分别移植到新的 培养基上,否则这些植株将很难分开。

花药培养至开裂后,将释放出的胚 状体整体转移至分化培养基,培养一段 时间后再移至新的培养基上继续培养。

对培养出来的植株做进一步的鉴定和筛 选。因为在花药培养中,特别是通过愈 伤组织形成的花粉植株,常常会出现染 色体倍性的变化(主要是营养细胞的细 胞核和生殖细胞的细胞核融合造成的)。

三、 结果分析与评价
1、选材是否恰当
选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会通 过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。

2、无菌技术是否过关
如果出现了污染现象,说明某些操作步骤,如培 养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。

3、接种是否成功
如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体, 花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基, 以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。

作业2

植物组织培养技术与花药培养技术的 相同之处是:培养基配制方法、无菌技术 及接种操作等基本相同。 不同之处在于:花药培养的选材非常重要, 需事先摸索时期适宜的花蕾;花药裂开后 释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换 培养基;花药培养对培养基配方的要求更 为严格。这些都使花药培养的难度大为增 加。

? 1、关于被子植物花粉发育的说法,不正确的是 ( BD) ? A、花粉粒是在花药中的花粉囊里形成的 ? B、被子植物精子的形成是直接减数分裂的结果 ? C、被子植物的花粉的发育要经历四分体时期、 单核期、双核期等阶段 ? D、花粉粒在发育过程中,核先位于细胞一侧, 再移到细胞中央

2、月季花药培养时的花粉粒最好是(C)

A、四分体时期
C、单核靠边期

B、单核居中期
D、二核或三核花粉粒

3、基因型为AaBb的水稻(24条染色体)的花药通 过无菌操作,接入试管后,在一定条件下培养成试管 苗。 (1)愈伤组织是花粉细胞分裂形成的不规则的细胞 无机盐) 团,愈伤组织必须从培养基中获得(水 )、( 和小分子有机物等营养物质。 (2)要促进花粉细胞的分裂分化,培养基中应有 ( 生长素)( 细胞分裂素 )两种激素。 愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根,由芽发育成 叶茎。这一过程必须给予光照,其原因是( 叶绿体 ) 利用光能制造有机物促进试管苗生长发育。 (3)试管苗的细胞核中有( 24 )条脱氧核苷酸 链。试管苗的基因型有: AB Ab aB ab

4.(9分)草莓生产上传统的繁殖方式易将所感染的病 毒传播给后代,导致产量降低。品质变差。运用微型繁殖 技术可以培育出无病毒幼苗。草 莓微型繁殖的基本过程 如下:外植体 愈伤组织 芽、根 植株 ② ① 请回答: (1)微型繁殖培育无病毒草莓苗时,一般选取 茎尖、根尖 茎尖、根尖不含病毒 _________ 作为外植体,其依据是 _ ___ 。 (2)在过程①中,常用的MS培养基主要成分包括大量 有机物 ,在配制好的培养基中,常常 元素、微量元素和______ 植物激素 ,有利于外植体启动细胞分裂形成愈 需要添加________ 伤组织。接种后2~5d,若发现外植体边缘局部污染,原 外植体消毒不彻底 因可能是__________ 。 (3)在过程②中,愈伤组织在诱导生根的培养基中未形 培养基中生长素类。 成根,但分化出了芽,其原因可能是_____________ 物质和细胞分裂素类物质用量的比值偏低

P40 如果利用花药培养的技术, 在F1代产生的花粉中就可能有Asu
的组合,再将花粉植株进行染色体

加倍,就可以直接得到紫色甜玉米
的纯合子(AAsusu)。这种方法可 以大大缩短育种周期。

P40植物组织培养技术与花药培养技术的异同点
项目 相同点 不同点

植物组织培养 离体的植物 技术 组织经脱分

外植体为体细胞, 染色体数无需加倍。
取材为花药,培养的为 单倍体幼苗,植株弱小, 高度不育,必须用秋水 仙素处理,使染色体加 倍,恢复正常植株的染 色体数,而且为纯种。

化形成愈伤 花药培养技术 组织,再分 化成丛芽, 诱导出根, 然后进行移 栽。

4、植物组织培养的应用: (1)、培育无病毒植株 (2)、培养紫草愈伤组织,提取紫草素(治疗烫 伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料) (3)、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能 力的胚状结构,包裹上人造种皮,制成人工种 子,可以解决有些作物品种繁殖能力差,结子 困难或发芽率低等问题.(用胚状体包上人造种 皮得到人工种子) (4)、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法 (受体细胞为植物细胞)

人工种子


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