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蛋白质组学常见问题解答


1、iTRAQ 和 label-free 所用的搜库软件及其版本、定量分析软件是否一致? 答:搜库软件是不一致的:iTRAQ 数据采用 Mascot(2.3.0);label-free 则是 maxquant(1.4.1.2)。

2、iTRAQ/TMT 和 Label-free 技术都有哪些优缺点? 答:(1)定量准确性: iTRAQ/TMT 的定量准确性和重现性要明显优于 Label-free, Label-free 的样本 之间不能直接混合,导致定量的结果受到的影响因素多,因此定量结果的准确度较低; (2) 鉴定通量: Label-free 通量相对较高, 而 iTRAQ/TMT 由于标记基团的影响, 鉴定通量较 label-free 低; (3)修饰组学:label-free 定量,修饰肽段的富集(即 IP)是各组分开进行的,很可能造成富集的不 平行,最终造成定量不准确。因此,我们通过加入内标肽段来归一化以减少富集步骤引入的误差。而 iTRAQ/TMT 标记的修饰组, 修饰肽段的富集是各组标记、 混合后同时进行的, 所以不会存在富集的不平行。 因此,修饰组的定量,iTRAQ/TMT 方法的定量准确性优于 label-free; (4)其它:目前泛素化修饰定量组学只能用 label-free 来做。。

3、常用的蛋白质翻译后修饰参考数据库有哪些?

数据库名称

网址

修饰 类型

数据内容

SysPTM

http://lifecenter.sgst.cn/SysPTM/

多种

多种修饰的底物位 点

磷酸 PhosSNP http://phossnp.biocuckoo.org 化

影响磷酸化的 SNP

泛 素 人类中泛素化相关 hUbiquitome http://bioinfo.bjmu.edu.cn/hubi/ 化 CPLA http://cpla.biocuckoo.org 酶和底物位点

乙 酰 赖氨酸乙酰化底物



位点 70 种真核生物中泛 素与类泛素化相关 酶

泛素 UUCD http://uucd.biocuckoo.org 化

赖 氨 12 种赖氨酸修饰的 CPLM http://cplm.biocuckoo.org 酸修饰 底物位点 磷 酸 84 种真核生物中蛋 EKPD http://ekpd.biocuckoo.org 化 白激酶和磷酸酶

泛 素 哺乳动物泛素化底 mUbiSiDa http://reprod.njmu.edu.cn/mUbiSiDa 化 物位点

4、HPLC 分级的标准及作用是什么?是否组分越多通量越高? 答:HPLC 分级有两个目的:1.降低每个组分中蛋白的复杂度,利于质谱鉴定;2.增加每个组分中每个蛋白 的含量,同样利于质谱的鉴定。组分的多少和样品的复杂程度有关,如果分级数太少,没有达到降低样品 复杂度的作用, 如果分级数目太多, 反而会降低每个组分中每个蛋白的含量, 并且组分越多蛋白损失越大, 因此分级太少和太多都不利于质谱鉴定,我们公司的分级数目是经过系统考察得到的最优选择。

5、公司目前使用的蛋白浓度测定方法是什么? 答:我们的蛋白浓度测定使用 GE 公司的 2D Quant kit 完成,该试剂盒可耐受 8 M urea 和 2% SDS,明显 优于其它浓度测定方法。 并且我们在浓度测定后会取 20μg 蛋白通过 SDS-PAGE 来确定蛋白提取是否良好, 浓度测定是否准确。

6、公司采用何种蛋白酶进行蛋白酶解? 答:公司通常采用胰蛋白酶,并结合两步酶解法,酶解更充分。特殊样品我们会采取针对性的蛋白酶进行 酶解。

7、什么类型样品需要去除高丰度蛋白?我们采取什么策略去除高丰度蛋白? 答:需要去除高丰度蛋白的常见样品包括血清、血浆和脑脊液等富含白蛋白和免疫球蛋白的样品,我们一 般采用的去除高丰度蛋白试剂盒为:proteominer TM protein enrichment small-capacity kit (Bio-Rad)。

8、为什么目前不能用 iTRAQ 和 TMT 技术做泛素化修饰定量相关项目? 答: (1)泛素化一般发生在赖氨酸上,蛋白质的泛素化修饰就是蛋白质的赖氨酸残基位点与泛素分子的羧 基末端相互结合的过程。 泛素分子的 C 末端为 R-G-G 结构, 与赖氨酸发生了泛素化修饰后其侧链的氨基就 会带上-G-G-R-的结构。当加入 trypsin 酶解时,该侧链就会被切开,变成-G-G-NH2(赖氨酸上的); (2)而目前我们公司自主研发的泛素化抗体(PTM-1101),即赖氨酸双甘氨酸(glycine-glycine)抗 体, 只能识别含 GG 的肽段; 这也是 PTM-1101 能识别发生泛素化修饰的肽段而不能直接识别蛋白的原因; (3) iTRAQ 和 TMT 试剂均能标记肽段的 N 端以及侧链氨基的末端, 那么也因此可以标记在-G-G-NH2 上,iTRAQ 和 TMT 试剂都是大分子,分子量分别有三百多和二百多,远大于小小的-G-G-,因此这时 IP 时赖氨酸双甘氨酸(glycine-glycine)抗体就很难富集到该肽段,这就是该目前的瓶颈; (4)值得期盼的是,目前技术部正在探索一种克服该瓶颈的方法。另外,利用 label-free 技术来做修 饰定量的尝试在正在进行。相信不久泛素化修饰的标记定量和非标定量项目都可以做。

9、修饰定量组学需要做重复分析实验么? 答:严格的来说,任何实验为确保结果的准确性都需要生物学重复。从实验的准确性和文章发表的要求来 说,对于组织类样品(包括动物、植物),我们建议客户开展至少三个生物学重复。此外,对于组织类样 品,如果单一组织样品提取蛋白量不够或样本数量较多,可考虑同一属性样本的混合后分析。根据研究的 需要, 还要考虑对每一组织个体样品进行三次质谱分析的技术性重复。 对于细胞类样品 (包括微生物样品) , 我们建议客户开展至少三次质谱分析的技术性生重复。


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