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高中生物奥林匹克竞赛辅导专题讲座 专题九 DNA技术与人类基因组


高中生物奥林匹克竞赛辅导专题讲座 专题九 DNA 技术与人类 基因组
【竞赛要求】 竞赛要求】
1. DNA 操作的工具 2. 质粒是基因的载体 3. 内切酶与连接酶 4. 基因克隆 5. 反转录 6. DNA 探针 7. PCR 技术 8. 人类基因组 9. DNA 技术的应用 10.DNA 技术带来的危害与伦理问题

【知识梳理】 知识梳理】
一、基因工程概述 基因工程:是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于本世纪 70 年代诞生的一 门崭新的生物技术科学。一般来说,基因工程是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方 法将所需要的某一供体生物的遗传物质--DNA 大分子提取出来,在离体条件下用适当的工 具酶进行切割后,把它与作为载体的 DNA 分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生 长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中"安家落户",进行正常复制和表达,从而 获得新物种的一种崭新的育种技术。 这个定义表明,基因工程具有以下几个重要特征:首先,外源核酸分子在不同的寄主生 物中进行繁殖,能够跨越天然物种屏障,把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中,而 这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系, 这种能力是基因工程的第一个重要特征。 第二个特 征是,一种确定的 DNA 小片段在新的寄主细胞中进行扩增,这样实现很少量 DNA 样品"拷 贝"出大量的 DNA,而且是大量没有污染任何其它 DNA 序列的、绝对纯净的 DNA 分子群 体。 二、细胞是 DNA 操作必不可少的工具 (一)质粒是基因的载体 基因载体或称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源 DNA、实现外源 DNA 的无性繁 殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些 DNA 分子。其中,为使插入的外源 DNA 序列可转 录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆载体的 DNA 分子有质 粒 DNA、噬菌体 DNA 和病毒 DNA。 细菌质粒是独立于细菌拟核中 DNA 分子的自主复制的环状双链 DNA 分子, 是基因工 程最常用的运载体。最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。大肠杆菌的质粒中常含有抗药基因, 如抗四环素的标记基因。细菌质粒的大小只有普通细菌拟核 DNA 的百分之一左右。质粒能 够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说,质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定

性的作用。但是,质粒的复制则只能在宿主细胞内完成。土壤农杆菌的质粒常用于培育转基 因植物。 (二)工具酶 1.限制性内切酶:识别特异序列,切割 DNA 2.DNA 连接酶:催化 DNA 中相邻的 5′磷酸基与 3′羟基间形成磷酸二酯键,使 DNA 切口 封合,连接 DNA 片段 3.DNA 聚合酶Ⅰ: (1)合成双链 cDNA 中第二条链? (2)缺口平移制做探针? (3)DNA 序列分析? (4)填补 3′末端 4.Taq 酶 : 催化 PCR 反应,聚合 DNA 5.反转录酶: a.合成 cDNA。b.替代 DNA 聚合酶Ⅰ进行填补,标记或 DNA 序列分析 6.多聚核苷酸激酶: 催化 DNA 5′羟基末端磷酸化,或标记探针 7.碱性磷酸酶: 切除 DNA5′末端磷酸基 8.末端转移酶: 在 3′羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾 9.DNA 酶: 切割 DNA 10.RNA 酶: 切割 RNA 在所有工具酶中, 限制性核酸内切酶具有特别重要的意义。 所谓限制性核酸内切酶就是 识别 DNA 的特异序列, 并在识别点或其周围切割双链 DNA 的一类内切酶。 根据酶的组成, 所需因子及裂解 DNA 方式的不同,可将限制性核酸内切酶分为三类。重组 DNA 技术中常 用的限制性核酸内切酶为Ⅱ类酶,大部分Ⅱ类酶识别 DNA 位点的核苷酸序列呈二元旋转对 称,通常称这种特殊的结构顺序为回文结构。 下面小结限制性内切酶
Ⅰ类 Ⅱ类 Ⅲ类 需 Mg 2+、SAM 及 ATP 仅需 Mg
2+ 2+

识别位点复杂,特异性差,切割位点距识别点远。 识别切割特异性强,切割发生在识别位点。 切割位点在识别位点周围,酶活性不单一。

需 Mg 及 ATP

(三)基因克隆 1.概念:DNA 克隆就是应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质与载体 DNA 结合 成一具有自我复制能力的 DNA 分子——复制子,继而通过转化或转染宿主细胞、筛选 出含有目的基因转化子细胞,再进行扩增、提取获得大量同一 DNA 分子,即 DNA 克 隆又称重组 DNA。 2.重组 DNA 的基本原理 一个完整的 DNA 克隆过程应包括:①目的基因的获取,②基因载体的选择与构建,③ 目的基因与载体的拼接,④重组 DNA 分子导入受体细胞,⑤筛选并无性繁殖含重组分子的 受体细胞(转化子)。 (1)目的基因的获取 目前获取目的基因大致有如下几种途径或来源。 a.化学合成法:如果已知某基因的核苷酸序列,或根据某种基因产物的氨基酸序列推 导出该多肽编码基因的核苷酸序列,再利用 DNA 合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 b.基因组 DNA:采用物理方法(剪切或超声波)或限制性内切酶将染色体 DNA 切割成 许多片段,然后将它们与适当克隆载体结合,将重组 DNA 转入受体菌中扩增,每个细菌内 都携带一种重组 DNA 分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体 DNA 片段就涵盖了 基因组全部信息,即基因文库。建立基因文库后,结合适当筛选方法从众多的转化子菌株中

选出含某一基因的菌株,扩增分离得到目的基因。 c. cDNA:以 mRNA 为模板,利用反转录酶合成与 mRNA 互补的 DNA,再复制成双 链 cDNA 片段,与适当载体连接后转入受体菌,扩增为 cDNA 文库。用适当方法 cDNA 文 库中就可以筛选分离到目的基因。 d.聚合酶链反应:在有模板 DNA、引物及 dNTP 存在时,向 DNA 合成体系中引入热 稳定的 Taq DNA 聚合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环自动。反复进行感兴趣 DNA 片段的酶促合成,使目的基因按指数增长。 (2)克隆载体的选择与改建 a.质粒:存在于细菌染色体外,小型闭合环状双链 DNA 分子,可独立自主进行复制, 含筛选标记,含多种限制性内切酶的单一切割位点,可插入目的基因。 b.噬菌体:eg λ噬菌体、MB 载体 c.柯斯质粒与酵母人工染色体载体:用于插入大 DNA 片段。 d.病毒载体。 (3)外源基因与载体的连接 即 DNA 的体外重组。这种 DNA 重组是靠 DNA 酶将外源 DNA 与载体共价连接的。 a.粘性末端连接 Ⅰ.同一限制酶切割位点连接 由同一限制性核酸内切酶切割的不同 DNA 片段具有完全 相同的末端。那么,当这样的两个 DNA 片段一起退火时,粘性末端单链间进行碱基配对, 然后在 DNA 连接酶催化作用下形成共价结合的重组 DNA 分子。 Ⅱ.不同限制酶切割位点连接 由两种不同的限制性核酸内切酶切割的 DNA 片段,具有 相同类型的粘性末端,即配对末端,也可以进行粘性不同末端连接。 b.平端连接 c.同聚物加尾连接 同聚物加连接是利用同聚物序列,如多聚 A 与多聚 T 之间的退火作用完成连接。在末 端转移酶作用下,在 DNA 片段制造出粘性末端,而后进行粘性末端连接。 d.人工接头连接 (4)重组 DNA 导入受体细胞 根据重组 DNA 时所采用的载体性质不同,导入重组 DNA 分子有转化、转染和感染等 不同手段。 a.感受态细胞。经一定方法处理(如 CaCl 2 处理)后具备接受外界 DNA 能力的大肠杆菌。 受体菌应为安全无毒菌株,且为限制酶缺陷型及重组缺陷型。 b.转化、转染及感染。本定义不涉及真核细胞,只针对大肠杆菌。 转化:以质粒为载体,将携带外源基因的载体 DNA 导入受体细胞。 转染:以噬菌体为载体,用 DNA 连接酶使噬菌体 DNA 环化,再通过质粒转化方式导 入受体菌。 感染:以噬菌体为载体,在体外将噬菌体 DNA 包装成病毒颗粒,使其感染受体菌。 (5)重组体的筛选 a.直接选择法 直接法是针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法, 其特点是直 接测定基因表型。 Ⅰ.抗药性标志选择:如果克隆载体携带有某种抗药性标志基因,则只有含这种抗药基 因的转化子细菌才能在含该抗菌药物的培养板上幸存并形成菌落。 Ⅱ.标志补救:若克隆的基因能够在宿主菌表达,且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补, 那么就可以利用营养突变菌株进行筛选,这就是标志补救筛选。

Ⅲ.分子杂交法 b.免疫学方法 应用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选,属非直接选择法。特异性强、灵 敏度高,适用于选择不为宿主菌提供任何标志的基因。 (6)克隆基因的表达 a.原核表达体系 大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系, 运用大肠杆菌表达载体符合下述标准: ①含 大肠杆菌适宜的选择标志②具有能调控转录、产生大量 mRNA 的强启动子③含适当的翻译 控制序列和翻译起始点等④含有合理设计的多接头克隆位点, 以确保目的基因按一定方向与 载体正确衔接表达产物的分离、纯化。 大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处: ①由于缺乏转录后加工机制, 只能表达克隆的 cDNA,不宜表达真核基因组 DNA;②由于缺乏适当的翻译后加工机制,表达的真核蛋白质 不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰; ③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体, 欲使其 具有活性尚需进行复杂的复性处理;④很难表达大量的可溶性蛋白。 b.真核表达体系 与原核表达体系比较,真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较 大优势性。尤其是哺乳类动物细胞,不仅可表达真核的 cDNA,而且还可表达真核基因组 DNA;将表达载体导入真核细胞的过程称转染,常用于细胞转染的方法有:磷酸钙转染、 DEAE 葡聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。 三.DNA 操作技术的其他工具 (一)反转录 1970 年 Temin 等在致癌 RNA 病毒中发现了一种特殊的 DNA 聚合酶,该酶以 RNA 为 核板,根据碱基配对原则,按照 RNA 的核苷酸顺序(其中 V 与 A 配对)合成 DNA。这一过 程与一般遗传信息流转录的方向相反,故称为反转录,催化此过程的 DNA 聚合酶叫做反转 录酶。后来发现反转录酶不仅普遍存在于 RNA 病毒中,哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的 淋巴细胞中也有反转录酶。 反转录酶的作用是以 dNTP 为底物,以 RNA 为模板,tRNA(主要是色氨酸 tRNA)为引 物,在 tRNA3′桹 H 末端上,按 5′→3′方向,合成一条与 RNA 模板互补的 DNA 单链,这条 DNA 单链叫做互补 DNA(complementary DNA, cDNA), 它与 RNA 模板形成 RNA 桪 NA 杂 交体。随后又在反转录酶的作用下,水解掉 RNA 链,再以 cDNA 为模板合成第二条 DNA 链。至此,完成由 RNA 指导的 DNA 合成过程(如下图)。

携带反转录酶的病毒又称为反转录病毒,它侵入宿主细胞后先以病毒 RNA 为模板靠反

转录酶催化合成 DNA,随后这种 DNA 环化并整合到宿主细胞的染色体 DNA 中去,以原病 毒的形式在宿主细胞中一代代传递下去。以后又发现许多反转录病毒基因组中都含有癌基 因,如果由于某种因素激活了癌基因就可使宿主细胞转化为癌细胞。 大多数反转录酶都具有多种酶活性,主要包括以下几种活性: ① DNA 聚合酶活性;以 RNA 为模板,催化 dNTP 聚合成 DNA 的过程。此酶需要 RNA 为 引物,多为色氨酸的 tRNA,在引物 tRNA3′-末端以 5′→3′方向合成 DNA。反转录酶中 不具有 3′→5′外切酶活性,因此没有校正功能,所以由反转录酶催化合成的 DNA 出错 率比较高。 ② RNase H 活性;由反转录酶催化合成的 cDNA 与模板 RNA 形成的杂交分子,将由 RNa se H 从 RNA5′端水解掉 RNA 分子。 ③ DNA 指导的 DNA 聚合酶活性;以反转录合成的第一条 DNA 单链为模板,以 dNTP 为 底物,再合成第二条 DNA 分子。除此之外,有些反转录酶还有 DNA 内切酶活性,这可 能与病毒基因整合到宿主细胞染色体 DNA 中有关。反转录酶的发现对于遗传工程技术 起了很大的推动作用,目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取 mRNA 并以 它为模板,在反转录酶的作用下,合成出互补的 DNA(cDNA),由此可构建出 cDNA 文 库(cDNA library),从中筛选特异的目的基因,这是在基因工程技术中最常用的获得目 的基因的方法。 (二)DNA 探针 DNA 探针技术又称分子杂交技术,是利用 DNA 分子的变性、复性以及碱基互补配 对的高度精确性,对某一特异性 DNA 序列进行探查的新技术。DNA 探针是利用同位素、 生物素等标记的特定 DNA 片断,该片断可大至寄生虫基因组 DNA,小至 20 个碱基。当 D NA 探针与待测的非标记单链 DNA(或 RNA)按碱基顺序互补结合时,以氢健将 2 条单链 连接而形成标记 DNA-DNA(或标记 DNA-RNA)的双链杂交分子。将未配对结合的核苷酸 溶解后用检测系统(放射自显影或酶检测等)检测杂交反应结果。由于 DNA 分子碱基互补 的精确性,单连 DNA 探针仅与样品中变性处理的 DNA 单链出现配对杂交,由此决定了探 针的特异性;用放射性同位素(如 32P)或生物素标记探针,使杂交试验同时具有高度的敏 感性。 相关内容 相关内容:
所谓杂交指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体,杂交体中 的分子不是来自一个二聚体分子。同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。利用两条不 同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。与核酸杂交技术相对应的另一项 技术被称为探针技术,它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术,我们 把标记的分子叫探针。将探针技术与分子杂交技术相结合,从而使分子杂交技术得以广泛推广应用。目前 所用的核酸杂交技术均应用了标记技术。 DNA 探针是最常用的核酸探针,指长度在几百碱基对以上的双链 DNA 或单链 DNA 探针。现已获的 DNA 探针种类很多,有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞 DNA 探针,这类探针多为某一基因的 全部或部分序列,或某一非编码序列。这些 DNA 片段须是特异的,如细菌的毒力因子基因探针和人类 AL U 探针,这些 DNA 探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例,目前分子杂交技术用于细 菌的分类和菌种鉴定比用 G+C 百分比值要准确的多,是细菌分类学的一个发展方向,加之分子杂交技术的 高度敏感性,分子杂交在临床性病病原体诊断上具有广泛的前景。 DNA 探针(包括 cDNA 探针)有三大优点:第一,这类探针多克隆在质粒载体中,可以无限繁殖, 取之不尽,制备方法简便。其次,DNA 探针不易降解(相对 RNA 而言),一般能有效抑制 DNA 酶活性。 第三,DNA 探针的标记方法较成熟,有多种方法可供选择,如缺口平移法、随机引物法、PCR 标记法等, 能用于同位素和非同位素标记。

(三)PCR 技术

类似于 DNA 的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成: ①模板 DNA 的变性:模板 DNA 经加热至 93℃左右一定时间后,使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备。 ②模板 DNA 与引物的退火(复性):模板 DNA 经加热变性成单链后,温度降至 55℃左右, 引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。 ③引物的延伸:DNA 模板--引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下,以 dNTP 为反应原 料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板 DNA 链互补的半 保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种 新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2~4 分钟, 2~3 小时就能将待扩目的 基因扩增放大几百万倍。 四.人类基因组计划 HGP(Human Genome Project)是了解人类自身奥秘的计划, 1985 年,美国能源部(DOE) 率先提出,旨在阐明人类基因组 DNA 长达 3×109 碱基对( base pair,bp)的序列。发现所 有人类基因并阐明其在染色体上的位置,从而在整体上破译人类遗传信息。1986 年美国宣 布启动"人类基因组启动计划";1989 年,美国国家卫生研究院(NIH)建立国家人类基因组 研究中心 (NCHGR) 1990 年, ; NIH 和 DOE 联合提出美国人类基因组计划, 正式启动 HGP, 计划于 15 年内提供 30 亿美元的资助。 人类基因组计划主要内容包括绘制人类基因组的 4 张图,即遗传(连锁)图、物理图、 DNA 序列图和转录图。 (1)遗传图 遗传图是指基因或 DNA 标记(如多肽性遗传标记)在染色体上以遗传距离表 示相对位置的图,又称为连锁图。遗传距离通常以基因或 DNA 片段在染色体交换过程中分 离的频率厘摩(cM)来表示。cM 值越高,表明两点之间距离越远;cM 值越低,表明两点间 距离越近。通过遗传图可以大致了解各个基因或 DNA 片段之间的相对距离与方向。遗传距 离是通过遗传连锁分析获得的,使用的 DNA 标记越多,越密集,所得到的遗传连锁图的分 辨率就越高。目前人类基因组遗传图的分辨率为 6cM。遗传图不仅是现阶段定位基因的重 要手段,即使在人类基因组物理图建立起来之后,它依然是研究人类基因组遗〖〗传与变异 的重要手段。这方面研究的下一个目标就是建立分辨率更高的遗传图。 (2)物理图 物理图指表示 DNA 序列上 DNA 标记之间实际距离的图。通常由 DNA 的 限制酶片段或克隆的 DNA 片段有序排列而成。标记之间的物理距离以 DNA 上核苷酸数目 的多少(kb,表示千碱基对,或 Mb, 1 Mb=1 000 kb)来表示。物理图是进行 DNA 序列分析 和基因组织结构研究的基础。限制酶物理图是基因组结构的重要特征,例如,每一个基因都 有其特定的限制酶,每一条染色体,每一个个体的基因组,甚至每一个物种的基因组,都有 其特异的限制酶物理图。 物理图反映了 DNA 标记之间的实际距离, 而遗传图则反映 DNA 标记之间的连锁关系。 在 DNA 交换频繁的区域,两个物理距离位置相距较近的基因或 DNA 片段,可能具有较大 的遗传距离,而两个物理距离位置相距较远的基因或 DNA 片段,则可能因该部位在遗传过 程中很少发生交换而具有很近的遗传距离。 (3)序列图 序列图是指整个人类基因组的核苷酸序列图,也是最详尽的物理图。测定 的总长度约为 1 m。 30 亿个核苷酸对组成的序列图就是人类基因组计划原定 2005 年要完 由 成的任务。 2000 年 6 月, 国科学家已向全世界宣布“人类基因组草图”的绘制工作已经完成。 6 (4)转录图 在整个人类基因组中,只有 1%~5%的 DNA 序列为编码序列。在人体某一 特定组织的细胞中,一般只有 10%的基因是表达的。如果能把某段 DNA 序列相应的 mRNA

确定下来,就抓住了基因的主要部分,即可转录部分。所以,一张人类基因组的转录图(也 称 cDNA 图或表达序列图)才是人类基因图的雏形 1999 年,作为惟一的发展中国家,我国正式参与了这个跨世纪的国际合作项目,德、 日、英、法国家的科学家先后正式加入,共有 16 个实验室和 1100 名生物科学家、计算机专 家和技术人员参与其中。该计划已绘制出覆盖率达 97%的人类基因组“工作框架图”,并在 2001 年 6 月前绘制出更高覆盖率的“完成序列图”;2003 年 4 月 14 日,由我国总理温家宝和 其他五国政府首脑签署的《人类基因组联合宣言》发表;2005 年 10 月 26 日,六国“协作组” 宣布这一计划圆满完成。 五.DNA 技术的其他应用 (一)亲缘鉴定 DNA 是从几滴血, 腮细胞或培养的组织纤内提取而来。用畴素将 DNA 样本切成小段, 放进喱胶内, 用电泳槽推动 DNA 小块使之分离——最细的在最远, 最大的最近。 之后, 分离 开的基因放在尼龙薄膜上, 使用特别的 DNA 探针去寻找基因, 相同的基因会凝聚于一, 然 后,利用特别的染料,在 X 光的环境下, 便显示由 DNA 探针凝聚于一的黑色条码。小孩这种 肉眼可见的条码很特别,一半与母亲的吻合,一半与父亲的吻合。这过程重覆几次,每一种探 针用于寻找 DNA 的不同部位并影成独特的条码, 用几组不同的探针, 可得到超过 99.9%的 父系或然率或分辨率。 (二)医疗与制药 基因工程与医药卫生基因工程在医药卫生方面的贡献体现在三个方面: ①利用“工程菌” 生产基因工程药品;②基因诊断;③基因治疗。 1. 工程菌概念及基因工程获得胰岛素的方式工程菌指用基因工程的方法, 使外源基因 得到高效表达的菌类细胞株系。如:含有人类胰岛素的大肠杆菌菌株,含有抗虫基因的土壤 脓杆菌菌株都是“工程菌”。科学家将动物体内能够控制产生胰岛素的基因与大肠杆菌的 DNA 分子重组,并且在大肠杆菌内表达成功。从而取代了过去主要从猪、牛等家畜的胰腺 中提取胰岛素的历史,满足了社会中糖尿病对胰岛素的需求。 2. 干扰素概念及产生机理干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。 由于干扰素几 乎能抵抗所有病毒引起的感染,因此,它是一种抗病毒的特效药。传统的干扰素生产方法是 从人的血液中白细胞内提取的,每 300wL 能提取出 1mg 干扰素。科学家用基因工程的方法 在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素, 从每 1kg 细菌培养物中可以得到 20~40mg 干扰 素。 3.白细胞介素及其产生机理白细胞介素-2 是淋巴细胞产生的一种淋巴因子,能促进 淋巴细胞活化和增殖。用基因工程方法生产的白细胞介素-2 在临床上主要用于治疗肿瘤和 感染性疾病。20 世纪 90 年代后期,我国上海生化研究所的研究人员完成了白细胞介素-2 在 大肠杆菌中的高效表达。 4.基因诊断概念及应用基因诊断是用放射性同位素(如 32P)、荧光分子等标记的 DNA 分子做探针,利用 DNA 分子杂交原理,鉴定被检测标本上的遗传信息,达到检测疾 病的目的。 DNA 探针的制备方法之一:根据翻译产物蛋白质的氨基酸序列查出相应的核苷 酸序列(约 30 个氨基酸对应的 90 个左右的核苷酸序列),再从中选出两个片段,用化学方 法合成这两个片段并作同位素标记,即成探针。方法之二:用所需的 mRNA 逆转录后成为 DNA,标记后作为探针。用这一探针探查基因文库中经加热或提高 pH 值而使之已经变性的 DNA 片段,如果有一个片段能和探针片段互补结合而成双链(分子杂交),这一片段即含 有所需要的基因。基因诊断是一种快速简便的方法。例如:用 β—珠蛋白的 DNA 探针可以 检测出镰刀型细胞贫血症;用苯丙氨酸羟化酶基因探针可以检测出苯丙酮尿症。此外,基因

诊断技术在肿瘤诊断中的应用也取得了重要成果。 5.基因治疗及其原理基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中,达到治 疗疾病的目的。 其原理是把健康的基因导入含有基因缺陷的细胞中, 在有基因缺陷的病人的 细胞中既含有缺陷基因,又含有通过基因工程导入的健康基因。因此,在病人体内两种基因 都能够表达, 健康基因的表达产物掩盖了缺陷基因的表达产物, 从而治愈了有基因缺陷的疾 病。例如,有一种人类遗传病叫做半乳糖血糖,患这种病的人,由于细胞内半乳糖苷转移酶 基因缺陷而缺少半乳糖苷转移酶,因此当乳糖分解成半乳糖后,不能继续转化成为葡萄糖, 过多的半乳糖在体内积聚,会引起肝、脑等功能受损。1971 年,美国的一位科学家在体外 做了一个实验, 他用带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染患者的离体组织细胞, 结果发现 这些组织细胞能够利用半乳糖了。 (三)基因工程与农业 基因工程在农牧业生产上的应用主要是培育高产、优质或具有特殊用途的动植物新品 种。 基因工程在农业方面的应用主要表现在两个方面。 首先, 是通过基因工程技术获得高产、 稳产和具有优良品质的农作物。例如,用基因工程的方法可以改善粮食作物的蛋白质含量。 其次, 是用基因工程的方法加快农作物新品种的培育。 科学家们在利用基因工程技术改良农 作物方面已取得重大进展, 一场新的绿色革命近在眼前。 这场新的绿色革命的一个显著特点 就是生物技术、农业、食品和医药行业降融合到一起。基因技术的突破使科学家们得以用传 统育种专家难以想象的方式改良农作物。例如,基因技术可以使农作物自己释放杀虫剂,可 以使农作物种植在旱地或盐碱地上, 或者生产出营养更丰富的食品。 科学家们还在开发可以 生产出能够防病的疫苗和食品的农作物。 基因技术也使开发农作物新品种的时间大为缩短。利用传统的育种方法,需要七、八年 时间才能培养出一个新的植物品种, 基因工程技术使研究人员可以将任何一种基因注入到一 种植物中,从而培育出一种全新的农作物品种,时间则缩短一半。 基因工程在畜牧养殖业上的应用也具有广阔的前景,科学家将某些特定基因与病毒 DNA 构成重组 DNA,然后通过感染或显微注射技术,将重组 DNA 转移到动物受精卵中。 由这种受精卵发育称的动物可以获得人们所需要的各种优良品质, 如具有抗病能力、 高产仔 率、高产奶率和高质量的皮毛等。 (四)基因工程与环境保护 基因工程的方法可以用于环境监测, 和被污染环境的净化。 利用基因工程可获得同时能 分解多种有毒物质的新型菌种。例如,1975 年,有人把降解芳烃、萜烃和多环芳烃的质粒 转移到能降解烃的一种假单胞杆菌内,结果获得了能同时降解四种烃类的“超级菌”,它能 把原油中约三分之二的烃分解掉。这种新型“工程菌”在环境保护方面有很大的潜力。据报 道,利用自然菌种分解海上浮油要花费一年以上的时间,而这中“超级菌”却只要几个小时 就够了。 六.危害与伦理 1.转基因食品的安全性 1994 年美国 Caigene 公司的转基因延熟番茄经 FDA 批准上市, 成为第一例通过安全评 价的转基因植物食品。迄今为止,全世界已有 40 多个可能作为食品来源的转基因植物获得 批准上市。主要包括延熟番茄,抗除草剂的玉米、棉花、大豆和油菜,抗虫的马铃薯、棉花 和玉米,抗病毒的西葫芦、南瓜和番木瓜,雄性不育的玉米和莴苣,以及改变油脂特性的油 菜和大豆等。 转基因植物由于采用遗传工程操作的特殊手段, 可能存在无法预测的其它性状的改变, 从而带来某些转基因植物食品的安全性问题。转基因食品对人类的危害主要有 3 大类: (1)

可能含有已知或未知的毒素,对人体产生毒害作用。(2)可能含有已知或未知的过敏源, 引起人体的过敏反应。(3)这种食品某些营养成分或营养质量可能产生变化,使人体出现 某种病症。1993 年经济发展合作组织(OECD)提出了食品安全性分析的实质等同性 (Substantial equivalence)原则,即生物技术产生的食品及食品成分是否与目前市场上销售 的食品具有实质等同性。转基因食品的安全评估主要包括:有无毒性、有无过敏性以及抗生 素抗性等标记基因的安全性。 食品安全性试验最主要的问题是提出相关的科学问题并加以回 答,假设安全性分析包括所有可能的变数,则会太复杂到难以处置;相反,若仅观察少数变 数, 则某些重要因素可能会被忽略。 由于人们对转基因食品的潜在危险性和安全性缺乏足够 的预见能力,因此,根据国情建立一系列的转基因食品安全管理程序和措施是十分必要的。 2.DNA 技术引发伦理问题 对人类的基因干预有可能引发现存人类道德不能包容的伦理难题,也是引致广泛争论 的话题。因为对人类生命的干预,以前从未在这种广度和深度进行,社会伦理缺乏充分的接 纳准备。而克隆技术的最新发展,使人们更有理由担心基因研究被应用于非人道的目的。如 果复制技术被某些不受管制的“疯子”滥用,世界也将因人类科技进步而陷入噩梦般的境地。 美国广播公司 1997 年就复制技术进行的一项民意调查显示,82%的美国人反对用复制 技术培育人类;93%的美国人说,他们本人不愿意被人应用复制技术造出另一个与他一模一 样的人。民意调查还表明,50%的美国人不赞成搞复制技术研究。 1995 年诺贝尔和平奖获得者,英国核物理学家罗特布拉特反“复制羊”的问世同原子弹 的出现相提并论。他最近不无忧虑地说,遗传工程像原子弹一样“具有令人恐怖的可能性”。 他强烈呼吁建立一个国际伦理委员会, 负责阻止可能危及人类的科学研究项目。 美国生物技 术工业组织也对复制技术讳莫如深, 该组织曾经发表公报, 告诫其所属的 700 家企业和研究 中心不得从事无性生殖的研究活动。 “复制羊”的消息公布后,美国政府迅速做出反应。2 月 24 日当天,美国总统克林顿即 发表谈话, 要求美国国家生物伦理学咨询委员会研究复制技术在法律和伦理方面可能造成的 影响, 并在 3 个月之内向他汇报。 克林顿甚至主张对美国现有的关于人类胚胎研究的立法进 行调整。

【典型例题】 典型例题】
例 1.作为基因的运输工具—运载体,必须具备的条件之一及理由是 A.能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制,以便提供大量的目的基因 B.具有多个限制酶切点,以便于目的基因的表达 C.具有某些标记基因,以便目的基因的表达提供条件 D.在宿主细胞中复制并稳定保存,以便于进行筛选 析:本题考查的是运载体必须具备的条件及理由,条件与理由必须相符。作为运载体要 携带目的基因进入手提细胞并使之表达, 必须能够在宿主细胞内稳定地保存并大量复制, 以 便通过复制提供大量目的基因。 同时要具有某些标记基因, 是为了通过标记基因是否表达判 断目的基因是否进入了受体细胞,从而进行筛选手提细胞。运载体要具有多个限制切点,则 是为了便于与外源基因连接。综上所述,正确答案为 A。 答案:A。 答案 例 2.下列有关基因工程技术的叙述,正确的是 A.重组 DNA 技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体 B.所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快

D.只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达 析:此题考查了基因的操作工具、目的基因的表达等知识。解答题目明确以下几方面 的知识:①基因操作的工具酶是现之美、DNA 连接酶;②一种限制酶只能识别特定的核苷 酸序列;③载体是基因的运载体工具;④目的基因进入体细胞后,受体细胞表现出特定的性 状,才能说明目的基因完成了表达过程;⑤导入受体细胞中目的基因主要为了表达、生产目 的基因的产物,因此能够快速繁殖是选择受体细胞的重要条件之一。 答案:C。 答案 例 3.下列高科技成果中,根据基因重组原理进行的是 . ①我国科学家袁隆平利用杂交技术培育出超级水稻 ②我国科学家将苏云金芽孢杆 菌的某些基因移植到棉花体内,培育出抗虫棉 ③我国科学家通过返回式卫星搭载种子培 育出太空椒 ④我国科学家通过体细胞克隆技术培养出太空牛 A.① B.①② C.①②③ D.②③④ 析:本题考查几种高薪技术所依据的遗传学原理。袁隆平培育新型水稻利用的是杂交 技术,他本人也被称为“杂交水稻之父”。而杂交技术的原理就是基因的自由组合定律;基 因工程是认为地将目的基因导入受体细胞, 使之表达, 所以抗虫棉的培育原理也应是基因重 组;太空育种的原理是基因突变;克隆技术则是无性繁殖。 答案: 答案:B。 例 4:科学家应用基因工程培育出了一种抗虫棉,它能产生毒素杀死害虫,目前正在大面积 : 推广种植。科学家还研究了害虫的遗传基因,发现不抗毒素对抗毒素为显性(此处分 别用 B 和 b 表示)。据此回答: (1)种植抗虫棉,有利于生态环境保护,这是因为 。 (2)棉田不抗毒素害虫的基因型为 ;抗毒素害虫的基因型为 。 。 (3)不抗毒素害虫与抗毒素害虫杂交则子代的基因型为 析:本题主要考查以下几个问题:①“转基因抗虫棉”具有抗害虫的能力,这表明棉花 体内产生了抗虫的毒蛋白物质。这个事实说明,害虫和植物共用一套遗传密码,蛋白质合成 的方式是相同的。②“转基因抗虫棉”康害虫的遗传信息传递过程可表示为 DNA(基因) →RNA→蛋白质。科学家语言,此种“转基因抗虫棉”独立种植若干代以后,也将出现不 抗虫的植株,此现象来源于基因突变。 答案:(1)可以减少或不再使用农药杀虫,从而避免农药对环境造成污染 (2)BB 或 bb (3)Bb 或 bb 例 5:蚕的丝腺细胞能产生大量蛋白质,这种蛋白质叫丝蛋白。这些细胞不产生血液中的蛋 : 白质,因此推测丝腺细胞 A.只有丝蛋白基因 B.有血蛋白和丝蛋白基因 C.有丝蛋白基因和其他基因,但没有血液蛋白基因 D.比合子的基因少 对一个不断分裂的胚性细胞而 析 生物体每个正常体细胞中都含有本物种整套的基因。 言,这些基因能按一定的发育顺序被逐渐打开;而对一个高度分化的细胞(如丝腺细胞)而 言, 细胞内绝大部分基因被关闭了, 一般只有少部分与该细胞功能有关的基因才具有表达功 能。因此,丝腺细胞中丝蛋白和血液蛋白基因都存在,但丝蛋白基因可以表达而血液蛋白基 因被关闭了,不能表达。 答案:B。 答案

【智能训练】 智能训练】

1.根据基因工程的定义,下列名词中不能替代基因工程的是 A.基因诱变 B.分子克隆 C.DNA 重组 D.传工程 E.基因无性繁殖 2.基因工程操作的三大基本元件是 A.供体、受体、载体 B.供体、受体、抗体 C.供体、受体、配体 D.供体、抗体、载体 3.Ⅱ型限制性内切核酸酶是指 A.有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列 B.仅有内切核酸酶活性,甲基化酶活性由另外一种酶提供 C.限制性识别非甲基化的核苷酸序列 D.有外切核酸酶和甲基化的核苷酸序列 4.限制性内切核酸酶可以特异性地识别 A.双链 DNA 的特定碱基对 B.双链 DNA 的特定碱基序列 C.特定的三联密码 D.以上都正确 5.经抗药性遗传标记法筛选出的转化体中,往往会出现无载体或无重组 DNA 分子的菌落, 其原因很可能是 A.标记基因发生突变 B.载体或重组 DNA 分子整合到了受体染色体 C.载体空载 D.载体或重组 DNA 分子不稳定 E.筛选药物诱导受体细胞产生抗体 6.关于 cDNA 最正确的说法是 A.同 mRNA 互补的单链 DNA B.同 mRNA 互补的双链 DNA C.以 mRNA 为模板合成的双链 DNA D.以上都正确 7.“工程菌”是指 A.用物理或化学方法诱发菌类自身某些基因得到高效表达的菌类细胞株系 B.用遗传工程的方法,使同种不同株系的菌类杂交得到的新细胞株系 C.用基因工程的方法,使外源基因得到高效表达的菌类细胞株 D.从自然界中选取能迅速增殖的菌类 8.要使目的基因与对应的运载体重组,所需要的两种酶是 ①限制酶 ②连接酶 ③解旋酶 ④还原酶 A.①② B.③④ C.①④ D.②③ 9.下列关于基因工程的叙述,正确的是 A.基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因 B.细菌质粒是基因工程常用的运载体 C.通常用一种限制性内切酶处理含目的基因的 DNA,用另一种处理运载 DNA D.为育成抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体 10.要彻底治疗白化病必须采用 A.基因治疗 B.医学手术 C.射线照射 D.一般药物 11.TATA 盒在哪种细胞有?是什么场所? A.原核细胞 RNA 多聚酶结合场所 B.真核细胞、DNA 连接酶切下内含子 C.多细胞真核生物、RNA 多聚酶结合场所 D.都对

E.都不对 12.采用什么方法可将重组基因转入单子叶植物 A.用 Ti 载体 B.用质粒作为载体 C.用基因抢法 D.用放射性同位素探针 E.上面全不对 13.以下哪个可作为 DNA 载体 A.噬菌体 B.质粒 C.大肠杆菌细胞 D.A 和 B E.A 和 C 14.在真核细胞中有三种 RNA 聚合酶,它们在不同的启动子处结合,转录不同的 RNA。有 关 RNA 聚合酶Ⅰ,下列叙述正确的是 A.它存在于核质,合成 mRNA B.它存在于核仁,合成 mRNA C.它存在于核仁,合成 tRNA D.它存在于核质,合成 tRNA E.它存在于核仁,合成 rRNA 15.下列哪一种说法是对的 A.大肠杆菌乳糖操纵子仅受乳糖阻遏子的负调控 B.当葡萄糖和乳糖同时存在时,大肠杆菌可以同时都利用 C.分解代谢物基因激活蛋白(CAP)在结合 ATP 之前对转录没有影响 D.一个相同的 mRNA 编码的不同蛋白在胞内有相同的数量 E.在原核生物,位于染色体上许多不同位置的 DNA 修复基因仅被一个阻遏物调控 16.基因工程在 DNA 重组中最常用的载体是 A.病毒 DNA B.细菌染色体 DNA C.植物 DNA D.动物 DNA 17.将 DNA 插入人细胞的基因组中的适合的载体是 A.T 质粒 B.噬菌体 C.反转录病毒 D.所有上述的 18. 真核生物的基因克隆到细菌中后可能非正常地发挥其功能, 以下哪一项不能解释这一现 象 A.不能切基因内含子 B.被内源内切酶破坏 C.其启动子不能被细菌 RNA 聚合酶识别 D.具有不同的核糖体结合位点 E.使用不同的遗传编码 19.大肠杆菌乳糖操纵子分解代谢物激活蛋白 A.使 RNA 聚合酶与启动子区域结合的亲合性增加 B.降低 RNA 聚合酶活性 C.结合 cAMP 后就没有动能了 D.A 和 B 都对 E.A 和 B 都对 20.产生单克隆康团体的途径是 A.放射免疫测定 B.克隆载体 C.细胞化学 D.杂交瘤细胞 21.双子叶植物中原生质体的融合在下列情况中都存在,而通过杂交也能打达到的原因 A.是由于不同科的植物遗传物质的结合 B.是由于在发育过程中混杂质体的种群相混合的结果 C.是由于发育过程中混杂线粒体的种群相混合的结果

D.是由于从野生种中转移抗性基因到培育种中 22.在下述生物中,哪种可用于高等植物的基因转移工作 A.大肠杆菌 B.根瘤固氮菌 C.农杆菌 答案::1.A 2.A 3.B 4.B 5.C 6.C 7.C 8.A

D.伤寒杆菌 9.B 10.A 11.C 12.C 13.D

14.E 15. E 16. A 17.C 18.E 19. A 20.D 21. D 22. C


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