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功能保健食品抗氧化功能


抗氧化功能保健食品的功效成分及检测 第十节 抗氧化功能保健食品的功效成分及检测
一、概述 自由基是指含有未配对的电子的原子、分子或基团,由于自由基中含有未 成对电子,具有配对的倾向,具有很高的活性。自由基若要稳定必须向邻近的原 子或分子夺取电子而使自己的电子成对, 但也因此使得电子被夺的那个原子或分 子成为新的自由基,引发连锁反应,这个过程就是“氧化”。 自由基是人体正常的代谢产物,正常情况下人体内自由基是处于不断产生 与清除的动态平衡中,人体内存在少量的氧自由基,不但对人体不构成威胁,而 且可以促进细胞增殖,刺激白细胞和吞噬细胞杀灭细菌,消除炎症,分解毒物。 自由基产生过多或清除过慢, 它通过攻击生命大分子物质及各种细胞, 会造成机 体在分子水平、 细胞水平及组织器官水平的各种损伤, 加速机体的衰老进程并诱 发各种疾病。常见的癌症、动脉硬化、糖尿病、白内障、心血管病、老年痴呆、 关节炎等疾病都被认为与自由基过多相关。 抗氧化剂是指能清除自由基或能阻断自由基参与的氧化反应的物质。抗氧 化剂的种类繁多, 可分为酶类清除剂和非酶类清除剂两大类。 酶类抗氧化剂一般 为抗氧化酶, 主要有超氧化物歧化酶(SOD) 、过氧化氢酶(CAT) 、谷胱甘肽 过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂一般包括黄酮类、多糖类、维生素 C、 维生素 E、β-胡萝卜素等物质。它们是能帮助捕获并中和自由基,从而祛除自由 基对人体损害的一类物质。国家食品药品监督管理局(SFDA)已批准具有抗氧化 功能的常用原料有:维生素 A、维生素 C、维生素 E,硒,OPC(低聚原花青素) , SOD(超氧化物歧化酶) ,辅酶 Q10,DHA,茶多酚,β-胡罗卜素,牛磺酸,螺 旋藻等。随着年龄的增长,机体内产生自由基清除剂的能力逐渐下降,从而减弱 了对自由基损害的防御能力,使机体组织器官容易受损,加速了机体的衰老,引 发一系列的疾病。为了防止此类现象的发生,可以人为地由膳食补充抗氧化剂, 从而达到防御疾病、延缓衰老的目的。 二、主要功效成分介绍 (一)酶类抗氧化剂(Enzymes antioxidant) 酶类抗氧化剂( ) 1、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD) 、超氧化物歧化酶( , ) 从 1938 年 Marn[1]等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算

起,人们对 SOD 的研究己有七十多年的历史。1969 年 Irwin Fridovich 和 Joe McCord[2]等重新发现这种蛋白,并且发现了它们的生物活性,弄清了它催化过 氧阴离子发生歧化反应的性质, 所以正式将其命名为超氧化物歧化酶, 英文简称 为 SOD[3]。 (1)性质及结构 ) SOD 是生物体内重要的抗氧化酶,广泛分布于各种生物体内,如动物,植 物,微生物等。SOD 是一类含金属的酶,按其所含金属辅基不同可分为含铜锌 (分子中同时含有 Cu 和 Zn) 、含锰或铁(分子中含有锰或铁)和含镍(分子中 含有镍)3 种[4](图 1、图 2) 。 含铜锌金属辅基的 Cu·Zn-SOD 是主要存在于真核细胞的细胞质中或高等植 物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙中。广泛存在于动物血液、牛肝、 猪肝、牛心、豌豆、麦叶等动植物组织中,是目前应用最广泛的一类酶。大肠杆 菌和其他一些原核细胞生物中一部分含有 Fe-SOD,一部分含有 Mn-SOD,而另 外一些两种抗氧化酶都含有。

图 1

Cu?Zn-SOD 结构图

图 2

Mn-SOD 结构图

(2)理化及生物学特性 ) SOD 是一种酸性蛋白酶, pH、 对 热和蛋白酶水解等反应较其他蛋白酶稳定。 其酶活性既取决于蛋白质,还取决于结合到活性部位的金属离子。 SOD 是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶,对氧自由基有强 烈清除作用,特别对于超氧阴离子(O2·) ,SOD 可将其催化歧化而生成 H2O2 和 O2,故 SOD 又称为清除超氧阴离子自由基的特异酶。 (3)SOD 的生理功能及应用 ) 作为一种体内自由基去除剂 SOD 能保护 DNA、蛋白质和细胞膜免遭 O2-·的

破坏作用, 减轻或延缓甚至治愈某些疾病,延缓因自由基损害生命大分子而引 起的衰老现象,如延缓皮肤衰老和老年斑的形成等;同时 SOD 还能提高人体对 自由基外界诱发因子的抵抗力;增强人体自身的免疫力;清除放疗所诱发的大量 自由基;消除疲劳等生理功能。SOD 在医疗上对治疗关节炎和类风湿性关节炎 疗效显著。此外,SOD 对治疗癌症、缺血后重灌流损伤、肺气肿、白内障、糖 尿病、贫血等疾病均有疗效。 SOD 在食品方面可作为功能性食品的功能因子或食品营养强化剂,有良好 的抗衰老、抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健强身的效果。国内外已把 SOD 作为食 品添加剂应用到多种食品中。 同时还可用富含 SOD 的原料加工制成功能性食品, 如大蒜饮料、刺梨 SOD 汁等。 (4)生物安全性 ) 超氧化物歧化酶(SOD)目前世界范围内大都从动物血液中提取,不但代价 昂贵,而且动物性 SOD 有排他性、不易常温保存等缺点,同时存在艾滋病等血 液病毒的交叉感染及其它潜在危险。 2、过氧化氢酶(catalase,CAT) 、过氧化氢酶( , ) (1)性质 ) 过氧化氢酶存在于细胞的过氧化物体内,可以催化氧化氢分解成氧气和水, 是生物防御体系的关键酶之一。H2O2 浓度越高,分解速度越快[5]。 过氧化氢酶是在 1811 年被过氧化氢(H2O2) 的发现者泰纳尔(Louis Jacques Thénard)首次发现。1900 年,Oscar Loew 将这种能够降解过氧化氢的酶命名为 “Catalase”,即过氧化氢酶,并发现这种酶存在于许多植物和动物中。1937 年, 詹姆斯·B·萨姆纳将来自牛肝中的过氧化氢酶结晶,并在次年获得了该酶的相对 分子质量。1969 年,牛的过氧化氢酶的氨基酸序列得以解出。1981 年其三维结 构得以解析[6](图 3) 。

图 3

过氧化氢酶结构图

(2)生物学功能 ) 过氧化氢酶广泛存在于能呼吸的生物体内,如植物的叶绿体、线粒体、内质 网、动物的肝和红细胞中,其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。 过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。 过 氧化氢酶也被用于食品包装,防止食物被氧化。在纺织工业中,过氧化氢酶被用 于除去纺织物上的过氧化氢。近年来,过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面 部护理中加入了该酶和过氧化氢,目的是增加表皮上层的细胞氧量。 3、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX) 、 谷胱甘肽过氧化物酶( , ) (1)性质 ) 谷胱甘肽过氧化物酶为生物体中清除过氧化氢和其他有机过氧化物的脱毒 酶。 谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX) 是第一个在哺乳动物体内发现的含硒酶 (图 4) , 它于 1957 年被 Mills[7]首先发现, 1973 年由 Flohe 和 Rotruck 两个研究小组确立 了 GPX 与硒之间的联系。

图 4

谷胱甘肽过氧化物酶结构图

(2)生物学功能:谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体内广泛存在的一 )生物学功能: 种重要的过氧化物分解酶。硒是 GSH-Px 酶系的组成成分,它能催化 GSH 变为 GSSG,使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物,同时促进 H2O2 的分解,从 而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。 (二)原花青素 1、结构与性质 、 原花青素是由不同数量的儿茶素(catechin)或表儿茶素(epicatechin)结合 而成。最简单的原花青素是儿茶素、或表儿茶素、或儿茶素与表儿茶素形成的二 聚体,此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体。按聚合度的大小,通常将二~五

聚体称为低聚体(简称 OPC) ,将五聚体以上的称为高聚体(简称 PPC) 。 原花青素是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮, 是目前国际上公认的清除 人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。 一般为葡萄籽提取物或法国海岸松树皮提 取物。原花青素一般为红棕色粉末,气微、味涩,溶于水和大多有机溶剂。 2、生物学功能[8, 9] 、 原花青素是当今医学界发现的最安全高效的抗氧化剂、 自由基清除剂和紫外 线吸收剂,广泛应用于保健食品、药品和化妆品。其抗氧化能力是维生素 E 的 50 倍、维生素 C 的 20 倍,它能有效清除体内多余的自由基,保护人体细胞组织 免受自由基的氧化损伤,具有抗心血管疾病、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抗炎、 抗疲劳、 改善视觉功能等药理作用, 可用于治疗动脉粥样硬化、 高血压、 冠心病、 肿瘤等疾病。 (1)通过三条途径保护人体的血液循环系统:清除血液中存在的氧自 由基;帮助机体阻止氧自由基的生成;增强血管壁的完整性 (2)阻抑胶原酶和弹性蛋白酶对结缔组织的降解作用,因而有利于保 持皮肤的弹性,发挥抗皮肤衰老的功效。 (3)能增强眼底视网膜毛细血管和四肢末梢毛细血管的微循环。 (4)通过维持血管的健康和改善微循环,使各器官和组织获得较充足 的血液供应。 (5)能增强免疫功能,表现在花青素提高喂酒精的小白鼠和感染逆转 录病毒的小白鼠细胞介素 2 的免疫应答能力。 (6)花青素还可增强维生素 C 的功效,延长维生素 C 在人体内发生功 效的时间。 (7)花青素在水中的溶解性非常好,口服后吸收好,进入人体内起效 快,而且作用时间持久。 4、安全性:Masquelier 教授和许多科学家利用花青素,已经做了多年的 、安全性: 各种临床、化验、毒性和药物动力学的研究。多种动物实验和实验系统研究 的结果证明,花青素无毒、无致突变性、无致癌性、无致畸胎性、无致敏性, 因此花青素是安全的。

(三)类胡萝卜素(Carotenoids) 类胡萝卜素( ) 类胡萝卜素(Carotenoids)是一类重要的天然色素的总称,普遍存在于 动物、高等植物、真菌、藻类中的黄色、橙红色或红色的色素之中[10-11]。 类胡萝卜素可分 3 类:①胡萝卜素,羟类化合物,特点是溶于石油醚。 多数都具有 CH 的化学实验式。最常见的有蕃茄红素和 α,β,γ-胡萝卜 素。②叶黄素,亦称胡萝卜醇,是胡萝卜素的非酸性氧衍生物。含氧基 团有羟基、酮基、醚基、环氧基和类呋喃基。常见的有隐黄质、玉米黄 质、叶黄素、辣椒红、辣椒玉红素、虾青素、虾红素、海胆烯酮、蒲公 英黄质、新黄质、柠黄质、紫菌红素丁等。③类胡萝卜素酸,胡萝卜素 的羧酸衍生物,能溶于碱溶液。例如:藏花素、胭脂树橙和红酵母红素 等。 1、番茄红素(Lycopene) 、番茄红素( ) (1)性质:番茄红素又称 ψ-胡萝卜素,属于异戊二烯类化合物,是类胡萝 )性质: 卜素的一种。番茄红素(lycopene) 是一种脂溶性不饱和碳氢化合物, 是类胡萝卜 素的一种, 分子式为 C40H56, 相对分子质量 536.85, 熔点 174 ℃( 反式) , 与 β-胡 萝卜素是同分异构体。分子结构见图 7, 番茄红素难溶于甲醇、乙醇, 可溶于乙 醚、石油醚、己烷、丙酮, 易溶于氯仿、二硫化碳、苯等有机溶剂[12]。
CH3 H3C
CH3 H3C CH3 CH3

H3C
CH3 CH3

CH3

图 5

番茄红素分子结构图

(2)生物学功能:研究发现,番茄红素具有优越的生理功能,它不仅具有 )生物学功能: 抗癌抑癌的功效,而且对于预防心血管疾病、动脉硬化等各种成人病、增强人体 免疫系统以及延缓衰老等都具有重要意义。番茄红素具有抗氧化、抑制突变、降 低核酸损伤、减少心血管疾病及预防癌症等多种保健功能。① 抗氧化延缓衰老。 番茄红素抗氧化能力是维生素 E 的 100 倍,维生素 C 的 1000 倍。是自然界最强 的延缓衰老的抗氧化剂。②防癌抗癌,辅助抑制肿瘤。番茄红素能清除导致细胞 癌变的自由基,达到预防的作用。对已形成的肿瘤,可促进细胞间隙传输信号,

接触抑制、分化诱导癌细胞。③前列腺保健,提高男性生育能力。④调节血脂, 预防心脑血管疾病。⑤抗辐射,美容美肤。⑥ 乳房子宫保健。番茄红素可促进 女性乳房健康发育,减少乳腺癌发生几率。 (3)生物安全性:番茄红素雌、雄小鼠 LD50 均大于 20.0g/kg.属无毒物质; )生物安全性: Ames 试验、 微核试验和精子畸形试验结果均为阴性; 大鼠 30 天喂养试验结果显 示番茄红素 30 天喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用[13]。 2、虾青素(Astaxanthin) 、虾青素( ) (1)性质及结构:虾青素是一种端基为酮基类胡萝卜素,化学名称为 3,3’)性质及结构: 二羟基-4, 4’-二酮基-β, β’-胡萝卜素,分子式为 C40H53O4,又名虾黄素,虾黄质, 龙虾壳色素,是一种非维生素 A 源类胡萝卜素[14],分子结构见图 8。虾青素是从 河螯虾外壳,牡蛎和鲑鱼中发现的一种红色类胡萝卜素,在体内可与蛋白质结合 而呈青、蓝色。有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病作用[14]。
O OH

HO O

图 6

虾青素的分子结构图

(2)生物学功能:虾青素是类胡萝卜组的一种。也是类胡萝素合成的最高 )生物学功能: 级别产物, β-胡萝卜素、叶黄素、角黄素、番茄红素等都不过是类胡萝卜素合 成的中间产物,因此在自然界,虾青素具有最强的抗氧化性[15]。 主要功能有:①抗癌作用:虾青素对人大肠癌 SW116 细胞的增殖有明显抑 制作用,对膀胱癌、肝癌、口腔癌、肺癌和由紫外线引起的皮肤癌有一定的抑制 作用。②抗氧化作用:虾青素具有超强的抗氧化作用,其抗脂肪氧化的能力比 β胡萝卜素高 10 倍,比维生素 E 高 550 倍,是 OPC 的 20 倍,故称为超级抗氧化 剂。③虾青素能增强抗体反应和增强体液免疫的功能。④对心血管系统有显著的 保护作用。⑤虾青素极易通过血脑屏障,故能有效地预防与年龄相关的视黄斑退 化和中枢神经系统疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病和脊髓损伤) 。 (3)生物安全性:人分别服用 3.6 mg/d、7.2mg/d、14.4 mg/d 剂量的虾青素 )生物安全性: 都没有出现不良反应,而且血浆 LDL 氧化的速率随剂量增加而减慢。研究表明 虾青素无毒副作用[16]。

3、叶黄素(Xanthophylls) 、 叶黄素( ) (1)性质及结构:叶黄素是 α-胡萝卜素的衍生物, 分子式: C40H56O2 , 相对 )性质及结构: 分子质量: 568.85。它含有二个不同的紫罗酮环: β-和 ε-紫罗酮环, 在各紫罗酮环 的第 3 个碳原子上存在一个功能性羟基。在 C23、C23’和 C26’处有三个不对称 中心, 因此理论上有 8 种立体异构体[17], 分子结构见图 9。 叶黄素又名“植物黄体 素”,在自然界中与玉米黄素(Zeaxanthin)共同存在。叶黄素与玉米黄素是构成 玉米、蔬菜、水果、花卉等植物色素的主要组分,也是构成人眼视网膜黄斑区域 的主要色素[18-19]。
OH H

HO

图 7

叶黄素的分子结构图

(2)生物学功能:叶黄素能抑制活性氧自由基的活性,阻止活性氧自由基 )生物学功能: 对正常细胞的破坏。叶黄素可通过物理或化学淬灭作用灭活单线态氧,从而保护 机体免受伤害,增强机体的免疫能力。另外叶黄素还能改善老年人视力衰退;预 防老年性黄斑变性所导致的盲眼病;保护由日光、电脑等所发射的紫外线所导致 的对眼睛和视力的伤害作用;降低白内障的发生率;减轻体内和皮肤退行性老年 斑的形成;调节血脂;延缓动脉硬化;抗癌作用等作用。 (3)生物安全性:叶黄素雌、雄小鼠经口 LD 均大于 21.5mg/kg,根据急性 )生物安全性: 毒性(LD )剂量分级标准,属无毒级。遗传毒性试验(Ames 试验、骨髓细胞微核 试验、小鼠精子畸形试验)均为阴性,表明叶黄素无致突变作用。在大鼠 30 d 喂 养试验中未见动物健康状况、血液学、血液生化学和器官组织形态的异常变化。 (四)维生素类(Vitamins) 维生素类( ) 1、维生素 E(Vitamin E) 、 ( ) (1)性质及结构:维生素 E(Vitamin E)是一种脂溶性维生素,又称生育 )性质及结构: 酚,是最主要的抗氧化剂之一[20]。化学式:C29H50O2;相对分子质量:430.69; 分子结构见图 8;外观:黄色油状液体;密度:0.950 g/cm?;熔点:2.5℃~3.5 ℃; 沸点:200℃~220 ℃。

图 8

维生素 E 的分子结构图

(2)生物学功能:维生素 E 能促进性激素分泌,使男子精子活力和数量增 )生物学功能: 加;使女子雌性激素浓度增高,提高生育能力,预防流产,还可用于防治男性不 育症、烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面。近来还发现维 生素 E 可抑制眼睛晶状体内的过氧化脂反应,使末稍血管扩张,改善血液循环, 预防近视发生和发展。维生素 E 可清除自由基,防止油脂氧化和阻断亚硝胺的 生成,故在提高免疫能力,预防癌症等方面有重要作用,同时在预防和治疗缺血 再灌注损伤等疾病有一定功效[21]。 (3)生物安全性:美国和欧盟有各自的维生素 E 安全评价体系。美国采用 )生物安全性: 的是 HACCP 评价体系,将动物试验中高剂量维生素 E 造成的出血(小鼠的出血 部位为: 肠道、 尿道、 脑膜和眼眶)作为最高耐受剂量的关键控制点。 500 mg/(kg 以 BW ·d)为 LOAEL(最低有害作用水平),并通过安全系数的换算,得出成年人每 日维生素 E 的可耐受最高摄入量为 1000 mg/d。 人的 NOAEL(无明显副作用水平) 为 540 mg/d,通过安全系数换算,成年人每天摄入维生素 E 的可耐受最高摄入 量为 270~300 mg/d。 2、维生素 C(Vitamin C) 、 ( ) (1)性质及结构:分子式:C6H8O6;相对分子质量:176.12;分子结构式 )性质及结构: 见图 11;酸性,在溶液中会氧化分解;外观:无色晶体;熔点:190℃~192℃; 紫外吸收最大值:245 nm。 维生素 C 又称为抗坏血酸, 在自然界中存在还原型抗坏血酸和氧化型脱氢抗 坏血酸两种形式。 抗坏血酸通过逐级供给电子而转变成半脱氢抗坏血酸和脱氢抗 坏血酸,在转化的过程中达到清除 O2-·、·OH、ROO·等自由基的作用。维生素 C 具有强抗氧活性,能增强免疫功能、阻断亚硝胺生成、增强肝脏中细胞色素酶体 系的解毒功能。人体血液中的维生素 C 含量水平与肺炎、心肌梗塞等疾病密切 相关[22]。

图 9

维生素 C 的分子结构图

(2)生物学功能:维生素 C 的主要作用是对抗游离基,有助于防癌,降低 )生物学功能: 胆固醇,防止坏血病;提高免疫力,预防心脏病、中风,保护牙齿和牙龈等。另 外,坚持按时服用维生素 C 还可以使皮肤黑色素沉着减少。 (3)生物安全性:维生素 C 的毒性很小,但服用过多仍可产生一些不良反 )生物安全性: 应。有报告指出,成人维生素 C 的每日摄入量超过 2 g,可引起渗透性腹泻。当 每日摄入量小于 1g 时, 一般不引起高尿酸症, 当超过 1g 时, 尿酸排除明显增加。 研究发现,每日服用 4g 维生素 C,可是尿液中尿酸的排出量增加一倍,并因此 而形成尿酸结石增多。过量的维生素 C 还可引起子宫颈粘液中糖蛋白二硫键改 变,阻止精子的穿透,造成不育。妊娠期服用过量的维生素 C,可能影响胚胎的 发育。 3、维生素 A(Vitamin A) 、 ( ) (1) 性质及结构:维生素 A1 主要存在与动物肝脏、血液和眼球的视网膜 ) 性质及结构: 中, 分子式 C20H30O; 熔点: 64℃; 维生素 A2 主要在淡水鱼中存在, 分子式 C20H28O; 熔点:17℃ ~19℃。维生素 A 是人体必需的 13 种维生素之一,是一种脂溶性抗 氧化剂,在人体中可以维持视力并且促进骨骼成长[23]。 (2)生物学功能:维生素 A 有一定的抗氧化作用,可以中和有害的游离基; )生物学功能: 维持视觉,维生素 A 可促进视觉细胞内感光色素的形成;促进生长发育,视黄 醇也具有相当于类固醇激素的作用,可促进糖蛋白的合成;维持上皮结构的完整 与健全;加强免疫能力;维生素 A 有助于维持免疫系统功能正常,能加强对传 染病特别是呼吸道感染及寄生虫感染的身体抵抗力。 (3)生物安全性:长期或大量服用维生素 A,可引起中毒反应。成人一次 )生物安全性: 用药超过 50 万单位,或儿童超过 30 万单位,可引起急性中毒,表现为头痛、烦 躁、多汗、食欲不振等。不论成人还是儿童,连续用药超过 6 个月,皆可引起慢 性中毒。

三、主要功效成分的检测方法综述 主要功效成分的检测方法综述 1、免疫学方法 、 将 GPX3 抗体包被于 96 孔微孔板中,制成固相载体,向微孔中依次加入标 准品和标本,其中的 GPX3 与连接于固相载体上的抗体结合,洗板之后加入生物 素化的 GPX3 抗体,将未结合的生物素化抗体洗净后,加入 HRP 标记的亲和素, 再次彻底洗涤后加入底物(TMB)显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色, 并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 GPX3 呈正相关。用 酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度,计算样品中谷胱甘肽过氧化物酶的浓度。 2、分光光度法 、 细胞色素 C 还原法[24](McCord 法)测定 SOD:pH 7.8,0.3 mol/L 磷酸钾缓冲 液 0.5 mL(含 1×10-4 mol/LEDTA),6×10-5 mol/L 氧化型细胞色素 C 液 0.5 mL, 0.3 mmol/L 黄嘌呤液 0.5 mL, mL 重蒸水, 1.3 在预保温 10min, 最后加入 1.7×10-3 u/mg.port 的黄嘌呤氧化酶 0.2 mL,并立即计时,速率变化在 2 min 内有效,控 制黄嘌呤氧化酶浓度,使其在 550 nm 的吸光度为 0.25/min,测定 SOD 活性时, 加入 0.3 mLSOD 被测液,重蒸水相应减少到 1.0 mL,根据抑制程度,计算活性。 邻苯三酚自氧化法[25](简称 Marklund 法)测定 SOD:邻苯三酚发生自氧化 测定:50 mmol/L 的 Tris-HC1(pH 8.2)缓冲液 3 mL,预热至 25 ℃,加入 l0 ?L 50 mmol/L 的邻苯三酚,充分摇匀,以缓冲液做空白对照,每隔半分钟测一次吸光 度。同样条件,加入 l0 ?L 待测 SOD 液,读取其吸光度。 羟胺发色法[26]测定 SOD:将 10 mmol/L 邻苯三酚,10 mmol/LEDTA-Na2, 40 mmol/L 盐酸羟胺和重蒸水按 1:l:4:4 配制反应液, 90 mg/L 氨基苯磺酸和 1.5 将 mg/L N-甲萘基二氨基乙烯按 1:1 配成显色液,取 0.95 mL 0.1mol/L 的 Tris-HC1 和 0.05 mLSOD 待测液,再加 0.1 mL 反应液,室温反应 15 min,再加 2.0 mL 显 色液,550 nm 处比色。 钼酸铵比色法测定 CAT: 过氧化氢酶(CAT)可催化 H2O2 分解生成 H2O 和 O2, 体系中残留的 H2O2 再与钼酸铵作用生成黄色化合物,反应在很短时间即可达到 平衡,并至少可稳定 60 min,其生成的黄色化合物在 405 nm 处所呈现的吸光度 取决于 H2O2 和钼酸铵的浓度,根据过氧化氢酶分解 H2O2 的多少间接测定其含 量。

改良比色法测定 CAT:CAT 分解 H2O2 的反应可通过加入醋酸重铬酸钾而迅 速中止,剩余的 H2O2 与醋酸重铬酸钾在加热条件下反应生成铬酸醋酸钾,在波 长 570nm~610 nm 进行比色测定铬酸醋酸钾的生成量,可反映 H2O2 的含量。 谷胱甘肽过氧化物酶测定通常采用二硫代二硝基苯甲酸法,其原理是 GSH 和二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)作用生成 5-硫代二硝基苯甲酸阴离子。该离子 呈现较稳定的黄色,在 412 nm 测定其吸光度,即可计算出 GSH 的量,以单位时 间内 GSH 减少量来表示 GSH-Px 活力。 GST 具有催化 GSH 与 1 氯-2,4-二硝基苯 结合的能力,GSH+C6H3(NO2)2Cl (1-巯基-2,4-二硝基苯)+HCl,在一定时间内, 活性高低与 GSH 的减少量呈线性关系。由于上述反应在非酶条件下仍能进行, 故计算酶活力时,必须扣除非酶反应所引起的 GSH 减少量。 杨万政等[27]用分光光度法测定了沙棘油中类胡萝卜素的含量,检测波长为 445 nm。张英宣等[28]采用改进的分光光度法测定了胡萝卜中类胡萝卜素的含量。 在 5.00 mg/kg~100 mg/kg 浓度范围内,平均回收率为 99.0%,相对标准偏差小于 5%。丁贵平等[29]建立了分光光度法测定保健食品中微囊化 β-胡萝卜素,采用正 交设计确定了提取 β-胡萝卜素的最佳条件,样品经酶解,用氯仿提取后,转至环 已烷溶剂中,在 454 nm 波长下测吸收值,通过 E 值计算其含量。方法的回收率 为 92.5%~96.6%,相对标准偏差为 2.4%~2.6%。Jafar Muhammad EL-Qudah[30]用 分光光度法测定了约旦日常膳食中的总类胡萝卜素含量。Effat Souri 等[31]用三阶 导数分光光度法同时测定了花色素甙和 β-胡萝卜素,花色素甙和 β-胡萝卜素的 测定波长分别为 625 nm 和 540 nm,检出限分别为 125 ?g/mL 和 6.25 ?g/mL。 分光光度法是测定番茄红素的常用方法。 番茄红素在不同的有机溶剂里均有 类似的吸收峰, 最大吸收峰的波长约为472 nm ~ 484 nm[32], 人们经常将样品溶 解在石油醚或正己烷中, 在最大吸收波长下用分光光度计测定溶液的吸光度, 以此来表征番茄红素的浓度, 用摩尔消光系数计算其中番茄红素的含量[33-34]。 程杨[35]采用浸提法从试样中提取番茄红素,用苏丹Ⅰ标准品代替番茄红素 标准品,通过紫外分光光度法测定试样中番茄红素的含量。通过比较试验分析石 油醚、乙烷、丙酮和氯仿4 种不同有机试剂对番茄红素的提取效果,确定最佳提 取工艺为:用甲醇洗脱试样中的黄色素,用氯仿作为提取溶剂提取试样中的番茄 红素,提取率为4.459 mg/g。郑丽丽[36]采用苏丹?代替番茄红素做标准品制备标

准曲线,在波长485 nm处测定番茄红素含量, 回收率99.09 %,RSD 2.0 %。 以苏丹红代替番茄红素作为标准品,绘制标准曲线,用以测定番茄红素的含 量以及用石油醚或者正己烷为溶剂,在472 nm 比色测定其吸光度,用摩尔消光系 数来计算其中番茄红素的含量。这两种方法不需要标准品,但其系统误差较大, 同时不能排出β-胡萝卜素等其他类胡萝卜素的干扰。张连富[37]从番茄红素及β胡萝卜素的紫外吸收光谱的差异入手,以2 %二氯甲烷为溶剂,以502 nm为检测 波长,建立了番茄红素的测定方法,避免了其他类胡萝卜的干扰并将其转化为用 消光系数来计算的形式。 尚德军[38]利用一种抽提装置建立了一种快速测定番茄红素的方法,并与国 家标准番茄红素测定方法GB14215-1993进行了比较。结果表明该方法与国家标 准方法相比,测量结果偏高。 马亚军等[39]建立了葡萄籽提取物中原花青素的硫酸高铈盐分光光度法,该 方法是基于原花青素与 Ce4+在强酸性介质中反应生成无色的 Ce3+,通过测定黄 色高铈盐的吸光度,间接测定原花青素的原理。Ce4+在 319 nm 波长处具有最大 吸收。该方法的线性范围为 0.12?g/mL~10?g/mL, RSD 为 0.98%~1.1%,回收率 为 97.2%~102.8%, 检出限为 0.04 ?g/ mL。 傅武胜[40]建立了含葡萄糖提取物的保健品中原花青素的铁盐催化比色法, 并对可能存在的干扰进行了探讨。 溶液中原花青素稀盐酸的水解作用和硫酸铁铵 的催化作用下,转变为红色的花青素,550nm 处比色测定。在 26.00 ?g~416.0 ?g 范围内,原花青素的浓度与吸光值 OD550 呈线性关系,最低检出限为 4 ?g。 3、荧光法 、 Fe2+和 H2O2 在酸性介质中(pH2.5)经 Fenton 反应产生·OH,·OH 与喹啉经芳 香羟基化反应,羟基化喹啉在碱性介质中呈现出很强的荧光(λex= 360 nm,λem = 440 nm ), 荧光强度的增量与 H2O2 的量成正比。 毛玉霞等[41]发现过氧化氢酶将 H2O2 分解为 H2O 和 O2, Fenton 反应有显著的抑制作用, 对 进而抑制芳香羟基化反应, 导致体系的荧光强度降低. 荧光强度的降低程度与 CAT 活性有良好的定量相关 性。 4、化学发光法 、 化学发光法 化学发光法[42]测定 SOD: 25℃试管中先加入 0.6 mL pH 5.6 磷酸盐缓冲液, 在

0.1 mL 1 mmol/LEDTA-Na2 溶液,0.1 mL 1mmol/L 黄嘌呤溶液,5 ?mol/L 的测试 管中再加 10 ?L 待测样本(对照管中加入 10 ?L 生理盐水,放入发光仪测试室), 最后加入 100 ?L 黄嘌呤氧化酶应用液,启动反应。 鲁米诺(luminol)在一定条件下与 H2O2 及 Co2+等金属离子共存时发出强烈 的蓝光,当样品中有 CAT 存在时,基质的 H2O2 将被分解,由 H2O2 所引起的化 学发光强度减弱计算总 CAT 酶活性。 5、薄层色谱法 、 薄层色谱法测定维生素 E 只适用于 α-E。试样经皂化,使维生素 E 游离,用 乙醚抽提出不可皂化物,用薄层层析法分离出 α-E,使其与三氯化铁溶液反应, 三价铁被还原为二价铁,二价铁与 α,α’-联氮苯反应生成铬盐,测定其显色深度, 求出 α-维生素 E 的含量。 杨万兴等[43]建立了高效薄层扫描法测定维生素 E 霜中维生素 E 含量的方法。 以乙酸乙醋、乙醚、冰醋酸(7:3:0.2)为展开剂, 采用双波长反封锯齿法,测维生 素 E 时 λs=285 nm,λr=285 nm。加样回收率为 98.7%,RSD 为 2.5%。 6、毛细管电泳法 、 电泳染色定位法的基本原理是根据光化学法与 NBT 还原法。电泳则采取垂 直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。既可采用 SOD 活性正染色(呈现棕色区带)也可采取 SOD 活性负染色(呈现无色透明区带)。根据凝胶上电泳分离的 SOD 区带的着色 深浅与面积大小, 对样品进行半定量分析, 也可制作校正曲线计算样品中的 SOD 含量。 Ana Maria Adalid 等[44]用毛细管电色谱法分析测定了番茄中的番茄红素和 β胡萝卜素含量, 方法的检出限和重现性分别为 1.6 ?g/mL 和 7.2%, 方法可以很好 的应用于番茄及其制品中番茄红素和 β-胡萝卜素含量的测定。Herrero-Martínez 等[72]用毛细管电泳法测定了蔬菜中的 β-胡萝卜素、番茄红素和叶黄素的含量, 可以很好的应用于测定胡萝卜、番茄、菠菜和玉米中的 β-胡萝卜素、番茄红素和 叶黄素的含量。 7、高效液相色谱法 、 周林宗等[45]研究了固相萃取富集和预分离微柱高效液相色谱快速测定枸杞 样品中类胡萝卜素的方法,方法采用用二极管矩阵检测器检测,检测波长为 450

nm, 枸杞样品中的几种类胡萝卜素在 5 min 内可达到基线分离, 方法标准回收率 为 95%~103%,RSD 为 1.9%~2.6%。章清等[46]建立血清中叶黄素、β-胡萝卜素、 番茄红素的高效液相色谱测定法,检测波长为 450 nm,叶黄素、番茄红素和 β胡萝卜素的, 回收率分别为 97.98%~102.80%、 97.24%~101.76%、 98.56%~100.4%, 日内和日间 RSD 分别为 2.26%和 3.02%、4.34%和 5.02%、1.81%和 2.52%。标准 曲线的线性范围为 0.05 ?g/mL~2.00 ?g/mL。张玉珍等[47]建立了虾青素的含量及 有关物质的反相高效液相色谱测定方法,检测波长为 482 nm,虾青素在 6 ?g/mL~36 ?g/mL 范围内线性良好,检出限为 11 ng/mL,平均回收率为 100%, RSD 为 0.29%。Amin Ismail 等[48]用高效液相色谱法测定了 5 种蔬菜在不同种植 方式下维生素 C、β-胡萝卜素和叶黄素含量的变化。 李国营等[49]建立了应用高效液相色谱法(HPLC)测定谷子种质资源中维生素 E 的检测技术, 并应用统计学原理对方法的精密度、准确度、再现性等进行了较全 面的考察和评价。利用该方法对 400 份谷子种质资源进行了鉴定、评价, 并筛选 出一批高维生素 E 含量的种质资源。 刘胜辉等[50]用高效液相色谱法测定了几种水果中的维生素 C, 并研究了不同 的色谱条件、不同的提取液对测定结果的影响,结果表明:用 0.25%的偏磷酸浸 提样品以及作为流动相效果较好,测得 Vc 的保留时间为 4.35 min,回收率为 92%~98%,线性范围 0.0001 mg/mL~1.68 mg/mL。何优选等[51]建立了一种高效液 相色谱测定沙田柚果肉中维生素 C 含量的方法。检测波长为 265 nm,线性范围 40 ?g/mL~320 ?g/mL,回收率为 99.31%~101.87%。谢志鹏等[52]建立并应用了一 种 集 高 效 液 相 色 谱 (HPLC)、 流 动 注 射 (FI) 和 电 化 学 发 光 三 者 优 点 于 一 体 的 HPLC-FI 联用电化学发光分析新方法,方法基于将在线恒电流电解产生 ClO-与 Luminol 构成了较强的化学发光体系, 而维生素 C 对该化学发光体系有抑制作用, 与流动注射技术相结合。 该方法在维生素 C 的浓度为 1.0×10-8 mmol/mL~3.0×10-6 mmol/mL 之 间 呈 良 好 的 线 性 , 检 出 限 达 到 3.0×10-9 mmol/mL , 回 收 率 93.6%~106.8%。张云楚等[53]建立了高效液相色谱-示差折光检测法测定维生素 C 葡萄糖注射液含量的方法,维生素 C 和葡萄糖分别在 0.10 g/L~1.00 g/L 和 0.25 g/L~2.50 g/L 的浓度范围内呈线性,两者的平均回收率分别为 100.2%与 99.8%, RSD 分别为 1.5%与 1.0%。

GB/T 22249-2008《保健食品中番茄红素的测定》[54]适用于作为主要功效成 分添加于保健食品中番茄红素的测定。 其方法原理是利用番茄红素易溶于二氯甲 烷等溶剂的理化特性,试样经焦性没食子酸-二氯甲烷溶液提取,定容,过滤后 进高效液相色谱仪,经反相色谱分离后,由紫外检测器检测,根据保留时间和峰 面积进行定性和定量。当取样量1.0 g时,定容至10 mL,进样量10 ?L时,检出限 3×10-4 g/kg,定量限1×10-3 g/kg。线性范围为0.200 ?g/mL~20.0 ?g/mL。 赵平娟[55]建立了番茄及其制品中番茄红素高效液相色谱法测定方法。样品 经丙酮加石油醚(2:1) (含0.1 %BHT) 提取,色谱柱采用(4.6×250 mm ,i.d. 5?m) , 流动相为甲醇-乙腈-二氯甲烷(体积比25:70:5) ,柱温为室温,检测波长为473 nm , 番茄红素的保留时间为6 min。在3mg/ kg ~ 24 mg/ kg添加水平, 回收率为87.8% ~99.9% , 相对标准偏差为2.3%~5.8%。黄声岚[56]建立了RP-HPLC法快速测定番茄 红素粉剂中的番茄红素。该法采用Waters Nova-Pak C18 (3.9 mm×150 mm id. 4 ?m),以甲醇:乙腈(80:20)为流动相,470 nm为检测波长,测得番茄红素软胶囊中 番茄红素的平均含量1.26 % ,RSD为2.5 %;平均加标回收率97.7 %, RSD为 2.3 %。张志强[57]探讨了HPLC法测定番茄红素的方法,结果表明最佳的色谱条件 为流动相采用乙腈:四氢呋喃:二氯甲烷=85:3.4:1.6的体系、检测波长472 nm,在 此条件下可很好的分离番茄红素,回收率96%~102%。 Ding-Qiang Lu[58]建立反相高效液相色谱法测定番茄红素微胶囊中番茄红素 含量的方法。该法采用反相高效液相色谱法,色谱柱为美国Alltech Alltima C18( 4.6 mm×250 mm, 5 ?m) , 流动相为甲醇-四氢呋喃-水(66:30:4) , 流速为1.5 mL/min ,检测波长为472 nm。结果线性范围为3.6 ?g/mL ~18 ?g/mL ,平均回收率 为99.81%~101.06% , RSD为1.12%~1.83%。 张丽薇[59]采用高效液相色谱法测定保健食品中的番茄红素(胶囊或片剂)。 样品用水溶解破膜,以乙酸乙酯提取,用 HPLC 检测番茄红素的含量。本方法线性 范围为 0.0 ?g/mL~10.0 ?g/mL,最低检出浓度为 0.1 ?g/mL,加标回收率为 98.36%~104.8%,相对标准偏差为 2.3 %~4.2 %。方法操作简单,灵敏度高,线性 范围宽。 8、质谱法 、 B. Stephen Inbaraj 等[60]用 HPLC-DAD-APCI-MS 法测定了枸杞中的类胡萝卜

素及其酯的含量,方法测定了 11 种类胡萝卜素和 7 种类胡萝卜素酯。Li H 等[61] 用 LC-APCI-MS 法测定鱼子中的类胡萝卜素和维生素 A 的含量,同时方法还研 究了测定过程中基质效应的影响。A. Garrido Frenich 等[62]用 LC-MS 法测定了蔬 菜水果中的维生素 C 和类胡萝卜素含量。 四、功效成分检测方法 (一)保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定 修改的 Marklund 方法 保健食品中超氧化物歧化酶( )活性的测定-修改的 1、试剂 、 A 液:pH8.20 0.1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris-)-盐酸缓冲溶液(内

含 1 mmol/LEDTA·2Na) 。 B 液:4.5 mol/L 邻苯三酚盐酸溶液。称取邻苯三酚 56.7 mg 溶于少量 10 mmol/L 盐酸溶液,并定容至 100 mL。 2、测定方法 、测定方法 邻苯三酚自氧化速率测定 在 25℃左右, 10 mL 比色管比色管中依次加入 于 A 液 2.35 mL, 蒸馏水 2.00 mL, 液 0.15 mL。 B 加入 B 液立即混合并倾入比色皿, 分别测定在 325 nm 波长条件下初始和 1 min 后吸光值,二者之差即邻苯三酚自 氧化速率 ?A325(min-1)为 0.060。 样液和 SOD 酶液抑制邻苯三酚自氧化速率按上述步骤分别加入一定量样液 或酶液使抑制邻苯三酚自氧化速率为 1/2?A325 (min-1) 即 ?A’325 , (min-1) 0.030。 为 SOD 活性测定加样程序见表 2。
表 1 试液 A 液/mL 蒸馏水/mL 样液或 SOD 液/?L B 液/mL SOD 活性测定加样表 空白 2.35 2.00 — 0.15 样液 2.35 1.80 20.0 0.15 SOD 液 2.35 1.80 20.0 0.15

液体样品按式(1)计算: ?A325 ? ?A '325 × 100% ?A325 1 SOD 活力(U/mL)= × 4.5 × × D ..........................(1) 50% V 式中: U/mL—SOD 酶活力单位;

?A325—邻苯三酚自氧化速率; ?A’325—样液或 SOD 酶液抑制邻苯三酚自氧化速率; V—所加酶液或样液体积,单位为毫升(mL) ; D—酶液或样液的稀释倍数; 4.5—反应液总体积,单位毫升(mL) 。 固体样品按式(2)计算: ?A325 ? ?A '325 × 100% ?A325 D V SOD 活力(U/g)= × 4.5 × × 1 ..........................(2) 50% V m U/mL—SOD 酶活力单位; ?A325—邻苯三酚自氧化速率; ?A’325—样液或 SOD 酶液抑制邻苯三酚自氧化速率; D—酶液或样液的稀释倍数; V1=样液总体积,单位为毫升(mL) ; m=样品质量,单位为克(g) ; 4.5—反应液总体积,单位毫升(mL) 。 3、方法特点 本方法以修改 Marklund 方法和化学发光法测定保健食品中 SOD 活性。 前者 SOD 活性测定最低检出限为 1.17 U/mL,相当于 1.1×10-8 mol/L [63]。 保健食品中过氧化氢酶( (二) 保健食品中过氧化氢酶(CAT)活性的测定[64] ) 1、分析方法 、分析方法 (1) 过氧化氢酶的提取 ) 称取约 1g 试样,倒入研钵中。加少量石英砂,粗磨至无整粒样后,量取缓 冲液 50 mL,先加入少量以润湿样品,细磨至糊状后,小心转移至锥形瓶中,用 剩余的缓冲液分多次洗净研钵, 洗液并入锥形瓶中, 剧烈振摇 5 min, 静置 2 h ~3 h 后过滤至比色管中。 (2) 酶活动度的测定 ) 准确移取 20.0 mL 滤液于锥形瓶中,直接煮沸 1 min。冷却后加入 20 mL 水 和 3 mL 2%过氧化氢溶液,摇匀后在 30 ℃恒温水浴锅中放置 15 min,加入 5 mL 10%硫酸溶液,摇匀,用 0.2 mol/L 高锰酸钾标准溶液滴定剩余的过氧化氢,滴

定至微红色且 30 s 不褪色为止,记录消耗的高锰酸钾标准溶液体积(V1) 。 (3) 空白试验: ) 空白试验: 吸取 20.0 mL 滤液于锥形瓶中,直接煮沸 1 min。冷却后加入 20 mL 水和 3 mL2%过氧化氢溶液,摇匀后在 30 ℃恒温水浴锅中放置 15 min,加入 5 mL10% 硫酸溶液,摇匀,用 0.2 mol/L 高锰酸钾标准溶液滴定剩余的过氧化氢,滴定至 微红色且 30 s 不褪色为止,记录消耗的高锰酸钾标准溶液体积(V0) 。 过氧化氢酶活动度 X 按式(3)计算:

X = (V0 ? V1 ) ×
式中:

c 50 × 17 × ×100 ..........................(3) m × (100 ? M ) 20

X—过氧化氢酶活动度,单位为毫克过氧化氢每克(mg H2O2/g) ; ; V0—空白试验用去高锰酸钾溶液体积,单位为毫升(mL) V1—试样滴定用去高锰酸钾溶液体积,单位为毫升(mL) ; c—试剂高锰酸钾标准溶液浓度,单位为摩尔每升(mol/L) ; m—试样质量,单位为克(g) ; M—试样水分含量,%; 17—与 1.00 mL 高锰酸钾标准溶液[c(1/5 KMnO4)=0.2 mol/L]相当的 H2O2 的 质量。 3、方法特点 在 pH 7.7 条件下,从样品中提取过氧化氢酶,在提取液中加入一定量的过 氧化氢,是过氧化氢在过氧化氢酶作用下分解,再用高锰酸钾溶液滴定过量的 过氧化氢。根据高锰酸钾溶液的消耗量计算出试样中过氧化氢酶活动度。 (四) 保健食品中前花青素含量的测定[65] 1、分析方法 固体粉末状试样:根据试样含量称取 50 mg~500 mg(精确至 0.001 g)试样 于 50 mL 棕色容量瓶中,加入 30 mL 甲醇,超声处理 20 min,放冷至室温后, 加甲醇至刻度,摇匀,离心(3000 r/min,10 min) ,上清液备用。 含油试样:根据试样含量称取 50 mg~500 mg(精确至 0.001 g)试样于小烧 杯中,用 5 mL 二氯甲烷使试样溶解,并倒入 50 mL 容量瓶中,再用甲醇多次洗

烧杯,并入 50 mL 容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。 口服液:根据试样含量准确吸取 1 mL~5 mL 试样,置于 50 mL 容量瓶中, 加甲醇至刻度,摇匀。 将正丁醇与盐酸按 95:5 的体积比混合后,取出 15 mL 置于具塞锥形瓶中, 再加入 0.5 mL 硫酸铁铵溶液和 2 mL 试样溶液,混匀,置沸水水浴回流,精确加 热 40 min 后,立即置冰水中冷却,过微孔滤膜后高效液相色谱仪测定。 高效液相色谱仪:配紫外检测器;超声波清洗器; 离心机;液相色谱参考条 件:色谱柱:耐低 pH 型的 ODS C18 柱,4.5 mm×150 mm,5 ?m;柱温:35 ℃; 检 测器:紫外检测器;检测波长:525 nm;流动相:水+甲醇+异丙醇+甲酸 =73+13+6+8;进样量:10 ?L;流速:1.0 mL/min,根据保留时间定性,外标法 定量。

图 10 前花青素的标准色谱图

2、方法特点 方法的检出限为:1.5×10-4 g/100g,方法的定量限为 5.0×10-4 g/100g。 (五) 保健食品中番茄红素的测定 1、方法提要 、 样品经皂化后用石油醚提取番茄红素,提取液经浓缩后,过中性氧化铝柱净 化,洗脱液经氮气吹干后,用液相色谱-质谱/质谱测定,外标法定量。 2、试剂和材料 、 (1)含 1% BHT 的二氯甲烷溶液:称取 1.0 g BHT(2.8) ,用 100 mL 二氯甲烷溶解。 (2)提取液:称取 10 g BHT(2.8) ,用 1000 mL 石油醚溶解。

(3)定容溶液:量取 10 mL 乙腈,加入 90 mL 含 1% BHT 的石油醚, 摇匀。 (4)番茄红素标准储备液:称取番茄红素标准品(2.10)1mg, 用二氯甲 烷溶解并定容至 10mL,番茄红素浓度为 100 ?g/mL,置于-18℃冰箱避光保存。 (5)番茄红素标准工作液:根据需要用含 1% BHT 的二氯甲烷溶液将标 准储备液稀释成 10.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100.0 ng/mL、1000.0 ng/mL、5000.0 ng/mL、10000.0 ng/mL 的标准工作溶液。置于 0℃~4℃冰箱中避光保存,可使用 3 天。 (6)层析用氧化铝(中性,74 ?m ~ 150 ?m) 105℃干燥 2h,于干燥器中 : 冷至室温,每 100g 中加入 2 mL 水降活,混匀后密封,放置 12h 后使用。 (7)氧化铝层析柱:在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉,干法装入处理过 的氧化铝至 3 cm 高,轻敲实后加一薄层脱脂棉,用 10mL 石油醚预淋洗,洗净 柱中杂质后,备用。 2、测定方法 、测定方法 准确提取 0.5g 试样(精确至 0.01g) ,于 50 mL 离心管中,分别加入 5 mL 无水乙醇、 50%氢氧化钾溶液 3 mL, 旋涡混匀 2 min, 超声提取 10 min, 置于 80℃ 水浴锅中皂化 2h,每 10 min 振摇一次,冷却至室温,加入 10 mL 提取液,涡旋 提取 5 min,5000 r/min 下离心 3 min,分取上清液于旋蒸瓶中,再用 10 mL 提取 液分别提取 2 次,合并提取液,40 ℃下旋蒸浓缩近干,用 10 mL 石油醚溶解残 渣待净化。 取 10 mL 待净化液加入至预处理好的氧化铝层析柱中,用 10mL 石油醚淋 洗,并抽空后用 10 mL 含 1%BHT 的二氯甲烷溶液洗脱,收集洗脱液,于 40℃ 下氮气吹干,残渣用 1.0mL 定容液溶解,过 0.22 ?m 微孔滤膜,供液相色谱-质 谱/质谱仪测定。 准确提取 0.5g 试样(精确至 0.01g) ,于 50mL 离心管中,分别加入标准工 作液 1 mL,按以上实验步骤进行。 液相色相谱条件:色谱柱:Waters Xetrra MS C18,4.6 mm×150 mm,3.5 ?m; 流动相:50:50(V/V)叔丁基甲醚-乙腈;流速:0.2 mL/min;进样量:30 ?L; 柱温:40 ℃。

质谱条件:离子源:大气压化学源(APCI) ;扫描方式:正离子扫描;检测 方式:多反应监测(MRM) ;气帘气压力(CUR) :30 Psi;雾化气压力(GS1) : 80 Psi; 离子源温度 (TEM) 380 ℃; : 放电针电流 (NC) 5.0 ?A; : 碰撞气 (CAD) : 9.0 Psi;去簇电压(DP) :94.0 V;碰撞室入口电压(EP) :12.0 V;其它参数见 表 4。
表 2

其他质谱参数
碰撞气能量(CE)/V 26 29 32 碰撞室出口电压 (CXP)/V 36 13 34

化合物

监测离子对 537.4/468.3

驻留时间 /mmin 400 400 400

番茄红素

537.4/455.5* 537.4/413.3

“*”为定量离子对。 在上述色谱条件下,番茄红素的质量色谱峰保留时间约为 2.53 min,标准溶 液的多反应检测图见图 13。 2、测定低限 、 本方法番茄红素的测定低限为 0.100 mg/kg。
XIC of +MRM (3 pairs): 537.400/468.300 Da from Sample 13 (1ppm) of 20100803.wiff (Heated Nebulizer) Max. 4827.5 cps. 2.5e4 2.4e4 2.3e4 2.2e4 2.1e4 2.0e4 1.9e4 1.8e4 1.7e4 1.6e4 1.5e4 In te n sity , cp s 1.4e4 1.3e4 1.2e4 1.1e4 1.0e4 9000.0 8000.0 7000.0 6000.0 5000.0 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Time, min 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 2.53

图 11

番茄红素标准溶液的多反应监测图

(六) 高效液相色谱法测定保健食品中的番茄红素[66] 1、方法步骤 称取均匀试样2 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加10 mL的丙酮/石油醚

(体积比为1:2), 加入10 mL水(固体样品), 旋涡1 min, 超声振荡10 min, 5000 r/min 离心10 min,残渣再用10 mL的丙酮/石油醚(体积比为1:2)提取1次,离心后合并 滤液于100 mL分液漏斗中。静置分层后,上层有机相通过装有无水硫酸钠的玻 璃漏斗后收集至圆底烧瓶中,下层水相中加20 mL石油醚进行液液分配, 静置 分层后合并有机相。将提取液置于50 ℃水浴上氮气吹干,残渣用5.0 mL 三氯甲 烷溶解,过0.45 ?m微孔滤膜后用液相色谱分析。 采用 Symmetry C18(150 mm×4.6 mm,5 ?m)色谱柱,流动相为甲醇+乙腈(体 积比为 70:30),检测波长 472 nm,外标法定量;谱图见图 18。 2、方法特点 添加回收率在80.9%~95.3%之间, 变异系数在0.75%~7.19%之间, 最低 检出限为0.1 mg/kg。

图 12 番茄红素标准色谱图

保健食品中角黄素、 (七) 保健食品中角黄素、虾青素的测定[67] 1、测定方法 称取试样约 5.0 g(精确至 0.01 g)于 50 mL 离心管中,加入 30 mL 乙腈提取 剂)及 10 g 无水硫酸钠后,涡旋混合 1 min,在 35 ℃以下水浴超声提取 10 min, 再以 3000 r/min 离心 5 min。将上清液移入预置 20 mL 正己烷的 125 mL 分液漏 斗中,振摇 0.5 min 后,静置分层;收集下层乙腈相,正己烷相留在分液漏斗, 待本试样后续脱脂重复使用。 按上述步骤对离心管中的残留物每次用 20 mL 乙腈提取液再重复提取两次, 所得提取液用上述正己烷依次脱脂。合并三次脱脂后所收集的乙腈相,加入 15 mL 正丙醇, 40 ℃以下旋转蒸发至近干, 于 用乙腈溶解并定容至 5.0 mL, 0.22 过 ?m 滤膜,待测。 高效液相色谱仪:配二极管阵列(DAD)或紫外-可见(UV-Vis)检测器;

液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾(ESI)离子源;分析天平;漩涡混合器;超 声提取器;离心机;旋转蒸发器;高效液相色谱条件:色谱柱:Waters Symmetry C18,4.6 mm×250 mm,5 ?m;柱温:35 ℃;流速:1.0 mL/min;流动相:乙腈水(95+5,体积比);检测波长:471 nm;进样量:50 ?L。液相色谱-质谱/质谱: 色谱柱:Acquity UPLC BEH C18 柱,2.1 mm×50 mm,1.7 ?m;柱温:30 ℃;流 速:0.3 mL/min;进样量:10 ?L;流动相和梯度洗脱程序见表 5;标准品的高效 液相色谱图和多反应检测图见图 14 和图 15;离子源:电喷雾源 ESI,正离子模 式;扫描方式:多反应监测(MRM);其他参考质谱条件见表 6。
表 3 流动相和梯度洗脱程序 时间/min 0.0 3.4 3.8 5.0 乙腈/% 90 98 90 90
表 4 主要参考质谱参数

乙酸铵溶液(1.10)/% 10 2 10 10

曲线 直线 直线 直线 直线

化合物 角黄素 虾青素

母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 锥孔电压/V 564.8 597.36 133.4 303.3 146.9 378.7 20.0 20.0 26.0 26.0

碰撞能量/eV 28.0 20.0 19.0 12.0

驻留时间 0.10 0.10 0.10 0.10

图 13 标准品的高效液相色谱图
1-虾青素反式体;2-虾青素顺式体;3-角黄素反式体;4-角黄素顺式体

图 14 角黄素、虾青素标准品的多反应监测图

1-虾青素反式体;2-虾青素顺式体;3-角黄素反式体;4-角黄素顺式体 2、测定低限 本方法中高效液相色谱法对角黄素、虾青素的测定低限均为:0.1 mg/kg。 (八) 保健食品中叶黄素的测定[68] 1、测定步骤 准确称取样品 0.5 g,精确至 0.001 g,置于 50 mL 聚丙烯离心管中。在避光 条件下, 加入 10 mL 丙酮溶液, 振荡提取约 3 min。 5000 r/min 低温离心 5 min, 以 移取上清液至一干净的 15mL 离心管,于 30℃ 氮吹浓缩至少于 l mL。用丙酮溶 液定容至 1mL,在液体混合器上充分振荡混匀,样液过 0.2 ?m 滤膜,用液相色谱 仪测定,外标法定量。 高效液相色谱仪,配紫外检测器;分析天平;液体混合器;氮气浓缩仪;低 温离心机; 液相色谱参考条件:YMCTM Carotenoid,5 ?m,250 mm×4.6 mm(内 径);柱温:25℃;流速:1.0 mL/min;检测波长:445 nm;进样量:50 ?L;梯

度洗脱条件见表 7。
表 5 液相色谱梯度洗脱条件 时间/min 0 10 11 15 甲醇/% 85 78 10 10 叔丁基甲醚/% 15 22 90 90

2、检出限 方法的检出限为 0.05 mg/kg。 (九)铁盐催化比色法测定保健食品中原花青素[69] 1、测定步骤 、 准确称取样品,用无水乙醇超声振荡提取 10 min,反复 2~3 次,定容至刻度 线,摇匀,即得到样品溶液,根据原花青素的含量,用无水乙醇稀释至原花青素 在 0.05 mg/mL ~0.20 mg/mL 范围。移取 1.0 mL 样品溶液于 10 mL 刻度试管中, 加入 9 mL 正丁醇:浓盐酸:20% FeNH4(SO4)·12H2O(85:5:0.4,V/V)混合液,置于沸 水浴中加热,待水浴温度恢复至(99±1)℃时开始计时,并塞上塞子(勿摇) , 准确加热 40 min 后,立即取出用冰水快速冷却至室温,以正丁醇定容至刻度线, 塞紧后充分摇匀,在 550 nm 处以空白管调零,测定吸光值 OD550,外标法定量。 2、方法特点 、 溶液中原花青素浓度在 26.0?g ~416.0 ?g 范围内, 与吸光值 OD550 呈线性关系, 扣除空白值后的吸光值为 0.01 时,相对应的浓度值为最低检测限的方法,计算 最低检出限为 4 ?g。 对样品进行添加回收实验时,再生胶囊回收率较好(91.97%) ;南海岸硬胶囊 回收率偏低,为 84.93%,可能因为含有大豆异黄酮、钙、VB1、VB2、VE、β胡萝卜素等多种成分,相互之间有一定的干扰。

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