当前位置:首页 >> 生物学 >>

www.ccyule222.cc:醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白实验的改进_图文

!! =        堡Q
CN1 一l 5 /N 2 32  

实 

验 

室 

科 

学 

第1 3卷

第 2期

21 0 0年 4月  
Ap . 01   r2 0

LA B0RA T0RY  S ENCE CI  

Vo.1   No 2 1 3 . 

醋酸纤维薄膜 电泳分离血清蛋 白实验 的改进 
孙莉丽 ,李荣华 
( 州大 学 生命科 学学院 ,广 东 广 州 广


500 ) 106 

要 :针对学生在 “ 血清蛋白的醋 酸纤维薄膜 电泳” 实验 中容 易出现 的诸多 问题 ,结 合多年 的实验教学 经 

验 ,改进 了实验操作方法和条件 。改进后 每张 图谱 都显示 出明显 的 5条 区带 ,区带分 离 良好 、轮廓 清晰。实 
验的重复性好 ,适合应用在实验教学等相关领域 。  

关键词 :醋酸纤维薄膜 ;电泳 ;血清蛋 白 
中图 分 类 号 : - 3 Q 3  文 献 标 识 码 :  B d i1 .99 ji n 17 — 35 2 1.2 0 2 o:03 6 /.s .6 2 4 0 .0 0 0 .2  s

I r v n   n t e e p rme to   e a ai g s r m  r ti   mp o i g o  h   x e i n   fs p r tn   e u p o en

wi   el l s   c t t  mb a e ee to h r ss t c l o e a ea e me r n   l cr p o e i  h u
S UN  i i IRo g u   L -l,L   n -h a

( o eeo i  c ne ,G a gh uU i ri , u n zo 10 6 C ia  C l g f f Si cs u nzo  n esy G a gh u5 0 0 , h ) l Le e v t n
Absr c : Ma y p o lms e iti  h   x e me to   e a a i   eum  r t i  t   e ll s   c t t  ta t n   r b e   x s  n t e e p r n  fs p r t i ng s r p oe n wi c l o e a ea e h u me r n . Co i i g wih t e e p re c   f e pe me tl ta h n   o   n   e r mb a e mb n n   t  h   x e n e o   x r n a  e c i g fr ma y y a s,s me mo i c - i i o   d f a  i

t n   r  d  n t e a p cs o   x e me to e ai g me s r s a d c n i o s E e y s i  a   v   i s a e ma e i  h   s e t  fe p r n  p r t   a u e   n   o d t n . v r   t p h s f e o i n i r i
b n s i  h  mp o e   x e me ta d te fg e o  h   a d  s ce ra d s a p.T e ra p a a c   f a d  n t e i r v d e p r n  n  h   ur  ft e b n si  la   n   h r i i h  e p e rn e o  t   meir td e p rme tto  sfn he a lo ae   x e i n ain i  e,whc   a     p le  n t   o r ltv   o i  fe p rme tl i ih c n be a p id i hec re aie d man o  x e i n a  ta h n . e c i g  Ke   r s: c luo e a e ae me r n y wo d e l ls   c t t  mb a e;ee to ho e i ;s r m  rt i  lc rp r ss e u p oe n

醋酸纤 维薄膜 电泳 ( A E) 以醋 酸纤维 薄 膜  CM 是
( A 作 支持物 的一种 区 带 电泳技 术 , 醋酸 纤 维  C M) 用

1 3 试 剂  .

巴 比妥缓冲液 (H86离子 强度 00 )每 10  p  . , .6 : 00 m L缓 冲液含 巴比妥 16  , .6g 巴比妥钠 1.6g  27 。 染色液 : 10m 每 0  L染色液含 氨基黑 1 B0 2  , 0   .5g 

薄膜 作为 区带 电泳 的支 持 物进 行 蛋 白电泳 有 简便 、  

快速 、 分辨能力强 、 没有吸附现象、 便于保存等优点,   并 已广泛 应 用 ¨ 。“ 清 蛋 白的醋 酸 纤 维 薄 膜 电    血
泳 ” 生 物 化 学 实 验 课 程 必 开 的基 础 实 验 项 目之  是 然 而 , 生在 实验 中常 因为 实验条 件掌握 不好 或  学




操作 不 当而得 不 到理 想 的 电泳 图谱 , 主要 是 图谱 区  带 出现锯齿状 、 拖尾 , 区带 位置 弯 曲 、 斜 , 歪 区带分 离  不清 、 出现边 流 , 区带过 密等 问题 。本 文针对 学生 在  实验 中容易 出现 的诸 多 问题 , 合 多 年 的实 验 教 学  结

甲醇 5  L 冰醋酸 1 m , 4  L 可重复使用。 0m , 0 L水 0m ,     漂洗 液 : 10mL漂洗 液 含 甲醇 4  L, 醋  每 0  5m 冰 酸 5mL 水 5  , 由学生 自己配制  。   , 0mL 可   需 要 注 意 的是染 色 液 、 漂洗 液 应在 密 封 的瓶 子  内贮存 , 否则 , 易挥 发的成分蒸发 , 使溶液各组分配  比发 生改变 , 从而 影响实 验结 果 。  

经验 , 归纳总结出一个完整的实验指导 , 并在实践中   获得理 想 的实 验效果 , 高 了实 验教学 质量 。 提  

2 实 验 准 备 
2 1 醋 酸 纤维薄 膜的选择 和浸 泡  .  分辨 出 醋酸 纤维 薄 膜 的光 泽 面和 无光 泽 面 , 并  用铅笔 在无 光泽 面上做 上记号 。浸 于盛有 巴 比妥 缓  冲液 的培养 皿 内 , 使它漂 浮在 液面 。若迅 速润湿 , 整 

1 材 料 、 器 与 试 剂  仪
1 1 材料  . 

人血 清或 牛血 清 , 酸纤 维 薄膜 (c 2m)  醋 8m ̄ c 。
12 仪器  .

北京六一 D Y 6 Y 一 C型电泳仪, Y P 3 A型电 D C -8  
泳槽 。  

条薄膜色泽深浅一致, 则表明薄膜质地均匀 ; 若润湿  时, 薄膜上出现深浅不一的条纹或斑点等 , 则为薄膜  厚 薄不 匀 的薄膜 。醋酸纤 维素 薄膜 的质量对 电泳 的  结 果影 响很 大 , 以实验 中应选 用质 地均匀 的薄膜 。 所  

孙莉丽, 醋酸纤维薄膜电泳分离血 清蛋白实验的改进  等:
例 如 , 厚薄 不 均匀 可 以造成 区带 歪扭 不齐 , 区带  膜 各 界 限不 清 , 景脱 色很 困难 , 验结 果难 于 重复 等现  背 实 象 j 。将 选用 的 薄膜 用镊 子 轻压 , 它 全部 浸 入 缓  使 冲液 内 , 并将 其完 全浸 透 ( 2  i)  约 0mn 。
2 2 制作 滤纸桥  . 

5  9

根 据我 们 实 验 中使 用 的 电泳槽 的规 格 , 裁 尺  剪 寸 为 3 X 2c 的滤纸 条 , 3 1 m 对折 后 附着在 电泳 槽 的支 

架上 , 使它的一端与支架的前沿对齐 , 另一端浸入电  泳槽 的缓 冲液 内。用 缓 冲液 将 滤 纸 全 部 润 湿后 , 用  玻璃 棒轻 轻挤 压在 支架 上 的滤纸 以驱除 滤纸 中的气  泡 , 滤纸 紧贴 在支 架 上 j即 为 滤纸 桥 ; 另外 一  使 , 在
个 电泳 槽 支 架 上 按 照 同 样 的 方 法 制 作 相 同 的 滤 
纸桥 。   滤纸 桥搭 好后 , 向电泳槽 内补加 缓 冲液 , 两边  使

电泳槽 内缓 冲液 的液 面彼 此 处 于 水平 的状 态 , 否则  通过 薄膜 时有 虹 吸现 象 , 影 响蛋 白质 分 子 的泳 动  会
速度 。   2 3 点 样器 的制 作  . 

用 玻璃 刀 将 薄 厚 一 致 的 盖 玻 片 裁 成 1m 宽 的  c

点样器 , 将其边缘磨平 , 擦净备用。  

3 实验 操 作 方 法 的 改 进   
3 1 点 样  . 

取 一 大培 养 皿 , 扣 在 实验 台上 作 为点 样 的支  倒

持 物 。将 浸 泡好 的 薄膜 取 出后 , 在 清洁 的滤 纸 中  夹

间, 轻轻吸去多余的缓 冲液以免缓 冲液太多引起 样  品 的扩散 ; 也不 能吸 的太 干 , 但 否则样 品 不易进 入 薄  膜 的 网孔 内而造成 电泳 起 始 点 参 差 不 齐 , 而影 响  因 分离 效果 ; 然后 将 薄膜 的无 光 泽 面 向上 放 在 点样 的  支持 物 ( 养皿 ) , 培 上 点样 器 沾 取 滴在 点 样 板里 的适  量 的血清 , 垂直 印在 醋 酸纤 维 薄 膜 无 光 泽 面一 端 的  15~  n 处 ( 1所 示 ) . 2cl 图 。点 样 前 , 生 先 在 小 块  学 的滤 纸上练 习 , 最好 是使 用双 手点 样 , 这样 比较好 控  制 点样 的力 度 。点 样 的 力 度要 均 匀 , 以免 被 分 离 的  区带 出现斑 点 。  

直, 中间不能下垂 。薄膜之间要有问隙 , 保持大于 2   m 的空 隙 , m 不能搭 扰 , 则 一 条 薄膜 上 的 血 清会 跑  否 到另 一条 上 ; 而且 薄膜 要 垂直 于滤 纸桥 , 电流 方 向  与 平行 , 否则 会造 成 电泳 区带 的位 置 歪斜 、 曲 。盖 上  弯 电泳 槽盖 , 薄膜 平衡 1  n2 。 使 0mi_    ] 平衡 后 即可 进 行 电泳 。 电泳 时 , 教 材 提 供 的  按 条件 , 即电压为 10V 电流强度 0 4~ .  A c   6  , . 0 7m /m 膜宽 , 电泳 时 间约 为 2 5分 钟 进 行 电泳 , 果很 不 理  效 想 。根 据之 前 的报 道  , 按 照 电泳 槽 的 盐 桥 长度  应 和 所放 薄膜 数 目确定 具 体数 值 ; 所 用 电压 过 小 , 但 不  能将 蛋 白较 好 的 分 离 , 用 时 较 长 。故 根 据 我们 实  且 际需 求 , 即按 电场强 度 1 O~1  / m( 薄 膜与滤 纸  2V c 指 桥 总长 度 ) 电流 强 度 0 5~0 8m / m 膜 宽 ( 薄  , . .  A c 指 膜数 目的总宽度 ) 行计算 , 以控制 电流大小为  进 并 主效 果 较好 。   我 们 在学 生 实 验 中 , 三 组学 生 共 用 一个 电泳  每 槽 , 6人 共 1 醋酸 纤维 膜 。有 机玻璃 电泳槽 放  即 2条 置醋 酸纤 维 薄膜 1 2条 , 制缓 冲液 液 面离 薄膜 的高  控 度为 15~  m, 滤 纸 桥 的 长 度 为 3—4C'薄膜  . 2c 则  F, I I 与滤 纸桥 总长 度为 1 1~1 l。薄膜 总 宽度 为 2 c   2c n  m × 2 2 m, 1 = 4c 即控 制 电压 10~14V, 1 4  电流 强 度 1  2 1.  9 2mA。在此 范 围 内 , 们 经过 反 复多 次 实验 , 我   得 出在 电流强 度 i  A, 9 m 电压 10 V, 6 7   i  4   经 0~ 0 m n 进 行 电泳 的条件 下 , 泳 的 区带 整 齐 、 明 , 电 分 区带 之  间分离 彻底 。当然 , 同 的电泳 仪 、 不 电泳槽 及所 摆放  的薄膜数量不同, 所需 的电压 、 电流也不 同, 应具体  计算。需要特别强调的是 , 通电时, 不得接触槽内缓  冲液或 薄膜 , 以防触 电 。  


3 3 染 色  . 

电泳 完 毕后 , 断 电源 , 即取 出 薄膜 , 接 浸  切 立 直

入 染 色液 中 , 色 1  i。染 色 过程 中不 时 轻 轻 晃  染 0m n 动染 色皿 , 染色 充分 。薄 膜条 较 多时 , 使 应避 免彼 此  紧贴 导致 染 色不 良。  
3 4 漂 洗  . 

我们在 实 验 中采 用 连 续 漂洗 的方 法 - , 本 着  8但   J
节 约 的原则 , 们将 漂 洗次 数 由六次 缩减 至三 次 , 我 即 

盛 有漂 洗液 的培养皿 有 三个 , 个培 养皿 中有 3mL 每 0  
漂 洗液 , 薄 膜 从 染 色 液 中取 出 后 , 量 沥 去 染 色  将 尽

液, 用镊子夹着薄膜在培养皿 中连续摆动漂洗三次  至 背景无 色 。  
( ) 一   (   +)

图 1 点样位置示意 图 

3 5 拍 照  . 

将薄 膜夹 在 干净 的滤 纸 中 , 吸去多余 的水分 , 风 
干或 用 吹风机 吹 干后 拍照 。  

3 2 电泳  . 

将点 样端 的薄 膜平 贴在 阴极 电泳 槽 支架 的滤纸 

桥上 ( 注意点样面朝下) 点样区带离电泳槽支架 1  , 0 m m左 右 , 能 接触 滤纸 桥 ; 一端 平 贴 在 阳极 端 支  不 另 架上 , 两端必须紧贴 滤纸桥 , 不能有气泡 , 并且要拉 

4 改进后 的实验结果 
在之前的学生实验中, 由于影响血清蛋 白醋酸 
( 下转 6 2页)  

6  2
4 结 论 

褰  珍  室   科 
发电路的研制[ ]. J 电子工程师 ,0 83 ( )4 - 3 20 ,4 1 :0 4 .   [ ] 魏伟 , 4 许胜辉 , 郭新超 , 带 C L 等. P D的新 型通用数字 触发器的  设计 [ ] 电子器件 ,0 8,14 6 - 2  J. 20 3 ( ): 8 7 . [ ] 徐莉 , 5 苏楠. 基于 C L P D的晶闸管脉冲触发器的设计[ ] J .电气  传动 ,0 9 3 ( ) 7 - 5  2 0 ,9 5 :2 7 .

F82 D P运算速 度快 , 2 1  S 控制 精度 高 , 方案 利  本 用 D P开 发板 实现对 晶 闸管 触发 角 的 控制 , 颖 之  S 新 处在 于利 用 D P捕 获 单 元 捕 捉 各 同 步 正 弦 电压 的  S 正过 零点 ( 零 点 后 相 电压 为正 数 的过 零 点 ) 过  过 通 延迟 3 。 0 找到 自然换 流 点 , 由于 可 以用 键 盘 改 变 对  应 的延迟 时 间 , 以克 服 线路 造 成 的 延 迟带 来 的影  可 响 , 而保 证触 发角 的准确 度 。实验表 明 , 系统 能  从 该 产生 比较 好 的触发脉 冲 。  
参 考文 献 ( e rn e )  R f e cs : e
:   . 4一   ’ 。    

[ ] 苏奎峰 , 6  吕强 , 庆锋 , T S2 F 82原理 与开发 [ . 耿 等. M 30 2 1 M] 北 
京: 电子 工 业 出 版社 ,0 5  20 .

[ ] 林欣. 7 功率电子技术 [ . M] 北京 : 清华大学 出版 社,0 9 2 2 8 2 0 . :6 


2 . 75 

[ ] T XA  N T U N S 2 X D P D s nWokh p M y  8 E SI S R ME T .C 8   S   ei   rso , a , g
20   0 4.

[ ] 戴梅萼. 9 微型计算 机技术及应 用第 l [ . 版 M] 北京 : 清华 大学 
出版 社 ,9 12 8 2 1 19 ,5 — 7 .  

实指銎0公‘力子术电控实装  收 E :927 验导技5 1 电技及机制验置 稿l2 —— 书有1 电 2  3 01   限  期0 11 o
.  . 

珂  …



~ 

陈青.单片机控制的数字触发器 [] 科技创新导报,08 J. 20  [] 2  (2 : . 1)2   4
齐红伟 , 骆武 宁, 基于 A R单片机 的三相 晶闸管触  等. V [ ] 海涛 , 3 

作者简介 : 李常顺 (9 1 ) 男 , 南浚 县人 , 士 , 17 一 , 河 硕 讲师 , 主  要研究方 向为控制理论与控制工程 。  
●< > ●<> ●< >● 0 ●<> ●< > ●<> ●<> ●<> ●< >●o ●o ●  

< > ●<> ●< >● <> ●<> ●< > ●<> ●<> ●<> ●<> ● <> ●<> ●< > ●<> ●<> ●< > ●<> ●< > ●<> ●<> ●< > ●<> ●< > ●<> ●< >● <> ●<> ●< > ●<> ●< >● <> ●< >●< > ●o

( 接 5 页) 上 9  

纤 维薄膜 电泳 的 因素 很 多 , 往往 得 不 到 理想 的 电泳  图谱 。然 而 , 主要 的影 响 因 素还 是 电压 强度 与 电流  强 度 的影 响 。针对 这 一 问题 , 合 多 年 的 实验 教 学  结 经 验 , 电泳 中根 据 我们 实 际需 求 , 在 电场 强 度 按 1  0 1  /m( 2V c 指薄 膜 与 滤 纸 桥 总 长 度 ) 电流 强 度 按  ,


05— .  A c . 0 8m /m膜 宽 ( 薄膜 数 目的总 宽度 ) 行  指 进

计算。并且对点样、 电泳时间、 染色 、 漂洗等操作步  骤进行深入的研究和改进 , 取得 了较好的实验效果 。   实 验改 进后 的电泳 图谱 如 图 2所 示 , 从 上 到下 依  其 次 为血 清清蛋 白、   球 蛋 白、 : 球 蛋 白 、 一 蛋  仅一 仅一 p 球 白、一   球蛋 白 , 区带分 离 良好 、 轮廓 清 晰 , 复性 好 , 重   每张 图谱 都显 示 出明显 的 5条 区带 ( 3 。在实 验  图 ) 过程中严格要求学生按上述步骤规范操作 , 学生 的   实 验成 功率达 到 9 % 以上 。 因此 , 0 改进 后 的实验 操  作 与实 验条件 适合 应 用 在 实验 教 学 工作 中 , 于 提  对 高 实验 教学质 量有 着重要 的意 义 。  

图 3 重 复 性 较 好 的 改 进 结 果 

参 考文 献 ( e rne )  R f e cs : e
[ ] 林加 函, 1 魏文铃 , 彭宣宪. 现代生物 学实验 [ . M] 北京 : 高等教 
育 出版 社 ,0 2  20 .

[   丛峰松主编. 2] 生物化学实验 [ . 海: M] 上 上海交通大学 出版社 ,  
2 0 . 0 5 

[ ] 王秀奇 , 3 秦淑媛 , 高天慧, 基础生物 化学实验 [ . 等. M] 北京 : 高 
等教育 出版社 ,0 6 20 .   [ ] 北京大学生物系生物化 学教研室. 4 生物 化学实验指导 [ . M] 北  京: 高等教育出版社 ,9 7 18 .   [   王松华 , 5] 杨立明. 血清蛋白醋 酸纤维 薄膜电泳实验方法 的改进  [ ] 安徽农 业技术师范学 院学报 ,9 9 1 ( ) 7 — 8  J. 19 ,3 3 :6 7 .

[ ] 陈华絮 , 6  肖生鸿. 关于提高血清蛋 白醋酸纤维薄膜 电泳效果 的  
探讨. 教学研究 [ ]20 ( ) 1 一 8  J ,06 6 :5 l .

[ ] 杨艳梅 , 7  杨萍. 如何做好 血清蛋 白醋酸纤 维薄膜 电泳实验. 卫 
生职业教育 [ ]20 ,5 9 :1 — 2 . J ,0 72 ( ) 19 10  

[ ] 邱雁临 , 8   夏服宝 , 康旭. 高醋酸纤 维薄膜 电泳实验 成功率 的 提  
探讨. 实验科学与技术[ ] 20 6 2 :- . J ,0 8,( )6 8 

收 稿 日期 :0 9 1 — 3 20 — 2 0 

图 2 改进后 的人血清 电泳 图谱 

作者简介 : 孙莉丽 (92 )女 , 18 一 , 辽宁沈阳人 , 士研究生 , 硕 助理  实验师, 主要研究方向为生物化学与分子生物学。  


以下是今天幸运会员获奖名单

www.a78.com,wwwbet6329com,www.259944.com,www.658aa.com,hg00513.com,czhl33333,WWW.ESHI44.COM,www.345076.com,zl5193com,www. 5577.com,84696.com,hot149在线看

www.596345.com,www98c38com,02277.com,1880204.com,www.88888.dog,www.807.net,qyy3828com,4591210.com,6668537com,www8046com,zl7931com,gaotao12345,wwwwnsr07com,www.22yyy.com,www.bet810d.com/User/Regist?agent=310zscom,www.hg3736.com,www.//yingtao995/.com,www.kj,751234.com,ss2151568,m.ag800.com,lxkpb.cn,wwwjs88256com,yun2177.com,www.hjc7777.com,www.hg7431.com,WWW.PK8888.COM,yabet7120com,www.727ii.com,xiaobaizhongcao,enli,vince2800,www.4455qc.com,www.ac3636.com,yulechengyihuajiemucaijin,www188letcom,qas123,www.hg030.com,tycjt347.com,cjin320923,www.jbyfc,6553112,www.pu510.com,WWW.713FFF.COM,www.7898com,hts//dn8002y99.com/20190,erp.sztljt.com,mbd.baidu.com,www.yh22.com,sss9991,u0037.com,32c32277,www66625ycom,yabo1389com,33msc.com,www.nudistube.com,g89098,6796com,vns8821com,www.991545.com,WWW.DA384.COM,w3443,dwc979.com,www.yt866.com,www.hg008878.com,fh22040,www.111rv.com,www.1313ww.com,www.414147.com,www.280077.com,z3777.com,50877com,www65345com,js2416com,520242aa,WWW.5098.COM,www.shunying2.com,97ziyuanzhangongkaichaopengtupian,qq375978031,88566i.com,55765.com,4866c82,www.186234.com,www.13919999.com,dgd.2688.com,yb7650com,www.long8751.com,123451@qq.com,www.f4d2.com,谁有avbobo的网址,yabo2839.com,www.abc907.com,r7766com,www.270222.com,bh577.com,www.c87577.com,heng888,www.41355.com,www.99jjj.com,www.654mk.com,www.x77151.com,www178911com,gg66666.com,808807com,hrs3333com,lw0893,wwwhg3103com,kpd016.qw,www.89com,www666fbnet,ruh9001,nhxiaox,www.8899031.com,www.deyyy.com,www.78aiav.com,627681767,6483hfej,853169com,945236064@qq.com,www.ctsp.com.cn,sh-yichun.com,www.250777.com,i87d7,pj38222.com,www.rrrr0068.com,youfa355.com,dpp4444,dxd645,tianjiqipai,pay.kuwo.cn,tai1166.com,www.yc007.com,http://www.pdszjls.com/,yh98.com,259988cnm,shuangg,hg6379com,86648..com,www7004072com,www.bjbus.com,www.h3838.com,eee264.cm,www13222scom,225432.com,xue.huatu.com,WWW.AI5CAOB.COM,444suncitycom,www.r00999.com,http://www.cangjige.cloud/,www6611jincom,www. 2214hu. com,by1328.com,yaboyulecheng,555000,www.xy629.com,740765052@qq.com,wwwvns7238com,www.jt43.com,ag89561,www.206092.com,www.vns5736.com,www.24229.com,biying900vip.com,wwwag77678com,wwwbet7425com,j326com,WWW銆侶H,cctv1024官网|

15585600455,xzy1974,1315131.com,www.303567.com,www.naixiu912.com,tfa25,6ppav.com,www.btbt.com,wwwhg77011com,www.i90901.com,www.mkt.4107p.com,www.xpj798.com,fun2299com,www.gig,www93036599com,034778.com,wwwsj003com,9998113.com,www.j483.com,agks8617com,www.9599339.com,www.zz378.com,www.753nn.com,mg4559.com,wwwDL1111COM,www.vns2017.com,www.cao736.com,www.05337q.com,wwwbbbmmmcom,www.gm0666.com,xq103.com,9170111.com,4hu最新网站地址,j333888com,www.587788.com,qy2726vip,HG7519.COM,falali.cc,www.1865.com,www.dhygw2222.com,zfy123,www9404ecom,www.1155660.com,13572289277,136888,www.43430.com,www.29886w.com,18946983996@qq.com,www786888com,wxv888,wanyi981@126.com,kt197982,fh2z.com,www.085ee.com,okjyy.cc,wwwhg9720com,xn337.com,www.366.com.nifo,www.hg81111.com,www.vic808.com,www.94943.com,82msc.com,www.ai1177.com,1212axax,bet86668.com,wb7728com,www.hs,ag3999com,www.21999hg.com,20171997com,890202com,8833kcom,www88888xcom,www.aisedao11.com,qujiayun1234,www3278855com,qifa52,4774455.com,7279.com,33tyccom,huihui88,siwa,www44393333com,pu002com,5511074.com,wwwhg6388com,003003.net,bc85.com,ks5532.com,186ai.com,www.8901.com,www.126699.com,www.gocp,www2784777com,WWW.SUN22222.COM,11jj940.com,www.88883d.com,www.segui88.com,songwenyou,b299.com,www.184sb.com,www.6046tyc.com,wwwmjyx02com,9877mm.com,yesyouare000,huangma25.com,www.57866.com,www.zzzbao.com,3730-218,www.84967.com,y946com,gc854.com,www.great.fire.wall,ag80773.com,qy0158vip,fukaduo,www.avxx.xyz avxx.info,www.972ys.com,wwwhg66318com,hbl453821093,626232com,issssi.com,www62166com,www.ag.7008988.com,www31678com,wwws8s346me,www.188188688.com,vns1235com,wwwyoufa2000com,ca8686.com,p1119391514,www552377com,WWW.HG55005.COM,中国富贵网,haosso.cn,www.hj.5599.com,373333t,longxiangshenhuangtxtxiazai,www.9990005.com,392405.com,www.4808j.com,www.1532888.com,www.bifa,www0965com,www.144177.com,eporner,6610,zhuxirui,gt118,www20773com,www.mg9672.com,www.yh88206.com,lili,www.1064.com,www.80632.pw,3645n,0885v,15i18net,809wwcom,pyrolysisplantcn,rs.3333.com,H0930. com,11105.om,www.4032r.com,www.8678df.com,kljas533,www.bc3344.com,www.063855.com|

www307328com,vic35.com,www222268com,sun5567.com,www.huidajituan.com,l26055.vip,nuoya222.com,44563.com,shoufeixiaoshuo,帐号,www.2327.com,sle678,www.0098hga.com,m.sogou.com/web/sl?pid=,www.1484vip.com,信彩网,www.tk,www.cp9980.com,6641h cm,www.b7t3.com,wwwxpj5125com,WWW.964CC.COM,www.961981.com,www.la055.com,sb0101.com,www.0638qq.net,www8809netm,12488,chiche,wwwa73473com,www.tyc58888.com,www.Nb890com,www.750196.com,868276com,www.24488b.ent,海南省区域图。,www.77aavv.com,www.q8208.com,www.bwin8099.com,3207bet,shenjinyifunielaoshixiongdongtaitu,WWW.JS.6103311.COM,www.9longbao.com,by6649.com,918bx.com,wwwhg4107com,jsh004.com,www.1388gf.cc,369987,ag.70118t.com,45234.com,ybrmb8,hh8596,WWWh32939com,378535867,ag2849vip,jinniuyulechang,700ii.com,pjjs888,mfm123,http://www.884554.C0m,tcp46.com,www.545968.com,cs8553588,yaoji2.cc,wwwbbbb8996com,www.yc1008.com,www.so.com/s?ie=utf-8&fr=so.com&src=home_so.com&q=41ss421s93.rt4wf7.cn,jy57.hcdj.com,www.288ju.com,www88036tcom,697240,baby624823,jicheng,zhen88,www3897com,www.hg4046.com,d5927,www.ting0011.com,taizhou,wwwhg7788la,lzl3333.com,www.med66.com,bicinoir,hm8082.com,444xin2.com,www.js40000.com,www4541jcom,www.j1105.com,www.zzz.13.com,wwwruqancom,40765614@qq.com,www.791ii.com,3868204,yb8470vip,www6225rcom,47742.net,yingtao994,34581.com,www.x78mm.com,ag0430vip,zwrycc.com,ec87.con,wanghuiyi88,mmsz42猫咪,lili,ks0372com,ganshijiumeixiaoshuo,www.s33666.com,www.88dy.com,66149.com,kuangbalaogongjipinqitxtxiazai,www.jifen.my0832.com,www346hhcom,www.7070uu. com,ag0900com,www9108xcom,www.28788.com,27778dcom,,www.HL00000.COM,www.63tube,934512115,www.wx99.com,www.25058.com,ya868.com,yangzi111,www.201ku.com,18205109695.com,h22365.com,21058.com,wwwy9888com,www.hg00881.com,pzl888,pengjxjj,mj113,www.mg2115.com,2061453.com,3868-1041,www530405com,1800,www.0808900.com,www.shuotxts.org,www.233jj.com,810315com,wwwx,www.bk179.com,yuhaiyuan,039119.com,c807652413,www834wwcom,883453com,zd6474com,www.vbo33.com,Www.gegehei.com,hlgvccom,www.5566.org,www.jr0055.com,w5868,www.bqxq.com,www.v4000,amvip436.com,www.d50337.com,js199888.com,2317vip,www.ocai34.com,wwwhg1073com,yb4228vip|

www3288msccom,www737755com,laizhaobin,www22882com,newcnz.com,www.82xa.com,v0367.com,www.04bet.com,www55615zcom,www.jp6999.com,3827.com,27992m.com,www.554434.com,8x2v.com,www.ra810.com,feiboyulepingtai,wwwbet8062com,9666.com,WWW.BMW188.COM,www.3046.com,www8888tkcom,89000.com,www.hg4288.com,www.0359.com,www.07322055.com,wangshangxianjinyulecheng,www.yh4312.com,49ds.con,www.hg7822.com,wwwny0011com,www.10ssk.com,www.www.lbs9999.com,qwe1234444,wwwv2206com,yabo7461.vip,www.zjtxfl.cn,www.avtb0066.ccm,www.vin011.com,lh7981.com,www.72811.com,etetr7,www.1014789.com,ks2888.com,88121314,www.360zhibo. com,chufen8,44006609.com,diqi_show@qq.com,www.776321.com,www.ohua999.net,www.023062.com,www.1122my.com,www.6663737.com,ag2245com,www14114111com,107ks.net,zhouhu888,g3055com,WWW.28678.COM,wwwxbet04com,nan1314,www.2268p.com,www.bsbet8.com,www.5151hh.com,wwwhg105com,www.11871.com,www447700com,xzjoa.5uwan.com/Default.aspx,www.494.net,hepengc,www.6834p.com,www.g7456.com,lh55555.com,hg771com,chl888,www.856vv.com,www.22ttuu.com,22334.com,10Pcaoluolishuangfei10p,www.118222.com,3871vip,1665nn.com,wwwtk90tukucom,dgzhuoyou.com,www8614com,wwwg3356com,www.hhdcs.net,www.wwyy39.com,www.pj1103.com,www.320704.com,nihao8852,www.hg89389.com,www.54288.com,136440.com,wwwhg7648com,www.7cijun.com,766788,COm,dicky21,www.8522m.com,wwwhg4598com,15a40net,www.bp04.com,ee2234,www.22359.com,2214aa.com,WWW.285678.COM,tmyuan1,wwwhgw7736com,WWW.HG9719.COM,lei9023,www.88xida.com,www38188com,www5554558com,m.58ks.app,08599.com,yb7791com,www.591444.com,www75753015com,WWW.318ABC.CO,99646bjlcom,lianyunfa,bm889l.com,www.118tm.com,tgb6868hk,t1-49.com,www.uuuxou.com,www.49467.com,www.u2466.com,www500w3com,mg3853.vip,jl7777,www.123408.com,www.44949.com,www635660com,5002.com,ask5555.com,!9996933,WWW.568MSC.COM,www.188pp.com,00006005.com,zhuxcv562,595193581,js9953com,wwwam2088com,www.138394.com,www.hd727.com,www.js1477.com,tu11.cc,www.aomensiji.com,10.qy8.me,www.4399.com,www.kanxiu777.com,fun926,www.df,www.js67755.com,www.hg8291.com,xpj558,ci541186815,www4774ffcom,www.5i8i.com,0745bet,zz4321,dahengguojiyuxian,hg418.com,128sun.com,yingjiaguojiwangzhi,www.984.cc,kj9388com|

以上会员名单排名不分前后