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植物细胞培养生产次级代谢产物的影响因素与对策


植物细胞培养生产次级代谢产物的影响因素与对策 植物细胞培养技术是将植物体的某一部分经过无菌处理, 置于人工培养基上 使其细胞增殖, 进而按需要进行培养的技术。利用植物细胞培养技术生产有用代 谢产物, 已成为继微生物技术以后当代生物技术重要的发展领域。 据不完全统计, 我国已对 400 多种植物建立了组织和细胞培养体系, 并从中分离出 600 多种代谢 产物。 1 外植体的影响 同一植株不同部位的组织进行培养时,其产物或产物积累量不同。 银杏叶来源的愈伤组织黄酮含量为 1.5%,茎段来源的愈伤组织为 1.0%,而子叶 来源的愈伤组织仅为 0.3%。Mischenko 等[3]在茜草愈伤组织培养过程中发现,来 源于叶柄和茎的愈伤组织蒽醌累积量比来源 于茎尖和叶的愈伤组织高。 徐咏梅等对杜仲乔林与叶林 2 种栽培模式下树皮 中次生代谢物的含量差异研究发现,乔林树皮中杜仲醇、总黄酮和杜仲胶的含量 均比叶林树皮中的高, 而叶林树皮中绿原酸、京尼平甙酸和桃叶珊瑚甙比乔林树 皮中的高。 因此, 利用植物细胞培养生产次生代谢物时, 选择能诱导出疏松易碎、 生长快速且具有较高次生代谢物合成能力的愈伤组织的外植体非常重要。 2 培养基的影响 2.1 培养基种类 在细胞培养中, 愈伤组织生长和次生代谢物产生的最佳培养基一般是不一致 的。 钟青平等研究不同培养条件下的栀子愈伤组织生长和栀子黄色素的产生时发 现,B5、MG-5 基本培养基有利于愈伤组织生长;M-9 基本培养基有利于黄色素 合成。甘烦远等认为 MC 培养基对红花愈伤组织生长和生育酚的形成最有效。因 此在组织培养时可以采用二步培养法, 根据生长及代谢的需要, 调整基本培养基。 2.2 培养基组分 2.2.1 碳源 不同的培养细胞适合生长和次生代谢物积累的碳源种类不同。郑穗平等,在 研究玫瑰茄细胞生长和花青素生成时发现,蔗糖作为碳源,细胞的生长量高,葡 萄糖作为碳源,细胞花青素的含量高。赵德修等研究发现,5%蔗糖+1%葡萄糖组 合对雪莲愈伤组织生长不仅有利,而且细胞中总黄酮的含量也最高。 2.2.2 氮源 氮源对次生代谢物的产率有很大影响。陈永勤等报道,培养基中 NO3-浓度 高有利于愈伤组织的生长,NH4+浓度高抑制愈伤组织生长,但显著提高了紫杉 醇的含量。陈浩等研究发现,硝态氮对茶愈伤组织儿茶素的形成最为有利,氮质 量浓度为 15mmol/L 时愈伤组织生长量最高, 高氮浓度则导致儿茶素含量急剧下 降。 2.2.3 无机离子 汤飞宇等发现无机离子能有效提高西洋参细胞的生长速度和皂甙产量,当 MS 培养基 MgSO4 含量降低到原有量的 1/4 时,细胞生长速度提高 1.27 倍;将 KNO3 含量提高一倍,同时去掉 NH4NO3,细胞生长速度和皂甙产量分别比正常 培养液中提高 65.1%和 166.2% ; 适 宜 细 胞 生 长 的 磷 酸 盐 浓 度 为 0.65mmol/L,适宜细胞生产多糖和皂甙的磷酸盐浓度为 1.25 mmol/L。张檀等发 现镁对杜仲叶中 6 种次生代谢物的合成和积累有一定的促进作用, 锰则有负作用。 2.2.4 外源植物激素 韩爱明等在研究生长调节物质对高山红景天细胞生长及红景天苷积累的影

响时发现,在不同生长调节物质组合中,以 NAA 和 6-BA 组合效果最好,生物量 和红景天苷含量都最高。 姜玲等以银杏幼叶诱导的愈伤组织进行细胞悬浮培养发 现, KT 与 NAA 组合, NAA 与 6-BA 组合均能使细胞干重和黄酮糖苷含量同时提高, 而 GA3 和 2,4-D 对黄酮糖苷有明显的抑制作用。一般悬浮细胞的生长不需要乙 烯, 但乙烯及其前体却能刺激小果咖啡悬浮细胞中生物碱的产生。同一激素对不 同植物会有不同的结果, 例如, 应用高浓度激动素对紫花曼陀罗愈伤组织中生物 碱的生产起抑制作用,而在马氏山培养物中却促进生物碱的生产。Laurain 等研 究了 2 种茄科植物的细胞培养, 当愈伤组织从含高浓度生长素培养基转入低生长 素培养基时,生物碱和叶绿素的含量下降,而细胞生长率增加。 2.2.5 前体物质的添加 前人研究指出,多糖类物质可以促进次生代谢物的积累,Fukui 等研究了琼 脂对紫草悬浮细胞中紫草素诱导效应,在含琼脂的 LS 培养基中发现其有产生紫 草素的能力, 而在没有琼脂的培养基中, 醌的合成受到抑制。 甘烦远等研究表明, 云南红豆杉悬浮细胞适宜的培养基为 B5,当添加椰子汁(CM) 、酪蛋白氨基酸 (CA)和水解乳蛋白(LH)3 种有机物时,均能提高培养细胞中紫杉醇的含量, 而且 CM 和 CA 还能促进细胞的生长。Barz 等研究表明,酵母提取物对鹰嘴豆属 植物悬浮细胞中异黄酮代谢物的积累有明显的促进作用。陈永勤等研究发现,在 培养基中添加 0.05~0.2mmol/L 的苯丙氨酸、苯甲酸、苯甲酰甘氨酸、丝氨酸和 甘氨酸,能使东北红豆杉中紫杉醇含量高出 1~4 倍,这些物质参与了紫杉醇侧 链的合成。 甘烦远等在云南红豆杉细胞悬浮培养基中加入紫杉醇合成前体苯丙氨 酸、 亮氨酸均能提高紫杉醇的含量, 添加抑制甾体合成的代谢抑制剂 CCC 可提高 紫杉醇的含量,但高浓度的 CCC 起抑制作用。唐建军等发现, 以杜仲叶片作外植 体, 添加前体丙酮酸和次生代谢诱导子葡聚糖可显著增加愈伤组织中桃叶珊瑚甙 的产量。 诱导子是能够诱导植物细胞中一种或几种反应,并形成特征性自身防御 反应的分子。上世纪 90 年代初,美国 PHYTON CATAL YTIE 公司用短叶红豆杉诱 导愈伤组织并进行细胞悬浮培养,发现新培养的细胞能够合成紫杉醇等化合物, 在培养基中加入各种诱导子(如加入灭活的座线孢属和青霉菌属的孢子)可促使紫 杉醇从细胞中分泌出来,并有可能进行连续培养。近年来国内外学者对稀土作为 诱导子刺激次生代谢物的影响作了较为深入地研究。 元英进在长春花细胞培养中 发现,不同浓度的稀土元素对长春花生物碱的积累有较为明显的影响, 20mg/L 的镧稀土好于 40、60mg/L 稀土。胡国武、施中东等在红豆杉培养中发现不同浓 度硝酸铈对紫杉醇的合成影响较大, 特别是浓度为 1mmol/L 比对照增加 417 倍。 2.2.6 pH 值 培养基的酸碱度对次生代谢物的分泌很重要。盛长忠等的研究表明,南方红 豆杉愈伤组织的生长 pH5.5 时最为有利,但紫杉醇的含量较低,pH7.0 时,愈伤 组织的生长量有所下降, 而紫杉醇含量达 pH5.5 时的 2 倍多。 周立刚等研究指出, 人参细胞合成皂苷的高峰在细胞生长对数期稍后出现, 细胞生长和皂苷累积要求 有一个稳定而适宜的 pH 值环境。 3 环境条件的影响 3.1 光照 光对于次生代谢产物的积累具有重要的作用。朱新贵等研究发现,蓝光是促 进玫瑰茄悬浮细胞产生花青素的最有效单色光,红光和橙光无效,其它单色光随 其波长接近蓝光正效应增强。 元英进等研究单色光对长春花愈伤组织影响时发现, 蓝光对细胞生长和生物碱积累均有促进作用,红光和黄光不如白光,绿光有抑制

作用。杨振堂等认为增加光照能增加杜仲含胶量, 但愈伤组织增殖倍数降低, 杜 仲胶生产的总效率以暗培养为好。 3.2 温度 一般植物组织培养的温度在 20~25℃, 超过 30℃对生长具有明显的抑制作用。 次生代谢物的积累对温度的依赖性不同, 不同的培养材料略有差异。 Hazell 将 烟 草 的 两 个 品 种 NC2512 和 Marylandammoth 的愈伤组织分别在 20℃、 25℃ 和 30℃下培养,NC2512 在 20℃和 25℃下生长均较适宜,Maryland mammoth 则 在 20℃时增长较多;但从尼古丁的含量来看,两个品种均在 25℃时得率最高。 3.3 气体 维持细胞的存活和增殖对溶氧浓度有一定的要求, 一定范围提高溶氧浓度能 提高细胞生长速度, 但是过高的溶氧浓度对细胞生长有抑制作用。氧能促进某些 次生代谢产物的产生,如黄连细胞的黄连素含量随溶氧增加;溶氧在 10%~50% 之间, 狭叶毛地黄细胞转化β -甲基洋地黄毒苷的能力与溶氧正相关。但高溶氧 对另一些次生产物的积累不利, 如高溶氧使三角叶薯蓣薯蓣皂甙元含量减少。另 外, 一定浓度的 CO2 对有的植物细胞生长是有利的或必需的, 过高则抑制生长。 目前, 气体成分对植物细胞培养影响的研究仍处于初级阶段,它们的作用机理还 不明确,深入探索有关机理对优化培养条件、提高培养效率有重大意义。 4 展望 虽然细胞培养的成本较高, 但是由于一些天然植物有效成分含量低,或难于 进行化学合成, 或其天然产物具有无与伦比的效用,它们有着巨大的市场需求和 高昂的售价。 成功的植物细胞大规模培养不仅是解决天然植物资源匮乏、活性成 分不稳定等问题的有效途径, 而且有着丰厚的利润。植物细胞培养生产次生代谢 物的研究已经有了很大的进展, 但仍存在一些急需解决的问题,尤其是实验室研 究向商品生产的过渡、如何提高单位培养基中有用物质的产量等。 参考文献: [1]胡之壁.生物技术在传统药材中的应用前景[J].药学服务与研究, 2002, 2(l): 1-3 [2]陈学森,邓秀新,章文.培养基及培养务件对银杳愈伤组织黄酮产量的影响[J]. 园艺学报,1997, 24 (4),373-377. [3]Mischenkd N P,Fedoreyev S A,Glazunovv P,et.Anthraquinone production by callus cultures of Rubiacordifolia[J]. Fitoterapia ,1999,70:552-557. [4]徐咏梅,苏印泉,彭锋,等.杜仲乔林与叶林树皮中次生代谢物含量的比较[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版) ,2006,34(4):55-57. [5]钟青平,杨宁生,陈米慧.栀子愈伤组织生长和黄色素合成影响因素的研究[J]. 南昌大学学报,1994,18(3):256-262. [6]甘烦远,郑光植.红花愈伤组织的诱导生长及其 a-生育酚的作用[J].云南植物研 究,1991,13:189-195. [7] 郑穗平, 郭勇.主要营养成分对悬浮培养玫瑰茄细胞生长和花青素合成的影响 [J].广西植物,1998,18(1):70-74. [8]赵德修,汪沂,赵敬芳.不同理化因子对雪莲培养细胞中黄酮类形成的影响[J]. 生物工程学报,1998,14(3):259-264. [9]陈永勤,朱蔚华,吴蕴祺等.组培条件对云南红豆杉愈伤组织生长和形成紫杉 醇的影响[J].中国中药杂志,2000,25(5): 269-272. [10]陈浩,王玉书,杨素娟,等.大量元素对茶愈伤组织生长及儿茶素累积的影响

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