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ITRAQ技术需注意的问题与答疑


iTRAQ 技术需注意的问题与答疑
1.Itraq 的原理是什么? Itraq 的检测可以做这样的比喻, 蛋白被打成肽段后, 被平均的铺在了一个有 384 个孔的平板上, 然后机器会从每个孔中选取浓度在前 5 名的蛋白进行鉴定和比对, 所以, 如果假设每个一个样本中有 100 个蛋白,他们的浓度均为 1%,那么得到的结果就是蛋白的得分低,但是鉴定的蛋白数量会很多, 可以达到 90 以上;如果一个样本中有 100 个蛋白,有 3 个蛋白的含量分别为 30、20、10、其他的 97 钟蛋白为剩下的 50%,那么这三种蛋白的得分高,但是鉴定出的蛋白数量会比较少,也许只有 50 或 者 60 个。因为一些高丰度的蛋白会大量分部在上述的小孔中,抑制了其他蛋白的检出效果。

2.iTRAQ 的主要优势是什么? (1)高通量。一次性定性和定量该样本的总蛋白,不用像双向电泳(2DE)或 DIGE 要逐个斑点做 鉴定; 2DE 可分离 1500-2500 个斑点(并且可能很多斑点对应同一种蛋白), 而 iTRAQ 一般可鉴定 2000 种以上蛋白,其中常规动物组织或细胞可鉴定到 4000-7000 种蛋白; (2)结果直观、分析灵活——直接得到蛋白的定性和相对定量信息,可利用统计学方法快速筛选 出各个组别的差异蛋白;能更好的结合基因组或转录组的数据,十分有利于后续研究。 (3)对样本类型无限制——任何类型的样本均可做,当然数据库越全、鉴定到的蛋白种类越多; 对于罕见物种,可提供转录组数据来检索,更容易找到有意义的蛋白。 (4)一次上机的样本数高达 8 个,如果样本数多于 8 个,还可以在每次上机时设置内参,每个样 本先跟内参比较, 再相互比较 (排除操作、 环境和仪器误差) , 从而实现多组样本间的差异蛋白分析。

3.iTRAQ 与其他蛋白质组学技术有何不同,我们该如何选择? 双向电泳是最早、最经典的蛋白质组技术,适用于大部分样本,只是对强酸或强碱性蛋白,以及 分子量太大或太小的蛋白质分离效果不好; 另外由于各个样本需要单独跑胶, 很难避免操作误差对结 果的影响, 可能导致定量不准确; 但是双向电泳的服务价格相对便宜, 可以用于样本差异的初步筛选; DIGE 在双向电泳基础上做了改进,引入了荧光标记物和内标,可以使定量更加准确;但该技术也是 依据蛋白的等电点和分子量分离, 因此对强酸或强碱性蛋白, 以及分子量太大或太小的蛋白质分离效 果也不好。 iTRAQ、TMT、label-free 和 SILAC 都是利用液质联用技术来寻找差异蛋白。其中,iTRAQ 和 TMT 的原理和检测方法基本一致,只是使用了不同的标记物;TMT 有 10 种标记物,可对多达 10 种不同样

本进行分析,但是由于其标记物的质量数非常相近,因此必须使用超高分辨率的质谱(Thermo 公司 的 QE 质谱仪) 才可以满足检测, 这也必然会导致信号干扰更多, 可能会影响定量的准确性; label-free 是非标记的蛋白质组学技术,由于没有标记物,其定量需要依赖于操作和质谱仪的稳定性,该技术鉴 定到的蛋白数目会少于 iTRAQ 技术,并且定量的准确性较差,优势是服务费用较低;SILAC 是基于稳 定同位素标记的细胞培养技术的蛋白质组学方法,利用不同的同位素培养基来培养不同组别的细胞, 达到体内标记的目的, 其定量准确性要比其他蛋白质组学技术更高; 但是由于缺乏合适的同位素培养 基,该方法基本只能用于可传代的哺乳动物细胞系。 从定量准确性、应用性等各方面综合考虑, iTRAQ 技术已成为近年来利用最广泛的蛋白质组学 技术。

4.iTRAQ 实验对样本有何要求? 任何类型的样本都可以,如果是罕见物种,可以用近缘物种的数据库检索,也可提供转录组数据 库来检索;一次上机,每组样本需要用 200ug 蛋白,但由于需要蛋白定量检测和预实验,因此每组样 本所需的蛋白量大概在 500ug 左右;我公司负责蛋白质的提取,客户只需要提供足够的原始样本。

5.不同类型的样本做 iTRAQ 可否一次上机? 不能。如果样品来源于不同物种,检索时就无法选择数据库,也就无法分析数据;即使是同一物 种的样本,它们的蛋白种类和丰度也可能有很大差别(比如植物的根和叶) ,将这些酶切肽段混合上 机,其数据会相互干扰,导致蛋白定性和定量的不准确。

6.iTRAQ 实验是否需要设置重复? 我们常说的重复包括生物学重复和技术重复,iTRAQ 中常说到的还有上机重复;生物学重复即样 本重复, 采集来源于同一组别的不同样本 (例如同样处理的不同植物、 同一疾病的不同患者血清等) , 通常设置 3 个生物学重复, 但临床样本一般要求生物学重复更多 (如疾病组和健康组各十几例样本) ; 当生物学重复的样本很多时,可以将同组样本混合后再标记,便可以通过一次上机检测;技术重复, 通常是同一个样本用不同标记物标记,这样可以排除因蛋白提取、酶解、标记等操作引入的误差;另 外 ITRAQ 实验有时会设计上机重复,这其实也属于技术重复的范畴,即相同的样本上两次机,来排除 操作误差和仪器误差。目前发 SCI 论文一般需要设置重复(无论何种重复) ,否则可能会被质疑数据 的准确性;另外从数据质量上讲,重复能更有效的帮助我们排除不可信蛋白,无论是对 WB 验证还是 后续研究,都是很有利的。

7.iTRAQ 的重复性好不好? 我们通常所考虑的 iTRAQ 重复性指定量的重复性, 即同样的样本在上机两次时得到的结果是否一 致;iTRAQ 实验重复性的好坏就决定了数据的准确性。一般来说,由于质谱选取肽段的随机性,可能 导致检测到的肽段及其强度不同,在经过软件匹配分析后,得到的蛋白比值可能会不一样。一般得分 和比值比较靠后的蛋白才会出现定量的严重偏差, 而绝大部分蛋白的比值趋势是一致的。 因此在分析 时, 我们会将鉴定到的蛋白先按 FDR (错误发现率) 或 unused 值进行筛选, 选取置信度大于 95% (unused >1.3)或 99%(unused>2)的蛋白作为可信蛋白,再进行分析。

8.我们的仪器定性和定量的准确性如何? 辉骏生物使用的是 Thermo Scientific Q Exactive Orbitrap LC-MS/MS System,该仪器将高性 能四极杆的母离子选择性与高分辨的准确质量数(HR/AM)Orbitrap 检测技术相结合,可显著提高样 品的分析通量和数据质量: ①超高分辨率(高达 140,000 FWHM)——区分分子量差异的能力强; ②质量精度优,使用全自动 AGC 和质量校准程序,在全扫描和全部离子碎裂(AIF)模式下质量精 度优于 1 ppm; ③扫描速度快,快速扫描频率达到 12Hz,与 UHPLC 快速色谱技术联用时可确保精确质量分析; 在任何扫描模式下,快速极性切换无需牺牲质量精度;在 35,000 分辨率下,一个正离子和一个负离 子扫描的完整周期分析仅需 1 秒; ④质量范围广,扩展至 50 - 6,000 m/z,可分析完整蛋白和单电荷离子; 全部离子碎裂(AIF)采用多重碎裂技术,离子源碰撞诱导解离(CID)和可选的高能量碰撞解离(HCD), 使得 MS 和 MS/MS 数据能够得到增强的结构信息; ⑤四极杆质量数过滤器:高级四极杆技术(AQT)提高母离子选择和传输能力,使复杂基质中低丰 度分析物的定量更准确; ⑥多重检测能力提高单个周期的分析效率:精密的数据非依赖采集 (DIA)和平行反应监测(PRM) 用以实现更高置信度、更好重现性以及更高通量的定量分析结果; ⑦新的 S 型离子光学,使灵敏度提高 3 倍 ⑧高效软件 SIEVE 2.0 可用于蛋白、肽段和代谢物的差异表达分析

9.按什么标准来选取差异蛋白?

差异蛋白的选取目前并没有统一标准, 有多种选择方法, 根据比值筛选, 结合比值和标准差筛选, 或根据 T-Test 筛选;我们目前一般根据比值进行选择,即差异倍数≤0.67 和≥1.5,有时也会按照 p≤0.05 的标准过滤。

10.iTRAQ 实验的数据采用不同数据库检索时,各组间的比值为何是不同的? iTRAQ 技术中不同标记物之间的比值与检索数据库、质谱电信号的噪音以及采集质谱时的随机性 都有关。所以在使用不同数据库检索时,由于匹配肽段情况的不同,定量结果也有些许差异,但是总 体变化趋势应是一致的。

11.检索时为什么同一个编号对应了很多蛋白质? 因为一个蛋白家族中常常含有多个同源性很高的蛋白质, 这些蛋白质被酶切之后, 很可能会产生 很多相同的肽段,软件在进行定性分析时,就会将这些肽段均归于得分最高的那种蛋白质,其他同源 蛋白不计分,并且这些同源蛋白都采用同一编号。

12.LC/MS 中蛋白处理是定量还是定性? 这是属于定量,需在蛋白定量后,各取相同量(50-100ug)的蛋白(体积不大于 25ul,少于 25ul 的用专用裂解液补至 25ul)进行还原化和烷基化。

13.LC/MS 对需要检测的蛋白有量的要求吗? 有的,要求蛋白量最低 50ug,浓度最低要为 5ug/uL,否则同位素无法标记。

14.数据分析中主要看哪些参数? 对于液质联用的数据分析, 一般观察的参数为: Total Ion Score C.I. % (可信度) 和 Tag-80/Tag-0 (两样本的比值) 。

15.众多可信度数值中,主要选择哪些进行研究? 一般来说可信度在 80%以上的均为可信程度非常高的。有些蛋白可信度在 60%以上的也可以作为 参考数据。

16.可信程度低于 80%的数据有意义吗? 可信程度低于此值的,如果有感兴趣的蛋白可以通过 ELISA、WB、Q-PCR、液态芯片等技术手段 进一步验证,毕竟 LC/MS 是研究蛋白组学的方法之一,如全面研究还是要综合各种研究方法。

17.两样本的比值都代表什么? 两样本的比值如果在 0.9-1.1 之间的,可以认为两样本的含量是一样的,即比值为 1:1;而小 于 0.9 或大于 1.1 均可认为两样本之间的比值是有差异的。

18.质谱图中显示的是各种蛋白吗? 不是各种蛋白而是蛋白被打碎后的离子图谱, 由于质谱法是电场和磁场将运动的离子 (带电荷的 原子、分子或分子碎片)按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出的是离子的准确质量,由此来 确定离子的化合物组成。

19.目前开展该项业务的公司有很多,能否推荐下哪家公司做的比较好? 目前能开展 itraq 的公司挺多的, 个人推荐广州辉骏生物做的相对还是不错的。 现在据说服务质 量挺好,周期大约 1 个月左右。

20.如果打算开展该项试验,需要提供什么样的样品形式? 最好是提供抽提好的蛋白,冻成干粉,然后用干冰快递过来。组织蛋白抽提不能用含二维电泳的 变性剂来裂解蛋白。如果组织的话,存放到-80 度冰箱中,然后用干冰快递过来,上海本地的,也可 以将组织用冻存管装好,投入液氮中运过来即可。


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