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核酸类药物的生产


第五节

核酸类药物的生产

内容提要
一、核酸类药物的分类 二、核酸类药物的生产方法 三、DNA和RNA的制备

四、肌苷的制备
五、核酸类结构改造药物的制备

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DNA RNA

? 碱基: 腺嘌呤 A ? 核苷: 腺苷 ? 核苷酸: 腺苷酸 AMP (腺苷一磷酸) ADP (腺苷二磷酸) ATP (腺苷三磷酸)
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(一) 什么是核酸类药物?
? 具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷、碱基及其衍生 物。

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(二)核酸类药物的分类

核酸类药物 的分类

具有天然结构 的核酸类物质

自然结构核酸 类物质的类似 物和聚合物

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1、具有天然结构的核酸类物质

?

ATP、GTP、CTP、UTP、肌苷。

? ATP:用于心肌炎、心肌梗死、心力衰竭及动脉或冠状动脉硬化的治疗或
辅助治疗。

? 肌苷:用于急慢性肝炎、肝硬化、白细胞减少、血小板减少等。

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2、自然结构核酸类物质的类似物和聚合物 ? 叠氮胸苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷等。
? 治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要药物。

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二、核酸类药物的生产方法

1
2 3

直接提取法 水解法(酶水解、碱水解、酸水解)
化学合成法 酶合成法 微生物发酵法

4
5
Page ?8

酶水解

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碱水解

? 用碱水解RNA 可产生2’、3’ -混合核苷酸
2’、3’ -混合核苷酸在医药上有它的特殊用途,对血小板减少,白血球 减少症和癌症化疗后升白血球均有较好疗效。

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(一)DNA的制备

促进细胞的活 化

调节新陈 代谢

延缓机体 衰老

DNA的作用

维护正常免

疫功能

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? 利用补救合成途径为人体提 供脱氧核苷酸,参与人体核 酸代谢,从而具有促进细胞 生长、修复受损细胞及改变 机体代谢的作用。

? 用于急﹑慢性肝炎白细胞减 少症,血小板减少症及再生 障碍性贫血等的辅助治疗。

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DNA的粗提取 1、准备材料
? 将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室,至少24 h。

2、取材
? 称取30 g菜花,去梗取花,切碎。

3、研磨
? 将碎菜花放入研钵中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min 。

4、过滤
? 在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液倒入塑料离心管中进行离心,用1 000r/min的旋转频率,离心25 min,取上清液放入烧杯中,取上清液。

5、加冷酒精
? 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并用 玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液,可见白色的DNA絮状物出现。
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DNA的鉴定 1、配制二苯胺试剂
? 取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混匀。

2、鉴定
? 取4 mL DNA提取液放入试管中,加入4 mL 二苯胺试剂,混匀后观察 溶液颜色(不变蓝)。用沸水浴(100 ℃)加热10 min。在加热过程中,随 时注意试管中溶液颜色的变化(逐渐出现浅蓝色)。

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(二)RNA的制备

化妆品

抗癌、抗病毒

农业生产

RNA的作用
关节炎

肝炎、心脏病

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BP素(注射用核糖核酸Ⅱ) 【性 状】
本品为白色或类白色冻干 块状物或粉末,易溶于水。

【药理毒理】
本品具有提高机体细胞免注射用核糖核酸Ⅱ) BP素( 疫功能和抑瘤作用。

【适 应 症】
适用于胰腺癌、肝癌、胃 癌的辅助治疗,对乙型肝炎的 辅助治疗有较好的效果。本品 亦可用于其他免疫机能低下引 起的各种疾病。
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1、制备RNA的材料来源

主要采用酵母、面包酵母等。

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2、提取法制备RNA

(1)稀碱法
用氢氧化钠溶液,使细胞壁变性,使核酸从细 胞内释放出来,再用酸中和至pH 7.0,将pH调至 RNA的等电点(pH 2.5),使RNA沉淀出来。

(2)浓盐法
用高浓度盐溶液(6%~8%)处理,同时加热,改 变细胞壁的通透性,使核酸从细胞内释放出来。

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3、RNA的提取实例

? 啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。 ? 取100g压榨啤酒酵母,加入230mL 0.33mol/L的Na0H溶液, 20℃以下缓慢搅拌30min。 ? 用6mol/L HCl调至pH 7,搅拌15min,离心得清液255mL。 冷至10℃以下 ? 6mol/L HCl调pH 2.5,置冷过夜,离心得RNA 1.8g。

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肌苷的背景知识
? 【质量标准】:收载于《中华人民 共和国药典》2005年版二部205页

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肌苷的背景知识

【药理作用】

本品能使处于低能缺氧状态 下的细胞继续顺利进行代谢,并 参与人体能量代谢与蛋白质的合 成。

【适应症】

临床用于白细胞或血小板减 少症,各种急慢性肝脏疾病、心 脏疾病、洋地黄中毒症等疾病。

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肌苷的背景知识

洋 地 黄

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肌苷的背景知识

? 肌苷是由次黄嘌呤与核糖结合而成。

? 次黄嘌呤可由腺嘌呤(A)脱氨形成,是嘌呤衍生物。

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1、肌苷生产的工艺流程

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2、肌苷生产的控制要点

控制要点

菌种

菌种扩大 培养

精制

肌苷
提取 吸附 洗脱 发酵

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2、肌苷生产的控制要点

(1) 菌种 变异芽孢杆菌

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(2) 种子扩大培养流程

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A、斜面培养 ? 30-32℃, 培养48h ? 斜面培养基:葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏、琼脂 B、摇瓶振荡培养 ? (32 ±1)℃,培养18h ? 摇瓶培养基:葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、玉米浆、尿素、 NaCl C、种子罐培养 ? (32 ±1)℃,培养12-15h ? 种子罐培养基:同摇瓶种子培养基

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(3) 发酵
50L发酵罐, (32 ±1)℃, 93h 500L发酵罐, (32 ±1)℃, 75h 20000L发酵罐,(35 ±1)℃, 83h
? 发酵培养基:淀粉水解糖、干酵母水解液、豆饼水解液、尿素、 硫酸铵、硫酸镁、氯化钾、磷酸氢二钠、有机硅油

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1
温度的影响

2
pH的影响
发酵过程 要注意

3
溶解氧和CO2 的影响

4
泡沫的影响

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(4) 提取、吸附、洗脱

(5) 精制

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(一)三氮唑核苷的制备

?

[别名] 利巴韦林,病毒唑,为广谱抗 病毒药物。

? [抗病毒机制] 抑制多种DNA和RNA病毒的复 制,但对病毒无直接的灭活作用。 ? [抗病毒谱] 如甲型和乙型流感病毒、单纯 疱疹病毒、麻疹病毒、乙型脑炎病 毒、流行性出血热病毒、脊髓灰质 炎病毒等。

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1、化学合成法
1972年,美国一家公司首次化学合成法研制成功。

鸟苷

乙酸酐,冰醋酸

核糖-1-磷酸
双-对硝基苯酚-磷酸酯 氨解

核糖-1-磷酸+三叠氮羧基酰胺(TCA ) 苷

三氮唑核

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2、发酵法

(1)

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(2) 培养基
? 斜面活化培养基:葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏.,氯化钠、琼 脂,pH7.0-7.2 ? 种子培养基:葡萄糖、味精、尿素、蛋白胨、酵母膏、玉米浆, pH7.0-7.2 ? 发酵培养基:葡萄糖、硫酸铵、酵母粉、味精、豆饼水解液、磷酸二 氢钾、七水硫酸镁、硫酸锰、碳酸钙,pH7.0-7.2

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(3) 发酵最适条件

TCA 添加量为10g/L
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MnSO4 的最佳添加量为10mg/L
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KH2PO24的最佳添加量为6mg/L
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(二)胞二磷胆碱的制备

? 胞二磷胆碱,为卵磷脂生物合成必需的辅酶。 主要用于急性颅脑外伤和脑 手术后的意识障碍 ? 1954年,Kennedy博士等人发现了胞二磷胆碱 ? 1963年,日本武田公司首次开发,用于治疗意识障碍获得成功,商品名 Nicholin,译名尼可林。 ? 1973年,国内试制成功。

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1、发酵法 (1) 菌种 啤酒生产中废弃的酵母 (2) 反应体系 CMP;磷酸胆碱;葡萄糖;MgSO4· 7H2O;磷酸二氢钾-氢氧 化钠缓冲液(pH8.0);

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磷酸胆碱浓度30微克/毫升

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(3) 反应条件:
28℃水浴,培养20 h,可得胞二磷胆碱。

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