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产红色素菌株的筛选、鉴定、色素提取、红色素发酵工艺及性质的研究


安徽农业大学 硕士学位论文 产红色素菌株的筛选、鉴定、色素提取、红色素发酵工艺及性 质的研究 姓名:刘小娟 申请学位级别:硕士 专业:微生物学 指导教师:樊美珍;胡丰林 20080601





随着人们生活水平的提高和保健意识的增强,食品的安全性受到越来越多的关 注。毒理学和分析技术发展证实,许多合成色素对人体有一定的危害性,因而被限制 使用。天然色素则以安全性高,具有一定的保健功能而收到广泛关注,成为研究热点。 本文对一株产红色素菌株进行了研究,研究表明该菌株溶解性好,色价高,性质稳定, 具有较高的开发价值和应用前景。 通过对PDA、SDAY、察氏、酵母蔗糖和淀粉五种培养基的筛选和菌丝生长速率 比较,选出最适培养基为PDA培养基。并通过比较胞内外色素OD值和菌丝体干重大 小对初筛所得15株菌株进行复筛,通过比较发现:菌株RCEF4029胞外色素OD值为 0.39,胞内色素OD值为O.63,菌丝体干重为3.1lg,明显高于其它菌株,因此将 RCEF4029作为目标菌株进行研究。 根据该菌株的形态、培养特征和其显微形态观察,从菌丝、孢子的形态和产孢子 的特征等初步判定为镰刀菌属(Fusarium)。为确定其分类地位,又用ITS—DNA测序 鉴定进行了验证。将ITS—rDNA提取后进行PCR扩增,测序后提交到National
for Biotechnology Center

Information(NCBI)核酸数据库,通过Blast程序,将ITS.rDNA序列与

Genebank中的核酸序列进行比对,结果确定RCEF4029菌株为串珠镰刀菌(Fusarium
momiliforme)。

本文以产红色素菌株发酵液的菌体为原料,研究了红色素的提取工艺,比较了浸 提法与超声波提取和微波提取的效果,最终确定有机溶剂浸提为本实验的最佳方法。 通过单因素实验和正交实验得到有机溶剂浸提法的最佳条件为:提取溶剂为二氯甲烷: 丙酮=2:l(v厂Ⅵ,提取温度为40℃,提取时间为180min,提取料液比为1:30(m/v),
提取级数为3级。

详细讨论了该红色素的性质:该色素为脂溶性色素,可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙 酯、正己烷、甲苯、石油醚等有机溶剂,极易溶于氯仿、二氯甲烷、丙酮等有机溶剂; 色素溶液的最大吸收波长为435nm;该红色素的耐热性较好;该色素在避光、室内散 射光和室外散射光照射下具有良好的光稳定性,但紫外光对其光稳定性有一定的影 响;该色素对大多数金属离子、氧化剂、还原剂、维生素、酸度调节剂、常用食品添 加剂和防腐剂的稳定性较好,其中柠檬酸、氢氧化钠、VE、明胶和苯甲酸钠对红色 素有增色的效果;根据DPPH抗氧化筛选模型法得该色素具有一定的抗氧化活性;根
据CHO
Cytotoxicity

Assay模型进行测定得RCEF4029所产红色素基本无毒,是一种

安全性较高的天然色素,因此具有较大的开发利用价值,可以应用于印染和食品等工 业。 通过液体培养基组成成分的正交试验,以色价和分泌率为指标,比较不同

的营养性因素包括碳氮源、无机盐及不同的非营养因素包括pH、温度和培养时 间对红色素产量的影响。最终筛选出RCEF4029菌株的最适液体培养基的组成为 5%可溶性淀粉,20%马铃薯汁,0.25%蚕蛹粉,0.075%KH2P04;最佳发酵条件如下: 起始pH值为7.5,生长温度为28℃,转速1 50rpm,接种量为10%,培养时间
10d。

利用高效液相色谱、液质联用(LC—MS)等分离纯化方法,分离得到色素纯品,该 化合物的分子式为C14H1406,分子量为278.261。通过液质连用、数据库比对,得知

目前在一种真菌中已有一产红色素物质,分子式为Cl棋.406,其颜色、紫外光谱和分
子式都与本试验得到的物质一致,因此,可以断定本试验研究的红色化合物可能就是
该化合物。

关键词:红色素,串珠镰刀菌,色价,性质,发酵

II

Abstract

Food protection

security is more

concerned with and

improvement of living level and health

recongnition.Toxicology
pigments should be

analytic

technology confirmed
are

that

many
to

synthesized
people’S

limited

to use in

many fields because they
to

harmful

health.Many

researchers had

attention

natural pigments because of high

security and health protection functions.Researches indicated that some natural
can

pigment
in this

be produced by
as

microbiology.Based
follows. was the best

on

this,a

red-pigment strain

was

studied

paper.The results

(1)PDA medium

medium with SDAY medium,ezapek’8 medium,
growth rate comparing.

yeast-sucrose medium and amylum

medium screening and
sGreen

(2)There were

15 strains for secondary

by the value of OD and

dry

weight of

strains.The value of OD outside cell of RCEF4029 Was O.39,inside cell of its Was 0.63,

the

weight

of dry mycelium was 3.1 l g by comparing outside and inside cell OD value

and

the weight

of dry myceliurn,which was significantly higher than other strains.So

RCEF4029 Was the target strain.

(3)According

to

the shape of strain,culture features,morphological characteristics of
cells,conidia
as

hyphae,conidiophores,conidiogenous

etc.,RCEF4029,the

red

pigment-producing fungus was identified
Was used
to

Fusarium.Then ITS.rDNA sequence
to National

analysis

confirm it.The sequence Was submitted

Center for

Biotechnology
was

Information(NCBI),compared with DNA sequence confirmed that it Was a Fusarium momiliforme.

in GeneBank by

Blaster,and

(4)The
were

mycelium of the red pigment Was used

to

research technics of extraction in

this paper.In the experiment,three means of extraction,ultrasonic,microwave and soaking

compared
to be

in extracting effect.and

means

of

soaking with organic solvents
as

was

determined

the optimal method,which Was described

follows:the optimal organic

solvents was

dichloromethane:acetone=2:1(V/V),the optimal
1 80min,the optimal

temperature

Was 40。C,the

optimal time Was

material/liquid was l:30(m/v)and the optimal

extracting grade Was third grade.

(5)The

nature

of the red

pigment

Was discussed in detail:the red

pigment

Was

fat-soluble,it could be dissolved in

methanol,ethanol,ethyl
also could be

acetate,n—hexane,toluene,

petroleum

ether,and

other organic

solvents,it

dissolved

in chloroform,2.

chloromethane,acetone;the maximum absorption value of it Was 43 5nm;it had good heat

resistance;it Was

relatively stable to darkness,indoor

and

outdoor

light,but

the UV—ray

ⅡI

irradiation

had

certain impact

on

its stability;,it was relatively stable to most metal ions

oxidants,reducing agent,vitamins,acidity regulator,commonly used food additives and preservatives.Citric

acid,sodium

hydroxide,VE,gelatin

and sodium benzoate had

enriched

the color;According to DPPH antioxidant screening model 1aw the red

pigment

had

certain antioxidant activity while according to CHO Cytotoxicity Assay RCEF4029


model it had non-toxic whhich has

natural

pigment

of high security with the good

development

in utilization value in dyeing,printing
on

and foodstuff.
for RCEF4029 fermentation

(6)Based conditions with
nutritional results

the results of

an

orthogonal

experiment

the content of color values factors
on

and

secretion rate as

an estimate,effects

of

and non-nutritional

the color values of RCEF4029 were studied.The

showed

that the optimal composition of medium Was:soluble starch

5%,potato
as

20%,pupar powder 0.25%and KH2P04 0.075%.The optimal culture condition Was

follows:initial pH at 7.5,inocula amount at 1 0%,culture temperature at 28℃,the agitation
rate

at 1 50 rpm,culture duration for 1 0 d.

(7)The

pigment was isolated with

HPLC,LC—MS,and obtained the pure

pigment.It

molecular formular Was C14H1406 and molecular weight was 278.261.The compound of the molecule C14H1406 was deduced with aid of natural product database,the results
indicated that there Was


known compound producing red
as

pigment in
Call

fungus whose color,

UV
one

and

molecular formula were the same

the tested one,it

be

concluded

that the

in the test which produces red

pigment may be the

compound.

Key words:red pigment,协arium momiliforme.,color values,property,fermentation

IV

独创性声明 本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论 文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得安徽 农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢
:6二

思。

学位论文作者签名:—型悼 僻。汨l瑁
签字日期:

学位论文版权使用授权书
本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的
规定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文件, 允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的全部

或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文(保密的学位论文在解密后适用本授权书)。

指导教师签名:衄
签字日翌≯口扩年6月f嵋

学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 通信地址: 电话: 邮编:



文献综述

色素即着色剂,是印染工业和食品添加剂的一个重要组成部分,它可以改善印染 物品和食品的色泽,是决定产品品质的关键因素之一【l】。色素在人们生活中具有重要 用途,很难去想象一个没有色彩的世界。由于安全性的需要,在目前应用的色素中, 天然色素应用最广泛,其它如轻化工产品仍以化学合成的色素或染料应用为主。就食 品而言人们除关注食品的营养成分外,其色、香、味、形也是重要的基本参数,在这 4个参数中又以色泽的影响最大,因为视觉信息是最直接的感官信息,自然、悦目和 谐的色泽可以增加人们的食欲,提高商品的市场价值。虽然说食品都具有一定的颜色, 但由于其对光、热、酸、碱的敏感,在加工、贮存过程中会发生褪色和变色,为了保 持和改善色泽,在加工过程中需要用食品色素进行人工着色。食品色素又称食用着色 剂,是以食品着色为目的的食品添加剂。食用色素是食品添加剂的重要组成部分,它 不仅广泛应用干料、酒类、糕点、糖果等饮料和食品当中,以改善其外在品质;而且 也应用于医药和化妆品的生产。随着食品、化妆品及医药工业的发展,色素应用不断 被扩大,人们对色素需求量不断增大,并渐渐由对合成色素的需求转变为对天然色素 的需求。目前天然色素远远不能满足现代工业的需要,开发天然色素新品种,对原有 天然色素的生产工艺进行改造,已成为一个非常迫切的问题【2硼。

l天然色素研究概况
1.1色素的发展简史 十九世纪中叶以前,人们都是使用比较粗制的天然色素着色。我国天然色素的制

备及使用具有悠久的历史。据《史记之货殖传》记载,公元前221年以前的东周时期 就有“茜栀千亩,亦比千乘之家’’之说,足见当时种植茜草和栀子规模之大。茜草和 栀子当时用途之一就是制备染色剂;在北宋贾恩勰的《齐民要术》中也专门提到我国 古代人们从植物中提取染料作为染色剂使用的事例,详细记载了红花栽培和制备染料 的方法【¨】;晋代张华《博物志》中记载了用红花做胭脂的方法;明代宋应星《天工 开物》记述了红花饼的制作方法;《韩非子》中记载了战国时期齐国多用紫草染丝绸; 在《食经》和《齐民要术》等书中,就有利用天然植物色素对食品着色的记载:古代 埃及、印度等国家也曾用高粱所含色素来染物品【61;公元前4世纪,大不列颠的阿 利克撤人就开始用茜草色素等r71。近些年来,随着人类对化学合成色素的认识和对 生活质量要求的提高,天然色素的应用和开发越来越受到人类的关注和重视【8】。由于 天然色素成分复杂,生产过程中化学结构可能发生变化,且可能混入其它有害物质, 所以也存在毒性问题。为了安全起见,天然色素用于食品着色一般也需经过毒理学检 验,对其最大使用量也有具体的规定,见表1.1:

表1-1几种常见天然色素
Tablel一1 Some

normal natural pigments

相关说明:食品添加剂的霉性是评价食品添加剂的关键因素,常用评价指标有以下两个且都与毒性相关: 1.每日允许摄入量(ADI).-指人每日膳食中摄入此量而不至于影响健康的每日最大摄入量,以每日每公斤体 重摄入的毫克表示,单位为mg/kg。 2.半数致死量(LD50):是用来粗略衡量急性毒性大小的一个指标,是指使一组受试动物死亡半数的最低计量, 其单位为g/kg(体重)。

自从1856年英国入W.H.Perkins合成了第一个合成有机色素苯胺紫以后,相继又

合成了许多新的有机色烈91。由于这类色素色泽鲜艳、性质稳定、着色力强、易于溶
解、品质均一、适于调色、无臭无味及成本低廉,所以很快就取代了着色力低、稳定 性差、色调单一和成本高的天然色素【l 01。从1900年以来,大量人工合成色素生产以苯 胺为原料,这是一种有毒的石油产品。最初,由于合成的原料来源于含沥青的煤,因 此这些色素初称作煤焦油色素。早期人们认为化学合成色素的生产工艺简单、价格低 廉、染色性能非常理想,并且用量小,不会对食物产生不良风味。 但随着分析化学和毒理学的发展以及人们生活水平的提高,越来越多的人对于在 食品中使用合成色素会不会对人体健康造成危害提出了疑问。与此同时,大量的研究 报告指出,几乎所有的合成色素都不能向人体提供营养物质,某些合成色素甚至会危 害人体健康。前苏联在1968~1970年曾对苋菜红这种食用色素进行了长期动物试验, 结果发现致癌率高达22%。美、英等国的科研人员在做过相关的研究后也发现,不仅 是苋菜红,许多其它的合成色素也对人体有伤害作用,可能导致生育力下降、畸胎等 等,有些色素在人体内可能转换成致癌物质。合成色素是以煤焦油为原料制成的,通 称煤焦色素或苯胺色素,对人体有害。危害包括一般毒性、致泻性、致突性(基因突 变)与致癌作用。特别是偶氮化合物类合成色素的致癌作用更明显。偶氮化合物在体 内分解,可形成丙种芳香胺化合物,芳香胺在体内经过代谢活动后与靶细胞作用而可 能引起癌肿。此外,许多食用合成色素除本身或其代谢物有毒外,在生产过程中还可


能混入砷和铅。过去用于人造奶油着色的奶油黄,早已被证实可以导致人和动物患上 肝癌,而其它种类的合成色素如橙黄能导致皮下肉瘤、肝癌、肠癌和恶性淋巴癌等【111。
1.2合成色素

1.2.1合成色素的性质 合成色素多以苯、甲苯、萘等化工产品为原料,。经过磺化、硝化、卤化、偶氮化 等一系列有机反应化合而成【121。从结构上分为偶氮色素类(觅菜红、胭脂红、日落黄、

柠檬黄等),即含有R.N=N.R键、苯环或氧杂蒽结构的化合物;非偶氮色素类(赤藓红、
亮蓝、靛蓝等)。这些色素的分子量在450--880之间I”】,最大吸收波长在428.---630 nnl 之间;耐氧化、还原性能均较差;耐热、耐光性能稳定(靛蓝除外);胭脂红、诱惑红、 日落黄、靛蓝在碱性条件下不稳定,赤醉红、靛蓝在酸性条件下不稳定。
1.2.2合成色素的危害

1.2.2.1合成色素致毒致癌【Ml 化学合成色素无营养价值,且其化学构成物质本身对人身体有害,在合成过程中 产生的杂质如砷、汞、苯酚、苯胺、铅、福、乙醚、氯化物、硫酸盐等均有不同程度 的毒性,但由于其成本低廉,着色力强、颜色鲜艳稳定而被广泛运用。合成色素进入 人体后会大量消耗体内解毒物质,干扰人体正常代谢功能并直接作用靶器官,其毒性 表现主要有三方面:一般毒性(致肝炎、结石、过敏症等),致泻作用(腹痛、腹泻、 消化不良),三致作用(致突变、致畸形、致癌)。合成色素中的某些组份可以导致生 育力下降、畸胎等,并可以转换成致癌物质,其中偶氮化合物类合成色素(觅菜红、 新红、胭脂红、柠檬黄、日落黄、橙黄等)致癌作用更明显,因偶氮化合物在体内分 解,形成两种芳香胺化合物,芳香胺在体内经过代谢活动后与靶细胞作用而引起癌肿、 橙黄、碱性槐黄可导致动物皮下肉瘤、癌肿、肠癌和淋巴癌等,前苏联对觅菜红进行 动物试验发现其致癌率高达22%,过去用于人造奶油着色的奶油黄证实可以导致肝
癌。

1.2.2.2合成色素导致现代少年儿童行为过敏【15】 根据最新科学调查研究证明“少儿多动症”、少年儿童行为过激,表现出愈来愈 任性、顽皮、反叛、情绪不稳定、脾气暴躁,自制力差等特点与长期过多食用含有合 成色素的食品有关。中山医科大学资深儿科专家郑主任医师指出:少年儿童正处于生 长发育期,体内器官功能比较脆弱,神经系统发育尚不健全,对化学物质敏感,若过 久地进食含合成色素的食品,会影响神经系统的冲动传导,刺激大脑神经而出现躁动、 情绪不稳、注意力不集中、自制力差、思想叛逆、行为过激等症状。同时由于肝脏解 毒功能和肾脏排泄功能都不健全,致使大量消耗体内解毒物质,干扰体内正常代谢功 能,从而导致腹泻、腹涨、腹痛、营养不良、智力低下和多种过敏症,如皮疹、寻麻 疹、哮喘、鼻炎等,严重影响少年儿童的生长发育。


1.2.2.3合成色素的其他危害【16】 除了注意食品中合成色素的危害,非食品性合成色素的危害也不容忽视。非食 品性合成色素主要包括三部分:化妆品中的合成色素,药品中的合成色素和饲料中的 合成色素。大部分化妆品中都含有色素,化妆品中所含色素颜料大多是以煤焦油为原 料的人工合成色素,有一定的毒性。如口红中的碱性蕊香红、胭脂中的曙红、焰红都 有较强的致癌性,女性可能不知不觉的将大量有毒的合成色素吃进体内而产生蓄积, 易造成慢性中毒甚至癌变。化妆品中的色素还与人类皮肤的色素沉着有一定的关系, 因属焦油衍生物的化妆品色素长期食用会对光线发生敏感反应,从而导致色素沉着, 并伴有皮肤潮红、丘疹等炎症。色素还是导致人们对化妆品过敏的重要原因之一,常 常会引起烧灼、骚痒、表皮脱落、疼痛等过敏症状,而在染发妇女的尿液中,可以发 现染发剂中含有的致癌突变物质,提示了染发剂被头发吸收后有致癌的可能性。药品 中的着色大都采用合成色素,这些色素与食品用合成色素完全一样,也主要是煤焦油 色素,对于长期服药的慢性患者,其危害性尤为突出【171。 1.2.3各国对合成色素的使用和管理【18】 世界各国尤其是西方发达国家在色素对人体健康影响方面做了大量调查和研究, 而且在食用色素的管理、合成色素的使用方面均有严格的规定【19】。在丹麦,研究人员 建议,与其禁止在食品中添加色素,不如在食品标签上标明添加色素的类型。通过这 种方法,消费者可以对食品做出是否购买的决定。此外,丹麦政府还决定禁止在基本 食物中使用色素,并要求所有添加的色素都必须在食品标签上注明。丹麦采取这种行 动是为了保证那些对某种色素过敏的人群食用没有色素的基本食物。其他国家则更严 格地限制某些色素,特别是偶氮类色素在食品中的使用。经过多年的努力,现在可以 合法使用的食用合成色素品种已经大为减少。多种合成色素已被禁止或严格限量使 用。在世界各国使用合成色素最多时,品种多达100余种,日本曾批准使用的合成色 素有27种,现已禁止使用其中的16种。美国1960年允许使用的合成色素有35种,现仅 剩下7种。瑞典、芬兰、挪威、印度、丹麦、法国等早已禁止使用偶氮类色素,其中 挪威等一些国家还完全禁止使用任何化学合成色素。此外还有一些国家已禁止在肉 类、鱼类及其加工品、水果及其制品、调味品、婴儿食品、糕点等食品中添加合成色 素。我国对在食品中添加合成色素也有严格的限制:凡是肉类及其加工品、鱼类及其 加工品、醋、酱油、腐乳等调味品、水果及其制品、乳类及乳制品、婴儿食品、饼干、 糕点都不能使用人工合成色素。只有汽水、冷饮食品、糖果、配制酒和果汁露可以少 量使用,一般不得超过1/10000。根据我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760—1996) 规定,我国允许使用的合成食用色素共有8种:苋菜红、胭脂红、赤藓红、新红、柠 檬黄、日落黄、靛蓝、亮蓝。具体见表l一2:



表1.2我国允许的8种合成色素
Tablel-2 8 kinds

ofpigments allowed in China

色素

化学结构

毒理测试数据(FAO/WHO、1994)

主要用途

苋 菜 红

ADl:0-0.5

m/ks

饮料.配制酒、罐头、 糖果、糕点.冰洪潍. 虾片

LD∞:>10∥ks(小鼠,经口) 食品中最大用量:O.059/ks

翮 脂

ADI:0—0.125

mr/kS

广泛用于调味酱、酵 性食品.焙烤食品.

∞∞:>19.39/ks(小鼠.经口)
食品中最大用量:O.025s/ks
MO



不用于饮料及硬糖

赤 鲜 红


ADI.o-0.1哪∥kg LDso:》6.Ss/I【g(小鼠,经口) 饮料、配制酒.罐头、

食品中最大用量:O.05∥kg

糖果、糕点、冰洪淋



N-O,s

ADI:0一o’I ms/ks



LDso:>10e,/Icg(小鼠。经口>

饮料.配制酒、罐头, 糖果、糕点、虾片

食品中最大用量:O.05∥kg

檬№—妒 :N。03S哥



ADI:0-7.5

mg/l【g

饮料.果冻、果酱、糖
果、糕点、香肠、酒类

LD翔:12.75s/lcg(小鼠,经口)

食品中最大用量:O.]or/ks

及食用香精

ADI:0-5

m盹

饮料、配制酒、罐头. 糖果、糕点、冰淇淋、
虾片

落 黄


LD∞:>2.0S/kS(大鼠,经口)
食品中最大用量:0.IO∥ks





ADI:O-5

m∥kg 饮科、配制酒、糖果. 糕点。果冻

规 蓝

LD弱:>2.5r,/ks(大鼠,经口)
食品中最大用量:O.10∥kg

1.3天然色素 1.3.1天然色素的概念与优点

天然色素是指从自然界生物体中提取并经过精制而获得的产品,具有安全、色调 色彩自然、来源相对丰富及对环境的无污染等优点。



与合成色素相比实用天然色素具有以下优点[26-2I】:(1)绝大多数天然色素无毒副 作用,安全性高;(2)很多天然色素保留了许多天然物质(如维生素、氨基酸、核苷 酸小分子活性肽、芳香物质及某些必需元素等)或其本身就是一种营养素,如核黄酸 本身就是一种维生素,而p一胡萝卜素具有维生素的活性,具有一定的营养价值和保健 功能;(3)有的天然色素具有一定的药理功能,对某些疾病有预防治疗作用。如胡萝 b素被FDA列入药典,对心血管疾病、肿瘤等有疗效;花青苷在国外被制成抗辐射、 治疗视力疲劳的口服液;茶色素用于临床等等【22】;(4)天然色素的着色比较自然,更 接近于天然物质的颜色。由此可见天然色素的研究开发是大势所趋。
1.3.2天然色素的分类

1.3.2.1根据形态可以分为以下五类: (1)以其原貌使用的天然色素。例如:水果果酱类,浓缩果汁类; (2)对天然物进行干燥粉碎等简单处理手段得到的天然色素。例如:甜菜红粉、 茶叶末和咖喱粉等; (3)从天然资源(包括发酵产物)中提取色素成分,浓缩制成天然色素或将其干 燥制成粉末状。例如:胭脂红、栀子黄色素、红花黄色素、甜菜红色素和红葡萄果皮 色素等,所谓的天然色素大部分属于这一类; (4)经加热处理或酶处理而得到的天然色素。例如:焦糖色素(加热处理),栀 子蓝色素(酶处理); (5)以前是天然的,但现在是被合成的色素(当作天然色素来使用,其实为合成
色素)。例如:p一胡萝卜素和核黄素【23】。

1.3.2.2按原料来源不同又可分为: 植物色素、动物色素、微生物色素和矿物色素四类。但通常不把矿物色素列入天 然食用色素的范畴中【241。 (1)植物色素是从植物体内不同器官和部位中提取得到,如叶绿素、胡萝卜素、 花青素、甜菜红等; (2)动物色素是从动物体内不同器官和部位中提取得到,如血红素蛋白、虾红素

气予;

(3)微生物色素是从微生物体中或从发酵液中提取得到,如红曲色素、类胡萝b
素等。

从动植物中提取色素,因其资源有限,原材料中的目标产物含量较低,生产工艺 复杂,提取得率低,成本较高,受到诸多条件的制约,发展潜力有限。自然界中微生 物能产生的色素种类非常丰富,通过微生物的大规模培养,发酵生产色素,则不受资 源、环境和空间的限制,是高效、低成本获得目标色素的有效途径,受到广泛的关注。 开发微生物色素具有植物色素和动物色素所不可比拟的优势,从而越来越受到人们的


重视。 1.3.2.3按不同色调还可将天然色素分为三个系列,即红紫系列、黄橙系列和蓝绿色
系列。

1.3.2.4按天然色素的化学结构不同大致可分为以下几类:类胡萝卜素类、葸醌类、 黄酮类、花色苷类、卧啉类及其它类色素等。 (1)类胡萝b素类 这是一类在植物、动物和微生物中广泛分布的脂溶性黄色一红色色素,结构为 C40(有的微生物中是C30或C50)的聚异戊二烯结构,由于共轭双键的不同引起颜色的变 化。类胡萝b素是所有光合生物的基本成分,贮存于生物体的脂相中。在植物中,类

胡萝b素相当于叶绿体光合作用的辅助色素,并保护叶绿素免受强光破坏【25铂】。类
胡萝b素对pH、热比较稳定,对光、氧不稳定。 类胡萝b素的功能开发己成为当今的一个热点【27 ̄301。大多数类胡萝b素可在体 内分解为维生素A,而起到维生素A的各种生理功能‘31 ̄321。它是一种强抗氧化剂,可 清除过多的活性氧和自由基,预防机体的氧化损伤。氧自由基在组织内产生,能和体 内DNA、蛋白质、碳水化合物和脂类等重要的大分子反应,损坏它们的功能,引起 一系列的疾病,如癌症、心血管疾病和衰老等。 Blumberg[33】认为,类胡萝b素有以下几方面的功能:类胡萝b素尤以p.胡萝b素 是维生素A的前体,而维生素A是人体必需的微量营养成分:具有免疫功能,能提高 人体免疫系统低抗病原物的能力:具有抗氧化剂的功能,能淬灭单线态氧和清除体内 自由基的不良影响:能预防癌症,延缓癌症的发展:促进细胞缝问联接交流。Anthony 指出,类胡萝卜素缺乏会引起维生素A缺乏症。

Bendi“34l研究发现,类胡萝卜素能增加免疫系统中B细胞的活力,B细胞能在机
体内循环,使机体能消灭外源入侵的病原体:类胡萝b素能提高CD4细胞的能力,能 协助B细胞产生抗体,并提高其他免疫组分的活性:类胡萝b素能增加嗜中性白血球 的数目,增加自然杀伤细胞的数目,以消灭机体内被感染的细胞或癌细胞。 许多学者【35瑚】发现,类胡萝b素对癌症的作用表现为对癌症的起始、发展和侵 入阶段都有抑制作用,具有预防癌症的功能,其抗癌活性与其抗氧化活性有关。类胡 萝b素可提高T和B淋巴细胞的增生反应,刺激T细胞的杀伤功能,使自然杀伤细胞的 功能得到保护,从而增强免疫功能,使癌细胞生长延缓【39卅】。它还能促进人单核白 细胞产生肿瘤坏死因子,发挥直接杀伤功能【421。另外,类胡萝b素对某些致癌剂如
B(a)P有拮抗作用。

这类色素主要有胡萝b素、叶黄素、胭脂树橙、西红柿红素、辣椒红素和桅子黄
色素等。

(2)葸醌类


广泛分布于高等植物、细菌和昆虫中的一类水溶性色素,结构中含有蒽醌骨架, 能抗菌、抗病毒、抗癌,有的是生物氧化反应的辅酶。蒽醌类色素对光较稳定,发色 的基团是葸醌中的共扼双键,主要有胭脂红色素和虫胶色素。 (3)黄酮类 广泛分布于植物的花、叶、茎和果实中的一类水溶性色素,为多酚类衍生物,多 与葡萄糖、鼠李糖、芸香糖结合成苷类形式存在。此类色素主要用于植物蛋白、糕点、 饮料及酒类的着色。在酸性条件下,其结构中的查耳酮为闭环结构,呈黄色、橙色和 蓝色,不呈褐色。在碱性条件下(pHI 1~12)下不稳定,生成开环的查耳酮结构,而呈 褐色。色素在空气中久置会氧化成褐色沉淀。色素色泽随其种类、浓度或碳环开裂方 式不同而变化。

这类色素具有清除机体内过多的活性氧和自由基的作用,主要有高梁色素、红花
黄色素、查尔色素、可可色素等。 (4)花色苷类 广泛分布于植物中,自然条件下游离状态的花青素极少见,而常与一个或多个葡 萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花色苷。花色苷中的糖苷 基和羟基还可以与一个或几个分子的对位香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、丙二酸、对羟基 苯甲酸等通过酯化作用形成酰基化花色苷。已知天然存在的花色苷有250多种,它们 的色调随pH变化,酸性条件下为红色,中性溶液为紫色,在碱性中呈蓝色。对光、 热和酸稳定,可用于糖果、饮料、点心等着色。 研究表明,花色苷具有抗氧化【43^461、抗突变【47】、减轻肝机能障碍【48。91、抗坏血

酸[5¨1】的作用,对心血管疾病【52。31也有作用,能有效地清除超氧自由基和羟自由基。
体外实验表明,花色苷明显抑制低密度脂蛋白的氧化和血小板的聚集,而这两种物质 是引起动脉粥样硬化的主要因子。 Tsuda等I踟用亚油酸自动氧化系统、脂质体系统、免血红细脑膜系统及鼠肝粗粒 体系统对矢车菊色素.3.葡萄糖苷和矢车菊色素的抗氧化活性进行了实验,结果发现 它们具有a.生育酚同样的活性或更强。而且花色苷在pH变化后形成的假碱、哇附碱和 查尔酮也比儿茶素的抗氧化活性要强。 Yomshimote等【55】发现,花色苷可抑制很多突变剂引起的突变作用,尤其是酞基 化的花色苷。 Wang等1561发现花色苷可作为肿瘤抑制剂、血管保护剂、辐射防护剂及抗炎剂等, 用于治疗糖尿病性视网膜病、乳腺囊肿,治疗由毛细血管脆弱引起的微循环疾病,保 持血管的正常透性,预防胆固醇引起的兔动脉粥样硬化。 Nairt57】也发现花色苷及其降解产物在减轻疼痛和预防癌症方面具有一定功效。花 色苷生物合成途径及相关的催化酶,已在多种植物中进行了长时间的研究。花色苷类

色素主要有红甘蓝色素、紫苏色素、紫马铃薯色素、紫浆果色素、紫玉米色素、葡萄 皮色素和葡萄汁色素等。 (5)卟啉类 叶绿素广泛分布于植物界,是由四个毗咯环的a一碳原子通过次甲基相连接而成的 复杂共轭体系的衍生物,由叶绿酸、叶绿醇及甲醇三部分组成,其中的环叫做卟啉环
或核。

叶绿素在组织中与蛋白质结合,对光、热和酸不稳定。光照或加热条件下,叶绿 素生成脱镁叶绿素,呈暗绿色至绿褐色或紫褐色。果蔬加工预处理时的热烫却有利于 绿色的保护,其原因是热烫驱除了果蔬组织中的空气,使绿色更易显示。另外,由于 空气的去除,避免了叶绿素的氧化,而有利于绿色的保护。酸性条件下,尤其是在加 热时,叶绿素更易生成脱镁叶绿素。弱碱中,叶绿素能够水解成叶绿醇、甲醇和叶绿 酸。在强碱中,则生成叶绿素的钾盐或钠盐,呈现绿色。但pH太高时,易使其中的 酰胺和酯水解而产生异味。所以,在叶绿素加工过程中,pH值一般控制在6.5 ̄7.8。 这类色素主要有叶绿素,它是食品添加剂中唯一的天然绿色色素【58】。 (6)其它类 主要包括焦糖色素、桅子蓝色素、红曲色素、姜黄色素、甜菜红色素等。 焦糖色素是将砂糖、葡萄糖、淀粉与碱、铵盐焙烧而成,是需求量最多的天然色 素。分为焦糖色素I、II、Ⅲ、Ⅳ。焦糖色素有等电点,使用时必须避开等电点。桅 子蓝色素是茜草科桅子果实中提取的桅子甙与氨基化合物在酶(p.葡萄糖苷酶)作用下
产生的蓝色素。它在pH 3~8范围内色素变化较小,对光、热比较稳定。红曲色素是从

红曲霉发酵产物中用乙醇或有机溶剂提取得到的红色的水溶性色素。它对pH、热比 较稳定,对光不稳定,尤其是在酸性条件下更不稳定。 1.3.2.5按溶解性不同可分为脂溶性和水溶性两种。
1.4天然色素的性质

由于天然色素的化学结构不同,各种天然色素的性质也各不相同。一般来讲,天 然色素的性质主要包括其物理性质和化学性质。具体的讲就是:色调、溶解性、最大 吸收峰和最大吸收波长、耐光性、耐热性、耐盐性与耐金属性、抗微生物性、抗氧化 还原性、着色性(色价)和耐酸性等等【591。与合成色素相比,天然色素主要有以下特
性[60l。

(1)天然色素多来自植物、动物或微生物,绝大部分无毒和无不良副作用,安全 性好; (2)很多天然色素中含有人体必需的营养物质,或其自身就是一种营养素,具有
保健作用,如核黄素、D一胡萝卜素等;

(3)有些天然色素具有一定的药理功效,对某些疾病有预防治疗作用,如芸香苷


具有维持毛细血管正常抵抗能力和防止动脉硬化等功能,临床上一直用作治疗心血管 系统疾病的辅助药物和营养增补剂; (4)天然色素能更好地模仿天然物的颜色,着色色调比较自然; (5)色素资源广泛,属可再生资源,市场前景乐观; (6)大部分对光、热、氧、金属离子等敏感,稳定性较差; (7)大部分染着力较差,着色范围窄,着色费用高; (8)提取原料受天气条件影响,其质量、产量和价格易产生波动; (9)色素提取后的残渣造成环保困难,就一种天然色素而言,应用时专用性较强, 运用范围较窄161】。 上述天然色素的性质,决定了天然色素具有合成色素所不可比拟的优越性,但与 此同时,天然色素的应用也存在着一些困难,随着科学技术的发展,困难正得到逐步 克服。
1.5天然色素的应用【63“8】

天然食用色素可广泛应用于食品、日化、医药、饮料等方面。在食品工业中应用 的有饮料、汽水、果昧水、冷饮、冰淇凌、雪糕、香槟、果酒、配制酒、浓缩果汁、 果冻、冰果、蜜饯、青梅、山楂制品、糕点、罐头、糖果、饼干、膨化食品、酱料、 腐乳、肉制品、火腿、香肠;在日化工业中可应用于洗涤剂、牙膏、洗浴用品、护肤 品、防晒油、口红、胭脂等;在医药业用于药品、着色保健药、临床治疗药(如黑色 素可抑制流感病毒延缓衰老;花青素可预防关节炎;茶色素可用于治疗高血脂和心血 管疾病等;芸香苷一直作为治疗心血管疾病的辅助药;虾壳红色素有抗氧化抗肿瘤的 作用)等。此外,天然色素还可用于酸碱指示剂、生物染色剂、化学试剂等【69 ̄71】。 1.6天然色素褪色、变色的防护措施 天然色素受外界条件及其自身分子结构变化影响,会发生褪色、变色现象。这直 接影响到色素的实际应用。为防止天然色素褪色、变色,一般采用以下稳定方法【72—751。 (1)食用色素精制【‘761 经一般方法制得的天然色素粗品,大多含有蛋白质、淀粉、脂肪、无机盐等杂质, 影响到天然色素的稳定性和着色度。色素的精制纯化主要有酶法、膜分离法、离子交 接法等。酶法就是用酶与天然色素中的杂质反应而除去,特别适用于耐热性不强的天 然色素精制。近年来,超滤、反渗透、电渗等膜分离技术,大网格树脂吸附技术,凝 胶色谱技术的发展和应用为天然色素的精制提供了经济有效的方法。 (2)加入稳定剂【77 ̄78】 稳定剂的作用主要是减缓色素在加工、储藏等过程中的褪色速度,延长其半衰期。 所用的稳定剂必须无毒,在酸、碱介质中稳定,不受加热或加工条件影响而分解,用 量少,效能大,食品卫生法规定允许使用。如藏花素中加入稳定剂EDTA-Na2后,其
10

对光、热的稳定性大大增强。 (3)加入抗氧化剂 因大多数天然色素在空气中易氧化,加入抗氧化剂,可提高其稳定性。黄酮类化 合物、单宁类多酚具有抗氧化作用,可作为天然抗氧化剂。二十世纪九十年代初日本 生产的“三麦力”,对类胡萝卜素、花色苷色素、葸醌类色素、甜菜色素均有防褪色和 防变色作用。类胡萝b素与Vc,VE并用,可大大提高其对光的稳定性。苋菜红色素 中加入vc,可增加其对光、pH、温度的稳定性。
(4)天然色素的改性

改造天然色素的结构可使色素获得新的色调,改善色素的稳定性、溶解性及着色 力,增加色素的应用价值。对红曲色素进行化学修饰,使色素与蛋白质、氨基酸、壳 聚糖等反应,可增加色素着色力,提高色素溶解性和对光、热、pH的稳定性,扩大 了色素的应用范围。叶绿素铜钠盐也是叶绿素的改性产品。 (5)/JnA金属离子鳌合剂 加入金属离子鳌合剂可消除金属离子对色素的影响,提高天然色素稳定性。在藏 花素中加入EDTA.Na2的另一个作用是为了鳌合介质中的微量金属离子,消除其对色 素的氧化作用,增加了色素的稳定性。三磷酸钠的加入可消除Fe”对黄色素的影响。
(6)其它方法【7钆82】

除上述稳定化技术外,加入一些添加剂或天然色素混合使用,也可增加色素稳定 性或溶解性。茶色素与甜菜红色素混合作用,可络合与稳定性较高的色素,而增加色 素稳定性。脂溶性色素如姜黄、辣椒红素加入添加剂,可制成水溶性色素,扩大了色 素应用范围。蒽醌类色素与蛋白质接触时,其红色可转变成紫色,而加入明矾、酒石 酸钠、磷酸等就可防止这种现象发生。进行低温加热、维持稳定的pH范围可防止加 工过程色素褪色和变色。 近年来,由于微胶囊技术的发展,为色素的使用提供了便利条件。食用色素的微 胶囊化不仅可防止色素被氧化、光分解,还可改变其溶解性。使用不同的介质可制成 脂溶、水溶的色素,提高色素稳定性,扩大色素应用范围。
1.7色素的提取与分离纯化方法 1.7.1色素提取工艺的要求

天然色素经过筛选和粉碎后,需要用各种方式将其中所含的色素成分提取出来。 提取是色素生产中比较重要的工序,提取工艺是否合理,溶剂选择是否恰当,直接关 系到产品的产量和质量,也影响着下面工序的进行【83】对提取工艺总的要求是: (1)保持色素在提取中的稳定性:天然色素一般稳定性较差,对光、热、霉菌等 都很敏感,易分解、破坏,因此,提取工艺应该尽量避免这些因素而导致的分解、破
坏;

(2)尽量避免其它杂质随着色素的提取也被提取出来:减少以后净化、分离工序 的繁杂度,虽然提取中其它杂质不可避免地也会被提取出来,但选择好适当的溶剂, 控制好适当的萃取温度,往往对此是很重要的; (3)保证达到足够的抽提率:这样才能使废渣中所残留色素少,减少单位产品原 料消耗量及相应的成本; (4)保持提取液较高的色素浓度:色素浓度太稀,将会增加浓缩的困难,增加蒸 汽消耗量,所以在保证足够抽提率的前提下,应尽量提高提取液的浓度。 提取工艺的几点要求表明看来是相互矛盾的,如何总体掌握好这些要求,选择最 佳的提取条件是很重要的,应该根据原料本身的性质、提取难易度、原料价格、所含 色素种类等不同情况来综合考虑,没有固定不变的模式。 1.7.2色素的提取方法 1.7.2.1压榨法 压榨法是从天然新鲜浆果、花朵原料中提取色素最简单的方法,有机械压榨和手 工压榨两种。它们的原理相同,即是:利用手工或机械的压力使果皮内和包含在果肉 细胞内的色素溶液,透过破碎的果皮与细胞壁被压榨出来。果皮和细胞壁的破碎也可 以利用冷磨或其它机械力的方式完成,然后在压力作用下将色素溶液释放出来。压榨 后,大部分色素被挤压出来,但仍有一部分色素残留在细胞内,因此可以在压榨的同 时用水冲洗被压榨物,把色素从物料中冲洗出来。此类方法适用于色素附着力不大的 原料。由于此种方法耗能较大,提取率不高,不稳定的色素往往会分解或被破坏,并 且不适用干大规模的生产【841。
1.7.2.2溶剂萃取法 用各种溶剂萃取天然色素原料,使色素溶解而进入溶液等一系列的传质过程。由

于原料的性质不同,天然色素原料萃取所用的溶剂应根据不同原料所含不同色素的性 质来选择,一般要求溶剂:无色无味,选择性要强,即溶解色素的能力要强,而对于 其它杂质成分如果胶、蛋白质、蜡等物质的溶解力要差;在常温下不易大量挥发,而 又能在较低的加热温度下蒸发;对人体的健康危害性小且不易爆炸和燃烧;溶剂沸点 范围应小,经过后期除杂等操作后不能有任何残留,否则会带入产品中,影响质量; 本身化学性质是惰性的,不易和其它成分发生化学反应;价格便宜,并容易获得【841。 上述这些条件,应根据原料品种、性质和产品质量要求进行适当的选择。目前, 天然色素萃取一般采用的溶剂是乙醇、水、丙酮、石油醚等。由于有些色素不稳定, 需要处于不同pH值的环境中,因此,实际操作中,往往是采用混合溶剂萃取法来提 高萃取率。例如:赵士豪等在《黑芝麻色素的提取及稳定性》一文中采用了稀碱溶剂 和50%乙醇的混合溶剂作为提取剂使得提取率大大提高。 影响萃取工艺的因素有:(1)原料本身的性质。不同原料含有不同种类的色素,甚
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至不同原料所含的同一色素在溶剂中溶解的性能也有所不同;(2)溶剂的性质及固液 比。一般来说固液比越大,色素抽提率提高,但是所得的萃取液浓度小,增加了蒸发 的负荷和蒸汽消耗量。通常来讲,采用固定萃取和搅拌萃取时,固液比为4:1~5:1。 而转动萃取固液比为3.5:1~3:1:(3)萃取温度。色素原料萃取温度一般是室温或是 50"C左右。若温度低,萃取率低。若温度太高,溶剂选择性变差,大量非色素杂质被 萃取出,萃取液质量明显下降;而且,色素对热很敏感,提高萃取温度,会使部分色 素破坏分解,质量下降;(4)萃取时间。萃取时间主要取决于原料品种和原料的组织 情况,同时还和萃取设备形式及萃取其他条件(如温度,原料粒度)有关。萃取时间一 般不宜过长,越接近取终点,色素成分扩散越慢,反而浪费能源:(5)搅拌和溶液流 动。原料在浸饱时,主要靠分子扩散,如果使原料表面溶液流动并达到湍流状态,但 除分子扩散外,还有涡流扩散,大大加快了扩散速度,同时还可以消除粉末结块和不 透水现象,改善了萃取条件。 另外,可以采用混合提取法。例如,将微波提取和溶剂萃取结合起来用于提取色 素。谢永荣等研究了利用微波法从柑橘皮中提取天然色素。实验证明,利用上述方法 提取色素的产率更高。微波技术应用于提取天然色素,具有操作简单,提取速度快等 优点,应用到实际的生产中,可以产生较大的经济效益。并且所的的产品质量好,有
较强的耐热性和耐光性。 1.7.2.3熬煮法

将本来无色的物质或非需要的物质,经过熬煮转化成需要的物质,如焦糖色素、
甘草酱色素都由此法得到【841。 1.7.2.4酶反应

经过酶反应产生所需要的颜色,如桅子果实是用水提取出的黄色素溶液,食品加 工中经酶处理产生桅子蓝色素、黄色素(841。
1.7.2.5培养法

将菌株散布于培养基中,培养后干燥、粉碎、浸提,像蓝藻色素就是由此得来184]。
1.7.2.6粉碎法 样品干燥后粉碎制成色素制品,如可可豆色素等【841。

1.7.3色素的纯化方法 粗制天然植物色素因为含有其它成分,直接影响到色素的稳定性、染色力及应用 范围,必须进一步加以分离纯化。 (1)溶剂分离:根据色素与杂质在不同溶剂中溶解度的差异,以不同溶剂,由低 极性到高极性分步进行提纯分离,除去杂质。如色素水溶液中常含有蛋白质、树胶、 黏液质等,可加入一定量的乙醇,沉淀这些杂质,还可以利用不同的酸碱进一步分离。 (2)两相萃取:利用色素与杂质在两相溶剂中分配系数的不同加以分离。如水提
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取液中的脂溶性杂质,可以用亲脂性溶剂如石油醚等除去;提取黄酮色素时,多采用 乙酸乙酯.相萃取等等。有时为了提高分离效果,可以采用逆流连续萃取和逆流分配。 (3)酶纯化:利用酶催化分解作用,使杂质通过酶反应除去。如从蚕沙提取叶绿 素,利用酶纯化方法,可以除去令人不愉快的气味,得到优质的叶绿素【85】。 O)c02超I临界萃取法:超I临界萃取是以超临界流体作为萃取剂,在临界温度和 临界压力附近的条件下,从液体或固体中萃取出待分离的组分。常用的超临界流体有 C02,s02,C2H6,c2H4,C3H8等。这些萃取剂中以C02最为常用。高彦祥等研究了 超临界二氧化碳技术在食用天然色素提取中的应用,着重研究了天然色素在液体和超 临界二氧化碳中的溶解度,通过使用了不同的夹带剂,在不同的提取压力和温度及色 素浓度下色素的提取情况。研究证明:同传统的有机溶剂提取工艺相比,超临界二氧 化碳提取工艺具有以下优点:产品无溶剂残留,重金属及有害物质含量极低;产品纯 度高,无异味;在提取过程中,无氧化现象发生;产品容易贮存等【861。 (5)吸附树脂分离法:吸附分离技术包括吸附,解吸和吸附剂的再生等几个基本 过程。吸附技术是利用个组分在不同相之间具有不同的分配系数而实现的分离技术。 因此,选择合适的吸附剂可以获得很高的选择性【87】。常用的吸附剂有:活性炭,大孔 吸附树脂等。利用吸附树脂提取色素,可以使色素的产量大幅度提高,同时由于此种 分离技术的操作条件温和且不影响色素原来的性质,降低生产成本,简化提取工艺【881。 (6)超滤法:在一定的压力下,流体经过装置内部表面时,依据超滤膜的物理化 学性质,只允许溶剂、无机盐和小分子透过,而截留溶液中的悬浮物,有机物等大分 子物质既而达到分离的目的。超滤有效范围是0.0015,-,2


m。用超滤法提取时,只有

果胶等大分子被截留,糖、酸、盐等小分子都随水的渗透而实现初分离,有效地除去 果胶这类果皮中含量最多的物质,使得操作过程大为简化【88】。 另外,还可以采用丫射线照射法提取色素:由高原康生等人研究了用1KGY的Y

射线处理红葡萄皮能有效地提取色梨89】。
2我国天然色素应用存在问题例
由于天然色素性质不稳定,应用过程中容易受到一些因素如光照、温度、氧化、 pH值、介质极性、金属离子、各种添加剂等影响而发生色调、吸光度等方面变化, 从而影响食品着色效果,阻碍天然色素作为食品添加剂应用于食品工业进程。我国天 然食用色素产业从改革开放以来,随食品工业蓬勃发展而壮大起来,虽发展非常迅速, 但也存在着许多问题。 (1)目前,我国色素生产与国外相比,普遍存在成本较高,提取效率较低现象。 我国绝大多数色素生产企业在技术、工艺方面较落后,设备陈旧或简陋。因此,必须 不断创新。在天然色素生产过程中,可采用如下高新技术:基因工程、细胞工程、发 酵工程、吸附色谱、凝胶过滤、微孔过滤、超滤、反渗透、膜分离技术、超临界C02:
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流体萃取技术、冷冻干燥等。采用高新技术,提高设备装备水平,是提高天然色素收 率、产量、保证优质基础; (2)我国天然色素生产企业一般规模都偏小,产品单一,经济效益不明显,抗风 险能力差。多数工厂生产是原料型天然色素,一般不能直接使用,因而价格低,经济 效益不高。就某一种天然色素而言,企业也没有完全做到标准化、系列化,欠缺实用 技术开发。因此,应鼓励企业与科研单位结合,使科研成果能有效转化为生产实践,

产生经济效益f9¨1】;
(3)在色素资源开发利用当中,许多单位只注重开发,不注重保护,致使资源枯 竭。应尽量把资源开发与资源保护相结合,发展人工栽培,弥补天然资源之不足,以 利于可持续发展; (4)现在色素研究中,色素除杂工艺研究不多,应加大除杂工艺研究力度,以提
高色素产品质量陬1;

(5)现在对色素毒理学评价、色素性质及系统检测方法还不尽完善,应尽快加以 完善,以更好促进我国天然色素研究和利用。

3天然色素的发展趋势
中国是一个资源大国,在天然色素资源方面有着很大的潜力,近年来做了大量的 探索和研究,取得了不小的成果,现在我国有天然色素企业100余家,年产量过3万吨, 其中产量最大的是焦糖色素,占年产量的七成以上。天然色素产业未来的发展趋势表

现在以下几个方面【93蜥】:
(1)大力发展“天然、营养、多功能”食用天然色素。加强植物资源的开发和研究, 筛选稳定性好,成本低廉的天然食用色素; (2)采用高新技术,完善及改进原有工艺。在使用天然色素的生产和进一步加工 过程中,可采用的高新技术包括:细胞工程、基因工程、发酵工程、吸附色谱、离子 交换色谱、微孔过滤、超滤、电层析、反渗透、超临界C02流体萃取、亲和层析和冷 动干燥等技术。这些高心新技术的应用可以提高天然色素的得率,提高产量,增加纯 度,保证质量,降低成本; (3)2n强原料综合利用。综合利用原料可以增加产品种类,提高经济效益,降低 主要产品的成本; (4)加强不被人体吸收的聚合色素的研究。合成人体不能消化吸收的安全性高的
聚合色素或将色素固定在某一聚合物上;

(5)分析天然食用色素成分和结构,合成出与天然色素结构相同或相近的类似物; (6)对天然色素分子进行改造和修饰,以提高色素的稳定性; (7)由于天然色素一般都有植物特有的气味而限制了它的应用,所以对天然色素 进行脱气除昧研究,可以扩大它的应用范围,立足国内市场,开拓国际市场。
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引言

2.1实用价值和理论意义
食品、布料等物品都有一定的颜色特征,色泽的好坏会直接影响到消费者对食品 和其他物品的可接受性以及对其品质的评价。色素是以物品着色和改善色泽为目的的 添加剂。 在加工业中常用的色素分为合成色素和天然色素两大类。合成色素是由人工合成 的方法所制得的有机色素,具有较好的稳定性,着色强度高,经济,使用方便等优点。 但随着合成色素毒理学研究和分析技术的不断发展的进展,发现合成色素在人体内的 代谢产物有致癌作用,因此合成色素作为食品添加剂的安全性问题越来越受到广泛关 注,国外许多国家相继制定了一系列限制合成色素使用的法规,有的国家(如挪威)甚 至禁止使用任何合成色素【9J卜102]。随着社会的发展和科技的进步,消费者对纯天然食 品的兴趣日益增加,天然色素在市场上的份额也迅速增加。天然色素不仅可以赋予食 品缤纷的色彩,而且有一些还具有多种生理功能,可广泛用于医药、食品和化妆品领 域。研究和开发无毒的天然色素已经成为色素发展的总趋势,国际市场上天然色素代 替合成色素方面的研究已取得了一定的进展,已经形成了以天然色素为主导的市场。 因此天然色素的研究和开发有着广阔的前景和发展潜力。 天然色素是源于天然资源的色素,是从植物、动物、微生物及矿物质中提取得到 的或天然存在的合成复制品,大多数天然色素对人体无毒无害。具有很多合成色素无 法比拟的优点:(1)绝大多数天然色素无毒和无副作用,安全性高;(2)天然色素大多 为花青素类、黄酮类、类胡萝卜素类化合物,不但具有着色作用,且具有增强人体营 养、保健等功效;(3)天然色素着色色调较自然,更接近天然物质颜色;(4)Eh于天然 色素是由天然原料而来,自然的风味给予附加价值。同时绝大多数天然色素着色自然, 能更好模仿物质的天然颜色,并具有特殊的芳香气味,添加到食品中会带来愉快的感 觉。当然,天然色素也并不是完美无缺,也存在一些缺陷:着色强度较弱,稳定性差, 价格略贵,在加工及流通的过程中易受外界条件的影响如光、温度、pH值等因素。 另外从植物中得到的色素较不稳定,色度变化大,由于共存成分的存在,使有的天然 色素较不稳定,色度变化大,由于共存成分的存在,使有的天然色素有异味异臭。并 且色素的生产受到植物种类、地理、区域及季节的影响,供应量不稳定。 微生物色素是从微生物中提取的,不受资源、环境和空间的限制,具有植物色素 和动物色素不可比拟的优越性。食品色调的选择应遵循与该果蔬或食品应有的天然色 泽基本相似的色素或根据拼色原理调制出相应的颜色。要选择顾客心理上和习惯上喜 爱的色泽。如,红色给人以味浓成熟的感觉,黄色给人以芳香、清淡可口的感觉,橙 色给人以甘甜醇美的感觉,绿色给人以新鲜清凉的感觉【97--991。我国允许使用的色素
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的颜色种类不多,为丰富色彩,可将红、黄、蓝三种基色按不同比例拼出多种色调。 红黄蓝红 黄 (基本色) (二次色)

\八八八f
橙绿紫橙

\/\/\/
橄榄绿灰棕褐

(三次色)

红色属于三种基本色调之一,通过不同比例可以拼出多种色调。所以对于红色素 的研究具有重大意义。筛选出有较好开发前景的产色素高产菌株,并充分了解了该菌 株各项理化性质将其应用于生产生活之中,不仅会为广大消费者带来健康与方便,也 会为开发者带来可观利润。 今后微生物天然色素研究开发的重点应集中在以下几个方面: ①筛选出产红色素的高产菌株,加强天然色素稳定剂的开发; ②大力开发“天然、营养、多功能”食用天然色素; ③采用高新技术、完善及改进原有工艺,研究天然色素合成机理及着色机制; ④加强原料综合利用; ⑤加强不被人体吸收的聚合色素的研究。

2.2研究的主要内容
目前市场上的红色素种类较多,但是大多数天然红色素并不稳定,像本论文研究 的这类红色素色价高而且性质稳定的色素并不多。在国内【‘oo~1051,许多学者也对红色 素进行了研究,但主要集中在红色素的破壁方法、高产色素菌株的选育方面,而在红 色素的提取、红色素发酵产物的特性以及下游方面研究甚少。本研究是从微生物发酵 这个途径来寻找产红色素的高产菌株,再借鉴国内外的研究经验,充分发挥安徽境内 的资源优势,通过对分离的真菌的分离、筛选、提取工艺、稳定性、发酵条件的摸索 及其组分的分离鉴定等方面的研究,对微生物发酵法产红色素进行探索式研究,旨在 为红色素的进一步开发提供指导。 本研究工作包括以下几方面的内容: ①基本培养基的筛选及产色素菌株的初筛与复筛; ②产红色素优良菌株的形态学和分子生物学研究; ③色素提取工艺的研究; ④色素性质、稳定性及色素安全性和应用的研究; ⑤色素发酵工艺的研究; ⑥色素成份的分离与鉴定。

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3材料与方法
3.1材料
3.1.1供试菌株 实验所用虫生真菌,内生真菌均由安徽农业大学微生物省级重点实验室提供。采 集地主要集中在我国安徽、浙江、北京等地,其具体寄主和地理来源见表3-1。菌种 主要采用半固体培养基SDAY培养基分离,少数采用PDA培养基分离。分离所得菌 株都分别用SDAY斜面培养基保存在4"C冰箱中,以及10%甘油的无菌蒸馏水保存在 常温下。
表3-1不同供试菌株的寄主及地理来源
Table3-1 Host and geographic
or

origil'lS ofdifferent tested strains

18

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RCEF0295

粉拟青霉A玻诎聊,睨s屉,觑鲫‘
粉拟青霉^lec如小1,c嚣farinosu

直翅日 不详 鳞翅目茧 粉虱

皖岳西 皖霍山 皖霍山 福建 皖霍山 皖霍山 皖潜山 皖宣州 皖宣州 皖宣州 皖岳西 皖宣城 皖岳西 皖岳西 皖岳西 皖天堂寨 皖天堂寨 皖天堂寨 皖天堂寨 皖天堂寨 皖天堂寨 皖郎琊山 皖天堂寨 皖 岳西

IⅪEF0442
RCEF0444 RCEF0448

粉拟青霉Paecilomyces,缸砌n蹦

玫烟色拟青霉R敞眺聊yc甜盔埘啪m蛾鼯
粉拟青霉

RCEF0452

删,o棚”c嚣历一阼。研I

蚂蚁
鳞翅目幼虫 不详 象甲 不详 松灰象甲 鳞翅目幼虫 松茸毒蛾蛹 膜翅目 蚂蚁 鳞翅目茧 十眼盘瓢虫 小蠢虫 鞘翅目 鳞翅目幼虫 蝽蟓 鳞翅目幼虫 鳞翅目茧 鳞翅目幼虫 不详 鳞翅目幼虫 鳞翅目蛹 不详 鳞翅目蛹 松褐d牛 土壤 鳞翅目蛹 鳞翅目蛹 鳞翅目幼虫 膜翅目幼虫

RCEF0455 RCEF0458

粉拟青霉,诬研,0确化g向一,阳咄

粉拟青霉觑E8cffo加po鲳庙,泐鲥

RCEF0464
RCEF0501

环链拟青霉几Bc渤小v酆∞^蹦f
粉拟青霉 环链拟青霉

翮bm,懈屈,饥删
励贸渤胴懈c口^研f

RCEF05 16 RCEF0525

环链拟青霉A蛾嘞忧瞄,∞^肼f
环链拟青霉凡∞洳mm留∞f绷f
粉拟青霉Paecilomycesfarinosu

RCEF0534 RCEF0623 RCEF0632

粉拟青霉凡∽f,omm酷庙胁娜“

RCEF0639

粉拟青霉凡删肠卅粥留砌勃。跚
粉拟青霉尸dec如所粥酷向玎一。跚

RCEF0649 RCEF065 1

粉拟青霉尸臼印如川粥嚣庙,f腓“
粉拟青霉R瞄渤掰煳篮向,加鲫‘
粉拟青霉

RCEF0658

RcEF0679 RCEF0689

忍ed,0,缈皤知,m鲫l

粉拟青霉砌ecf,D,,驴甜扣砌D硎
粉拟青霉,I口ec渤—吵黜丘,胁D蹦
环链拟青霉 粉拟青霉 玫烟色拟青霉 尸口纪f,Dmvc甜c口^研f

RCEF0693 RCEF0703

R<疆F0708
RCEF0740

忍ec泐∞懈向砌。硎

RCEF0741 RCEF0788

凡gd,o朋vc豁历懒m彻岱 玫烟色拟青霉觑f∞渤硼嬲应蝴力盔gB嚣
细脚拟青霉凡E∞如打吵搿re,Ⅲ/p

皖天堂寨 云南 越南 越南 大围山 河内 巴威

RcEF0799

玫烟色拟青霉凡雠洳删伐,血,,10∞n舔B搬
玫烟色拟青霉

RCEF0803

P口gcfzD肌”c甜向md∞删

RCEF0961 RCEFl088

粉拟青霉尸l口ecf肠埘粥甜泐Ⅳ国瞪 玫烟色拟青霉砌船妇棚弦嚣^册o∞mse淞

皖黄山 皖宣城 皖琅琊山 皖宣城 皖琅琊山 皖琅琊山

RCEFI 102

环链拟青霉尸a脚洳m瞄,钾‘明f
环链拟青霉庇∞渤聊Mc醛船6耐
粉拟青霉 粉拟青霉

RCEFl289

RCEFl433 RCEFl439

砌鲥肠卅弦岱埘似批, 心ec如Ⅲ娜,f鲫材咖嚣
19

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●-_---_-_--l_____-_l-_-_-_-●__-_________-_I--_______--_____-____-____●_--_-_________-●__-____--__--l-_---_-____-_一
RCEFl454 RCEFl577 RCEFl580 RCEFl669 RCEFl 688 RCEFl724 RCEFl903 RCEFl979 RCEFl986 RCEF2982 RCEF2985 RCEF4029

粉拟青霉R瞄洳∞馏自研“ipes
环链拟青霉
Paecilomyce苫cateni

松瘤象 瓢虫 不详 鳞翅目茧

皖宣城 皖舒城 皖舒城 皖琅琊山 皖舒城 皖皇甫山 皖宣城 皖琅琊山 皖琅琊山 皖宣城 皖宣城 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山 皖黄山

玫烟色拟青霉
粉拟青霉

Paecilomycesfumosoroseus
Paecilomyces tenuipes Paecilomyces tenuipes Paecilomyces tenuipes Paecilomyces tenuipes Paecilomyces tenuipea

粉拟青霉 粉拟青霉 粉拟青霉
粉拟青霉 玫烟色拟青霉 玫烟色拟青霉 玫烟色拟青霉

蚊子
鳞翅目 蜘蛛 鳞翅目茧 鳞翅目茧 土壤 土壤 葛根 喜树枝 喜树枝 喜树枝 喜树根 喜树根 喜树根 喜树果 葛根 葛根 葛根 葛根 葛根 葛根 葛根 葛根 葛根 葛根

Paecilomycesfitmosoroseus Paecilomycesfumosorosells Paecilomycesfumosoroseus
Fusarium sp. unknow unknow unknow unknow unknow unknow unknow unknow unknow unknow unknow unknow unknow unknow unknow unknow unknow

镰刀菌
不详 不详 不详 不详 不详 不详 不详 不详 不详 不详 不详 不详 不详 不详 不详 不详 不详

L】艮027
I.R-044 LR.058

U艮063
LR-075

U艮113 LR■166
HK.3 HK.16 HK.25 HK.60 HK.63 HK.72 HK.77 HK.85

HK.9l
HK.98

3.1.2培养基

3.1.2.1固体斜面培养基 马铃薯葡萄糖培养基(PDA):马铃薯200 g(去皮,切成小块煮沸20rain,纱布
过滤)、葡萄糖20 g、琼J]旨209、定容至1000ml。

察氏培养基:NaN0339、KH2P0419、MgS04’7H200.59、KCl O.59、Fe2S04‘7H20
O.O l g、蔗糖309、琼Jl旨'209、定容至1 000ml。

SDAY培养基:葡萄糖409、蛋白胨109、酵母109、琼脂209、定容至1000m|。 酵母蔗糖培养基:
至1000ml。

酵母膏209、蔗糖1509、MgS04·7H20 O.59、琼脂209、定容

淀粉培养基:可溶性淀粉1 59、酵母膏49、琼J猬'209、定容至1 000ml。 3.1.2.2液体摇瓶培养基(PDA):马铃薯200 g(去皮,切成小块煮沸20min,纱布过

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滤),葡萄糖20 g,定容至1000ml。

3.1.2.3鉴定培养基(PsA):马铃薯200 g(去皮,切成小块煮沸20min,纱布过虑),
蔗糖20 g,琼脂209,定容至1 000ml。 3.1.3化学药品和试剂

本研究使用的化学药品和耗材主要是一些用于成分提取分离的有机溶剂;用于活 性测定的专用试剂等,具体品目见表3.2。
表3-2化学药品和试剂
Table 3-2 Chemicals and reagents

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3.1.4主要仪器 本研究使用的仪器主要是一些用于真菌和细胞培养、显微观察、成分提取分离和 分析、活性测定等方面的设备,具体仪器及其型号见下表。
表3-3主要仪器
Table3-3

Main equipments

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3.2方法
3.2.1主要的研究内容

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一_二o。‘+t?厂燃’‘j二。秭!
:菌种的初筛与复筛,’,

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。 .. 一, 一,

二分子学鉴定

一混合溶齐



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广一色索的破壁
右埘;禽窍di±
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一温度单区
n+∞*a H1I‘q早Z

红色素的提取
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广_二一红色索的色价和外观特j 芷


一微波法

一料液比-q
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——正交试殛

.,。.



打,Pfi毒:::7皇控排

紫外光,。

3.2.2菌株的筛选 3.2.2.1基本培养基的筛选:

将收集到的85株菌株进行活化并接入试管斜面中,25"C恒温培养箱培养钆5d。
将菌株由斜面转接至铺了玻璃纸的PDA平板上培养4 ̄5d后,用打孔器(直径5mm) 沿菌落边缘切取菌丝块,移至含不同培养基的平板中央,每个平板接种一块,每种培 养基4个重复。接种后在25"C下培养。每天观察菌落形态、测量菌落直径并计算生 长速率。

菌丝生长速率(m州d)=(菌落直径一5)/培养时洲10翻。
用此法筛选出最佳培养基作为后期摇瓶培养的基本培养基。 3.2.3.2菌株的初筛 将85株菌株由斜面分别转接至基本培养基PDA培养基上,通过比较生长速率的大 小来对菌株进行初筛,具体方法同3.2.2.1。 3.2.3.3菌株的复筛 将一级斜面种子接入液体摇瓶培养基(PDA)中,放入25*(2(士0.5),转速为150rpm 的全控温培养箱中培养。 10d后将培养好的菌株发酵液采用布氏漏斗真空抽滤,分离发酵液和菌丝体,并 用蒸馏水冲洗吸附在滤纸上的菌丝体3 ̄5次,菌丝体刮下后于50"C电热鼓风干燥箱 中烘干备用。发酵液采用低温真空浓缩处理,浓缩至原体积的1/5后加入两倍的95%

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乙醇,放置过夜后再用布氏漏斗真空抽滤去除生物大分子(多糖和蛋白)。取出上清 夜进行浓缩脱醇,然后进行冷冻干燥处理备用;或先用适当的有机溶剂萃取后,将有 机相浓缩近于lml备用,将水相真空脱去有机溶剂后冻干备用。提取液中的色素即为 胞外色素,菌丝体中的色素即为胞内色素。 (1)胞外色素含量的测定方法:用电子天平准确的称取上述供试菌株发酵液冻干 粉末200mg,分别采用乙酸乙酯和甲醇顺序进行浸提,用量为lml。于100Hz超声波中 提取30min。离心吸取上清液并吹干称重,溶于乙醇或DMSO等溶液,浓度配成为 1.0mg/mL。取1.0 ml该溶液,加入70%乙醇9.0 ml定容至10ml。以70%乙醇作空白对照, 在特定波长下测吸光度。每次实验每个处理设3个重复,计算平均值。 (2)胞内色素含量的测定:称取菌体0.059(精确No.0029)于50 ml烧杯中,用70% 乙醇溶液溶解,然后移人10 ml容量瓶稀释至刻度,振摇30min,静置24d,时。取1.0
ml

该溶液,加70%乙醇溶液9.0ml并混匀,用70%乙醇溶液作空白对照,在特定波长下测 吸光度。每次实验每个处理设3个重复,计算平均值。
3.2.3目标菌株的鉴定

3.2.3.1目标菌株形态学特征 将目标菌株接种到PsA培养基上,在温度为25 ̄27℃条件下避光培养,观察记录 菌落形态,肉眼观察菌落表面形态、大小、颜色、质地、生长速度、边缘形态,并用 游标卡尺测量菌落大小;挑取菌丝并连同分生孢子制成玻片,置于光学显微镜下观察 菌丝形态、孢子梗形态、孢子形态、产孢结构、菌丝颜色及有无横隔等微观特征以及 孢子与营养体之间的着生关系。 3.2.3.2目标菌株培养特征观察 将菌株分别接到蔗糖查氏培养基、马铃薯琼脂、营养琼脂、淀粉琼脂、淀粉琼脂 和蛋白胨酵母膏琼脂上,25~27℃培养7d、15d和30d,观察记录生长情况、气生菌 丝颜色、基内菌丝颜色和可溶性色素的颜色。
3.2.3.3目标菌株分子生物学鉴定【107~115】

现代分子生物技术的发展为微生物在分子水平的分类、鉴定提供了方便。Larsen 等建立了大量微生物的大小亚基rElNA序列的数据库。rRNA基因(rDNA)在微生物的 鉴定应用中,具有检测微生物种水平的多态性特征。这些rDNA高度保守地分布在染 色体的不同位置,在每个单倍染色体基因组中的拷贝数超过200个,这使得保守区域 能够很容易被扩增出来。每个重复的rDNA序列的存在方式为由一前一后的18S
小亚基单元(sSLD,5.8S
rDNA,28S rDNA

rDNA大亚基单元(LSU)组成(图3.1),已设计出通

用引物来扩增ITS序列分析相关真菌种水平之间的差异。本实验采用扩增真菌的ITS 保守序列,通过序列比对从而对未知真菌进行鉴定。ITS是内源转录间隔区(Internally
Transcribed

Spacer)的英文缩写,位于rRNA编码基因1 8S,5.8S和28S之间的小基因片

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段。ITS分析法于1990年提出,随后逐步发展成为全新的分子标记方法。其优点有: 具有高拷贝数,整个序列的长度在600--800 bp,利用rDNA通_用引物能够很容易被扩 增出来;同时包含保守与变异序列,能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行 特异性扩增比较。

I。rS4 图3-1

I’I’S5 rDNA的ITS示意图

Fig.3-1 The sketch ofrDNA ofITS

(1)DNA的提取和纯化 ①尽可能吸干菌体水分,取少量菌体(约19)加入50 ml离心管中(每菌做3管),加入l ml提取液,冰上研磨。
②加入4 ml,50℃预热的提取液,振荡混匀; ④加入1 ml 10%SDS,l ml氯化苄,剧烈振荡,使呈乳状;

④放在50℃保温1h,每隔10 min振荡混匀1次;
⑤加入3 ml,3 M NaAc(pH 5.2)冰浴15min;

⑥在4℃下,10000 rpm离-I二,15min,取上清; ⑦加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀; ④在4℃下,10000 rpm离。I],10min,取上清; @重复上述抽提过程,直至不再出现蛋白层; o取上清,加入0.54倍体积异丙醇,室温沉淀20 ①70%乙醇洗两次,再用无水乙醇洗一次; o自然晾干,溶于50111 TE缓冲溶液中,.20。C备用; (2)琼脂糖凝胶电泳 ①胶板的制备琼脂糖为区分500bp~10Mb长度片段选择的基质(Sambrook,1989; Ausubel,1987)。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下 缘应与胶槽底面保持lmm左右的问隙。向冷却至50-60。C的l%琼脂糖胶液中加入溴化 乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5rtg/mL。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏 内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶 层。待胶完全凝固后拨出梳子,然后向槽内加入IxTAE稀释缓冲液至液面恰好没过胶
板上表面。
min;

⑦加样将提取好的样品DNA样品从一20。C取出,取49l DNA样品与21xl上样液混匀, 用微量移液枪d,,tl,J3H入样品槽中。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染。

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④电泳加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源,控制电压保持在80 v,当溴酚 蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 ④观察和拍照在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳 胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带,然后用数字成像系统照像分
析。 (3)PCR扩增

扩增和测序所用的引物ITS4,ITS5ITS4(5’-TCCTCCGC”×rrGATATGC一3’1和 ITS4(5'-GGAAGTAAAAGTGG吖姨CAAGG一3’),反应体系为25 pl体系。体系如表3—4。
表3-4
Table3-4

PCR扩增反应体系
The system ofPCR

反应物
l0xBuffer

加样量(耻1)

” 5

ddH20 2×dNTP 玎忑4

Ⅲ 5
4 ¨ ,

ITS5 。

DNA模板
Taq DNA Polymerase



毗 2

PCR扩增反应流程为:94"C预变性3min后,作33个循环,每一个循环包括94"C变
性lmin,退火l min,72℃延伸1.5 min。循环结束后72℃延伸10 min以保证获得全长

产物。扩增产物用l%的琼脂糖凝胶,lxTAE为电泳缓冲液,5V/cm电压,上样4“1 电泳检测,设不加模板DNA的扩增产物为阴性对照,DNAMarker指示分子量,凝胶 成像仪观察并照相。 (4)扩增产物纯化检测 用上海生工生物工程公司的UNIQ.10柱式PCR产物纯化试剂盒按说明书的要求 实行对扩增产物的纯化。纯化产物上样41xl(1%的琼脂糖凝胶,1×TAE为电泳缓冲液, 5V/cm电压)电泳检测纯化样品纯度(通常以上样21ttl在紫外灯下可见整齐单一条带,即 达到测序要求’)。 (5)序列测定 经纯化的PCR产物直接送上海英骏生物技术公司,将测得的ITS序列与GenBank序 列库中做BLAST,找出与之最大相似性的序列,下载相似序列的ITS区域,用Clustal W (BioEdit7.0.0软件)进行序列比对(Multiple alignments)。对于同一种序列,如果和大多 数序列相差太多则作为错误序列加以排除;对于同一个种的序列,如果和大多数序列 相差不多,但和其它该种的序列相差太多,则作为疑难种进行标记。
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3.2.4红色素的提取

3.2.4.1色素含量测定所用波长的确定 向96孔板加入51al色素提取液,用酶标仪进行全波长扫描,确定色素含量测定所用 的最佳波长。 3.2.4.2色素的提取 (1)色素样品的破壁【116】 试验所用样品胞内色素占较大比例,而胞内色素必须破壁后才能提高其提取率。 由于样品细胞壁比较坚硬,用丙酮、氯仿和甲苯等有机溶剂对其破坏的程度不高。目 前采用的破壁方法有多种,有文献报道【¨7—1181曾经采用珠磨法、机械破碎法、高压匀 浆法进行破壁,这些方法适用于大规模生产;因此选择以下几种适于实验室使用的破 壁方法进行比较。此外还有冷冻破碎法、Cu 2+破碎法等等【1191。 ①研磨法 准确称取一定量的干燥红色素样品,按红色素样品:石英砂=1:5(m/m)的比例混合 后于研钵中研磨成粉末,再加入一定体积的二氯甲烷,然后在50。C水浴中浸提lh后 取出离心,取其上清液为待测液。 ⑦酸热法 准确称取一定量的干燥色素样品,以料液比1:20(m/v)力n入2.0m01/L盐酸静置 40min,沸水浴4min后急冷,然后离心并用蒸馏水洗涤2次,再加入一定体积的二氯甲 烷提取1h,离心后取其上清液为待测液。 ③细胞自溶法 称取一定质量的干菌体,并按4%的用量加入NaCl作为质壁分离剂,调pH 6.0~7.0,控制温度55。C,自溶约3h之后,以4000rpm离心15min,所获沉淀物水洗后
再离心,即为细胞碎片。

@甲苯法 称取一定质量的干菌体,按6.0ml/g干菌体加入甲苯,于35"C破壁45mi巩然后离 心4000rpml5min,去上清液,沉淀物水洗后再离心,即得细胞碎片。 ⑤超声波法 称取一定质量的干菌体,按红色素样品:石英砂=1:5(m/m)的比例混合后于研钵中 研磨成粉末,再加入一定体积的二氯甲烷,然后用超声波浸提lh后取出离心,取其上 清液为待测液。 (2)有机溶剂提取法 按红色素样品:石英砂=l:5(m/m)的比例称取适量的色素样品和石英砂于研钵中 研磨成粉末作为样品,以料液比为l:50(m/v),分别加入二氯甲烷溶剂,然后用不同 的方法提取,溶液离心后取其上清液在435nm处测定吸光度值。

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①单一溶剂提取实验 按红色素样品:石英砂=l:5(m/m)的比例称取适量的色素样品和石英砂于钵中研 磨成粉末作为样品,然后每支试管中加入0.6009样品,再分别加入不同溶剂5ml,混匀 后置于50。C水浴锅中浸提m后取出离心,取其上清液在435nm处测定吸光度值。 ⑦混合溶剂提取实验 按红色素样品:石英砂=l:5(m/m)的比例称取适量的色素样品和石英砂于研钵中 研磨成粉末作为样品,然后每支试管中加Ao.6009样品,再分别加入不同比例的混合 溶剂5ml,混匀后置于50。C水浴锅中浸提lh后取出离心,取其上清液在435nm处测定吸
光度值。

o温度对吸光度的影响 按红色素样品:石英砂=1:5(m/m)的比例称取适量的色素样品和石英砂于研钵中 研磨成粉末作为样品,然后每支试管中加入0.6009样品,再加入二氯甲烷5ml,混匀 后分别置于不同温度的水浴锅中浸提lh后取出离心,取其上清液在435nm处测定吸光 度值。
@时间对吸光度的影响

称取色素样品O.1009、石英砂O.5009放入研钵内,充分研磨后,加入5ml二氯 甲烷,分别在最佳温度下浸提30, 60,90,120,150和240min,中间适当振荡一 下,然后离心取其上清液在435nm处测定吸光度值。
o料液比对吸光度的影响

按红色素样品:石英砂=1:5的比例称取适量的色素样品和石英砂于研钵中研磨成 粉末作为样品,因考虑到溶剂的挥发性对不同体积溶液的影响不同,从而带来较大误 差,所以本实验取相等体积(5m1)的溶剂,改变色素样品产物的量来确定不同料液 比。料液混匀后置于40℃水浴锅中浸提150min后取出离心,取其上清液在435nm处测 定吸光度值,然后换算成取1.0009样品的总吸光度ZA。实验重复3次。 @红色素提取的正交实验 根据单因素实验结果,料液比、温度、时间三个因素对实验结果的影响较大,因 此以料液比、温度、时间为实验的因素,安排三水平做正交实验。实验选取b(34) 正交表。 a.固定条件:I.提取级数为三级;II.提取的色素溶液均在最大吸收峰处(435nm)
测定吸光度。

b.研究因子及其水平选择见表3.5

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表3.5研究因子及其水平选择情况
Table3-5 The study factors and selection levels

c.正交设计表的选择:选取Lg(34)IE交表。

d.因子作用显著水平检测方法:F电In)宰,检验法(n'm…自由度;Q…置信度)。
e.通过各因子作用显著性检验确定及验证最佳工艺条件。 ⑦红色素提取级数的确定 在最佳浸提条件下做浸提实验,测定各次提取率,确定浸提级数。操作方法是: 在最佳浸提条件下,多次浸提一定量的红色素样品,直至浸提液无色,分别收集各次 浸提色素溶液并测定其体积(V,m1)和吸光度(A)。最后,合并各次浸提结果得到 E(VxA)。每次的提取率用下式计算:

提取率(%)=Ⅳ×A)/∑(VxA)
(3)超声波提取实验 按红色素样品:石英砂=l:5(m/m)的比例称取适量红色素样品和石英砂于研钵中 研磨成粉末状样品,然后以料液比为l:30(m/v),加入二氯甲烷:丙酮=2:1(v/v)溶剂,放 入超声波清洗器中,分别提取10min,20 min,30 取效果越好。 (4)微波提取实验 ①微波提取功率的确定 按红色素样品:石英砂=1:5的比例称取适量的红色素样品和石英砂于研钵中研磨
min,40 min,50 min和60 min,以确定

最佳提取时间。提取溶液离心后取其上清液在435nm处测定吸光度,吸光度越大说明提

成粉末作为样品,然后以料液比为1:30,分别加入二氯甲烷:丙酮=2:l(V/Ⅵ,然后混
合均匀后放入微波炉中,调节微波炉使其功率分别为70W,210 W,350 W,490 W和 700W,提取时间为60s,最后提取溶液离心后取其上清液在435nm处测定吸光度,吸 光度越大说明提取效果越好。 ⑦微波提取时间的确定 按红色素样品:石英砂=l:5的比例称取适量红色素样品和石英砂于研钵中研磨成

粉末作为样品,然后以料液比为1:30,分别加入二氯甲烷:丙酮=2:l(V们,然后混合
均匀后放入微波炉中,在最佳提取功率的条件下分别提取20s,40s,60s,80s,100s, 120s和140s,以确定最佳提取时间。最后提取溶液离心后取其上清液在435nm处测定
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吸光度,吸光度越大说明提取效果越好。 (5)三种提取方法的比较 在浸提法、超声波提取法和微波提取法的最佳提取条件下,分别提取等量的红色 素,比较其提取效果。提取后的溶液经离心后取上清液在435nm处测定吸光度,吸光度
越大说明提取效果越好。

3.2.5红色素性质的研究
3.2.5.1红色素的外观特征

将RCEF4029接种至500ml PDA液体摇瓶中于25。C(士O.5)条件下在转速为150rpm 的摇床上进行摇瓶培养,10d后将培养好的菌株发酵液采用布氏漏斗真空抽滤,分离 发酵液和菌丝体,并用蒸馏水冲洗吸附在滤纸上的菌丝体3~5次,菌丝体刮下后于50℃ 电热鼓风干燥箱中烘24h,将菌丝体用粉碎机彻底粉碎即得菌丝体色素粗产品;发酵 液采用低温真空浓缩处理,浓缩至原体积的1/5后加入两倍体积的95%乙醇,放置过夜 后再用布氏漏斗真空抽滤去除生物大分子(多糖和蛋白)。取出上清夜进行浓缩脱醇, 然后进行冷冻干燥处理即得发酵液色素粗产品。
3.2.5.2红色素的溶解性

将等量的色素粉末溶解于10ml的各种试剂中,充分溶解后静置,观察色素在各试
剂中的溶解情况。 3.2.5.3红色素的色泽变化性

(1)红色素变色的pH(2~12)的缓冲液,各取5ml,加入一定量色素液,静置一 段时间,观察色素溶液颜色变化。 (2)物理、化学处理对色素颜色的影响:对色素溶液进行不同的物理、化学处理 (如不同光照,化学试剂),观察色素溶液颜色变化。
3.2.5.4红色素的光谱特征

将色素粉末用二氯甲烷:丙酮=2:l(W)进行提取,提取液注入96:子L板用酶标仪进
行全波长扫描,确定色素溶液的最大吸收峰,绘制出色素的可见吸收光谱。 3.2.5.5红色素的稳定性性质实验 从红色素的生物合成途径来看,红色素的产物是多种物质的混合物,本实验通过 对热、金属离子、氧化剂、还原剂、光等稳定性进行研究,初步了解了红色素中色素 的理化性质。样品处理:按l:5(m/m)的比例称取适量的红色素样品和石英砂于研钵中 研磨成粉末状,然后按每管1.2009的量加入试管同时an-氯甲烷和丙酮混合溶液6ml, 其中二氯甲烷:丙酮=2:I(V/V),混匀后置于40。C水浴锅中,180min后取出离心,取上清
液即为红色素提取液。

(1)温度对红色素稳定性的影响 将红色素提取液分别置20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的水浴锅中保温,
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定时测定其在435nm处的吸光度值,并分析不同温度对红色素稳定性的影响。 (2)光照对红色素稳定性的影响


将红色素提取液分别置于暗室、室内散射光、室外日光及紫外光下,定时测定其 在435nm处的吸光度值(OD435),并分析不同光照对红色素稳定性的影响。 (3)金属离子对红色素稳定性的影响 在红色素提取液中分别加入各种金属离子,使金属离子的浓度分别为 1.250x10一mmol/L、2.500x10-3mmol/L、5.000x10弓mmol/L,摇匀,室温静置lh后测定 其在435nm处的吸光度值(00435),并分计算其残存率,观察红色素在各金属离子溶液 中的颜色变化。 (4)氧化剂对红色素稳定性的影响 配制不同浓度的氧化剂过氧化氢(H20z)的丙酮溶液,分别加入红色素提取液中, 于室内暗处放置,定时测定其在435m处的吸光度值(00435),并分析不同浓度的氧化 剂对红色素稳定性的影响。 (5)还原剂对红色素稳定性的影响 在红色素提取液中分别添加抗坏血酸、亚硫酸钠,使其浓度为O.1%,每隔一段 时间取样,于室内暗处放置,定时测定其在435nm处的吸光度值(OD435),并分析不 同还原剂对红色素稳定性的影响。 (6)酸度调节剂对红色素稳定性的影响 在红色素提取液中分别添加柠檬酸、苹果酸、氢氧化钠和柠檬酸钠,使其浓度为 2%,每隔一段时间取样,于室内暗处放置,定时测定其在435nm处的吸光度值(00435), 并分析不同酸度调节剂对红色素稳定性的影响。 (7)维生素对红色素稳定性的影响 在红色素提取液中分别添加相同浓度的VA、VB、VD和VE试剂,每隔一段时间 取样,于室内暗处放置,定时测定其在435nm处的吸光度值(00435),并分析不同维 生素试剂对红色素稳定性的影响。 (8)常用食品添加剂对红色素稳定性的影响 在红色素提取液中分别添加相同浓度的葡萄糖、明胶、氯化钠和苯甲酸钠等常用 食品添加剂,每隔一段时间取样,于室内暗处放置,定时测定其在435nm处的吸光 度值(OD435),并分析不同食品添加剂对红色素稳定性的影响。 (9)防腐剂对红色素稳定性的影响 在红色素提取液中分别添加苯钾酸钠、山梨酸钾、柠檬酸,使其浓度为O.1%, 每隔一段时间取样,于室内暗处放置,定时测定其在435nm处的吸光度值(OD435), 并分析不同防腐剂对红色素稳定性的影响。 3.2.5.6红色素粗提物抗氧化性能研究
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DPPH抗氧化筛选模型【1排1捌:加红色素提取液l OOpl和0.2 mg.ml’‘DPPH试液 lOOpl于96孔酶标板中,重复实验3次。样品加入后震荡30s,在37*(2和520nm波长 下测定其吸光值(Ap);37"(2保温,20min后再测定一次。测定不加DPPH的样品空 白吸收值(Ac)和加DPPH但不加样品(以80%甲醇100p1代替样品)的吸收值(Amax)。
最后按下列公式计算:

自由基清除率=【1.(Ap—Ac)/Amax]x100%
3.2.6红色素安全性及应用实验

3.2.6.1红色素安全性实验 (1)肿瘤细胞培养‘1231
a.细胞复苏

从液氮罐中取出冻存管,投入42℃温水中快速解冻。然后转入培养瓶中,加适量
RMPI 1640完全培养基,在5%c02、37*(2的饱和适度下培养。 b.传代

当细胞长满培养瓶时,按以下步骤进行传代:
I贴壁细胞传代:

①倒去培养瓶中培养液,用PBS液洗涤一次。 ②用Versene消化液消化5~lOmin。 ⑨加入2-3ml RMPll640全培,用吹管吹打贴壁的细胞,使细胞悬浮并充分散开,
分别移于2~3个细胞培养瓶中。

④分别加入适量的RMPI 1640全培,置于C02培养箱中。
II悬浮细胞传代:

①将培养瓶中的培养液倒入离心管中,离心(1000rpm,3min)。 ②弃上层培养液,细胞沉淀用3mLPBS液洗涤一次。 ③细胞沉淀用2~3mL RMPI 1640全培重新悬浮,并充分吹散开,分别移于2—3个 细胞培养瓶中。 ④分别加入适量的RMPI 1640全培,置于C02培养箱中。
(2)样品的制备 分别称取发酵液冻干品lmg,用1 2.5%DMSO溶解,经O.229m孔径的一次性过滤器 过滤除菌备用。 (3)细胞毒性实验

细胞的亚培养:CHO细胞经0.25%胰酶消化后加新鲜培养液,于37℃、5%C02培 养箱中培养,每2~3d换一次培养液,待细胞生长到对数分裂期,用于下面的实验。 96孔板种子细胞的培养:待细胞进入对数分裂期,将细胞从培养瓶中转移到96 孔板中培养,以每孔2.0×104个细胞接种于96孔细胞培养板中,每孔体积100p1,同时

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留出三个空白孔(不加细胞),于37*(2、5%C02培养箱中培养24h。 加样品与细胞共培养:细胞在96孔板中培养24h且贴壁后,用移液器吸出旧的培 养液,然后每孔加901xl新鲜培养液和101ttl样品,同时设100%对照组、o%对照组,100% 和0%对照孔中90}d新鲜培养液和10I.t112.5%DMSO(其中100%对照组是三个无细胞的 空白孔),每组设三个重复,于37℃、5%c02培养箱中培养72h。 酶标仪检测:细胞加样品共培养72h后,每孔加20“lO.05%Resazurin,于培养箱中 作用3h,用酶标仪检测荧光强度Fluorescence,激发波长530nm,发射波长590nm。依 照下式计算抑制率,抑制率为50%的样品所稀释的倍数为ID50。
细胞毒性计算: Cytotoxicity%=[1一(FLUsample—FLUloo%)/(FLUo%一FLUl00%)】×1 00%

3.2.6.2红色素应用实验 (1)大米染色:取一块白布,加入一定量的色素提取液,浸泡24h后,蒸煮半小 时,烘干后用蒸馏水洗脱,测定洗脱液的吸光值。 (2)自布染色:取适量的大米,加入一定量的色素提取液,浸泡24h后,蒸煮至 熟,观察大米的颜色。 3.2.7红色素发酵条件的优化 微生物在代谢过程中具有多种代谢途径,营养成分的改变或是环境条件的改变容 易引起微生物代谢的改变,所以微生物在不同的培养条件下生长所得的代谢产物是有 所不同的,在我们的试验中,不同的发酵条件所得的发酵产物也是有所不同。故优化 培养基和培养条件对于提高目标产物的产量也是至关重要的。

3.2.7.1液体发酵产生的色素总型124】
(1)菌体的色价:按红色素样品:石英砂=1:5(m/m)的比例称取适量红色素样品和

石英砂于研钵中研磨成粉末状样品,,加入二氯甲烷:丙酮_2:l(W)溶剂,于40*(2浸提
180min,定容至发酵液初始体积数。将萃取液冷却至室温(必要时补充定容),用定 性滤纸过滤。吸取滤液0.25ml放入25ml容量瓶中,加入混合溶液稀释定容至25ml。 于435nm下测其OD值。每次实验每个处理设3个重复,计算平均值并按照以下公 式计算菌体的色素含量(色价)。
E435=OD435×100,单位U/ml

(2)发酵液的色价:用电子天平准确的称取上述供试菌株发酵液冻干粉末200mg, 分别采用乙酸乙酯和甲醇顺序进行浸提,用量为lml。于lOOHz超声波中提取30min。 离心吸取上清液并吹干称重,溶于乙醇或DMSO等溶液,浓度配成为1.0mg/mL。吸 取溶液0.25ml放入25ml容量瓶中,加入混合溶液稀释定容至25ml。于435nm下测 其OD值。每次实验每个处理设3个重复,计算平均值并按照以下公式计算发酵液的 色素含量(色价)。

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e435=OD435×100,单位U/ml

液体发酵色素总量=发酵液色价+菌体色价,单位U/ml。 3.2.7.2色素分泌率的测定分析方法: 胞内外色素测定方法具体见3.2.3.3 色素总量=胞内色素+胞外色素 分泌率(%)=(胞外色素/色素总量)X
100%

3.2.7.3营养性因素对菌株RCEF4029产红色素的影响 (1)碳源筛选试验 供试碳源:白砂糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、甘油、麸皮、可溶性淀粉和 玉米粉(其中麸皮、玉米粉煮沸20min,两层纱布过滤)。 配制培养基:将供试碳源按5%的比例分别与碳源优化基础培养基(葡萄糖4∥L, 蒸馏水定容)搭配,250mi三角瓶装入100ml培养基。 接种培养:将种子用高速分散器打碎,按5%接种量分别接种菌株RCEF4029种 子液,于25℃,120rpm的振荡培养箱培养5d。
(2)氮源筛选试验

供试氮源:蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、蚕蛹粉、豆粕、黄豆粉、NaN03、(NI-h)2S04、 NH4N03(其中蚕蛹粉、豆粕、黄豆粉煮沸20min,两层纱布过滤)。 配制培养基:将含3%氮的各供试氮源(不同氮源全氮含量如表3.6)分别与氮 源优化基础培养基(蛋白胨lO∥L,酵母粉10∥L,蒸馏水定容)搭配,250ml三角瓶
装入100ml培养基。
表3石不同氮源全氮含量
Table 3-6 Total nitrogen
contents

of different nitrogenous

sources

接种培养:将种子用高速分散器打碎,按5%接种量分别接种菌株RCEF4029种 子液,于25。C,120rpm的振荡培养箱培养5d。

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(3)无机盐筛选试验 微生物在生长繁殖和生产过程中,需要某些无机盐和微量元素,如磷、镁、硫、 钾、铁、氯和锰等以作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物。这些物质 一般在低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作用,在高浓度时常表现出明显的抑
制作用。

供试无机盐:KH2P04、NaCI、M92S04、CaCl2、Fe2S04·7H20、K2HP04、ZnCl2 接种培养:将种子液用高速分散器打碎,按5%接种量分别接种菌株RCEF4029 种子液,于25"C,120rpm的振荡培养箱培养5d。 (4)培养基中主要营养因子浓度配比的正交试验 为了深讨培养基中碳源、氮源和营养生长因子等各成分参数相互交叉影响,采用 DPS统计分析软件设计了正交表b(34),各因素、水平如表3.7。
表3.7正交因素水平表
Table 3-7 Lists offactor and level indices for orthogonal analysis ofmineral

compounds

按一定比例配制培养基,250ml三角瓶装入100ml培养基,将种子用高速分散器 打碎,以5%的接种量接于各个三角瓶中,置于120rpm、25。C全温振荡培养箱中振荡
培养5d。

3.2.7.4非营养性因素对菌株RCEF4029产红色素的影响 (1)种龄、接种量、装液量及培养箱的转速对菌体活性成分生成的影响 氧气、菌种的种龄、接种量以及培养箱的转速均对菌种的次生代谢具有较大的影 响。为了综合确定非营养性因子种龄、接种量、装液量及其最佳配比对RCEF4029 菌株次生代谢中产红色素的影响,本试验设计了正交表L9(34),各因素水平见表3.8。
表3-8非营养因子配比因素水平表
Table3·8.Lists offactor and lend indices for orthogonal

ananlysis ofnon-nutrient

factors

(2)不同pH值对菌株产红色素的影响 发酵种子的准备:以营养因素各试验确定的最佳液体培养基为培养基,装液量为

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200ml/500ml,将RCEF4029菌株液体种子以10%(v/v)接种量接种,在25℃、150 条件下培养5d,以备接种。以下种子制备均同。

rpm

试验选用以营养因素各试验结果确定的最适培养基为培养基,装液量为 100ml/250ml,设定9个pn值,依次为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0, 共9个处理,高压灭菌前用lmol/mLHCl和l
mol/mL

NaOH调节到设定的pH值,灭

菌后以10%(v/v)的接种量接种,在25。C、150 rpm条件下培养,各处理3个重复, 培养10d后测定其产红色素的含量。 (3)培养时间对菌株产红色素的影响 以上述各筛选试验确定的最佳液体培养基为培养基进行摇瓶培养,装液量为 100ml/250ml,将RCEF4029菌株液体种子以10%(v/v)接种量接种,pH值为7.5,
在25℃、150 rpm条件下培养,自摇瓶培养第一d起,每隔24 h取样测定红色素的含

量,直到第13d为止,每个样品3次重复。 (4)不同的温度对菌株产红色素的影响 试验选用上述各筛选试验确定的最佳液体培养基为培养基进行摇瓶培养,装液量 为100ml/250ml,将RCEF4029菌株液体种子以10%(v/v)接种量接种,pH值为7.5,
转速150 rpm,比较在15℃、20℃、25℃、28℃、30。C、32℃、35 4C等不同温度下对

菌体生长及红色素的生产的影响,每个样品3次重复。 3.2.7.5培养基及培养条件优化前后对活性物质产生的影响 基础培养基:2%葡萄糖,20%马铃薯(去皮,切成小块煮沸20rain,纱布过虑) 基础培养条件:将已培养了5d的RCEF4029菌株种子按5%的接种量接入装有 120ml液体培养基的250ml三角瓶中,25。C、120rpm振荡培养箱振荡培养,PH自然。 优化培养基:5%可溶性淀粉,20%马铃薯(去皮,切成小块煮沸20min,纱布 过虑),0.25%蚕蛹粉,0.075%KH2P04 优化培养条件:将已培养了5d的菌株种子液按10%的接种量接入装有100ml 液体培养基的250ml三角瓶中,pH值为7.5,在28。C、转速150 rpm,振荡培养箱振
荡培养。

3.2.8活性物质的分离制备和分析 将筛选出高活性的提取物用色谱法初步分离成不同组分,然后分别进行活性测 定,找出活性组分。根据高分辨HPLC.MS得到的精确分子量及分子式,从天然产物 数据库中搜索,如果活性化合物是己知物,则可直接从数据库中得到其有关性质和结 构式,不必继续分离制备。如果活性化合物是未知物,则进行大量的发酵和提取,用 常压柱色谱或高效制备色谱制备化合物纯品并进行纯度和活性确认,最后通过核磁共 振测试化合物的氢谱和碳潜,进行结构鉴定。 3.2.8.1活性指导下的制备(高效制备液相色谱法)
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样品前处理:将红色素提取液用氮气吹干后,用甲醇将其溶解配成30 mg/mL的 甲醇溶液,用0.451xm孔径的滤膜除去样品中的杂质,使样品澄清透明。 流动相:采用乙腈梯度洗脱 色谱柱:使用Synergi 进样量:309l 洗脱速度:15
ml/minl
Hydro—RP,4.6×250 mln,4 lxm,RPl8

检测条件:采用300nm、254nm和210nm波长检测 样品收集:按峰收集,收集时对无峰的流份也要收集以免目标组份流失。收集到 的各个流分合并组成一致的收集管,浓缩干燥。取一定量用DMSO溶解配成1200
l上g/mL

12.5%DMSO的浓度,进行活性测定。

3.2.8.2活性物质的结构鉴定 取纯化后的活性物质冻干粉配制成O.1mg·m14的甲醇溶液进质谱分析,电离为 ESI,流速0.69l·rain"1,进行阴离子模式测试分析。

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4.结果与分析
4.1菌株在不同培养基上的生长速率
将85株菌株由斜面转接至铺了玻璃纸的PDA平板上培养4 ̄5d后,用打孔器(直 径5mm)沿菌落边缘切取菌丝块,分别移至PDA、SDAY、察氏、酵母蔗糖、淀粉五 种不同培养基的平板中央,通过测量菌落直径并计算生长速率来筛选培养基。初筛具
体结果如表年1所示。
表4-l
Table 4-1

不同培养基对不同菌株生长速率(mm/d)的影响
on

Effect ofdifferent kinds ofmextia

the growth ofdifferent stains(mm/d)

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RCEFl088

9.87+2.20 8.00-]=1.62

7.0742.25

5.12--1=2.14

6.38+1.54

5.45+1.35

RCEFI 102

4.00-J=1.55

2.36士0.97

4.38士1.36

7.IOJ=2.04

RCEFl289 RCEFl433

7.86=L-0.83

6.85+0.45

4.32--L-0.74

5.56=t=1.27 8.04=b0.39

4.57+1.44

10.86i-0.55

10.68--+0.85

8.25:L0.78 15j5+i.80

9.14i-0.56 13.20i0.74

RCEFl439

16.50=L-O.62

15.37=L-0.73 l 1.02.--+0.85

13.42-+O.49

RCEFl454

13.37士o.64 5.05:t=1.77

7.83i-0.68

4.43+1.12

4.55i-0.98

4.85:t-0.79

1.77+1.50

2.08=L-0.34

2.55+1.56

I配EFl580
RCEFl669

5.56a=036

4.42--+0.86

4.65+I.80 7.63=L-0.64

3.44i-0.40 4.43+1.12

3.42_L-'-0.76 4.05i-0.98

13.OO士0.70 15.00-J=1.74

11.02i0.80 14.33=t-0.43

11.674-1.53

12.50士1.33

12.50J=1.78

RCEFl724

9.55=[-0.79

7.67i0.85

6.65=L-0.94

6.54+1.30

6.354-1.55

RCEFl903

16.56a=2.10

16.354-1.75 12.14i0.83

15.05=t-O.88 10.12_4-0.72

14.75=L-0.67 10.36-x0.42

9.05-a=1.46 11.16-t:1.27

RCEFl979

16.53士1.42 7.89a=0.85

I配EFl986
RCEF2982

6.95=L-0.45

4.52--+0.74

5.96a=1.27

4.574-1.45

5.64+1.24

4.95土o.85

3.45-x-0.97

3.58i-0.86 5.06a=1.25

3.50-l-O.8l 4.56a=1.04

RCEF2985

7.80土O.73 21.15士O.61

6.45=1=0.40 19.65=L-0.81

4.72士o.72 10.24i-0.64

RCEF4029

9.851-0.47

12.25=L-0.52

U0027
LR.044

6.50i-0.69

5.32--1=0.76

6.10-J=1.82

4.02士0.40 2.58+1.30

3.42--+0.68 2.554-1.70

5.00-a=1.70 13.74士1.13

4.63=tO.89 12.95士0.8l

177士1.58 13.05士0.96

L10-058

12.58=L-0.46

12.50士0.82

U艮063 Uk075 U艮113 L】艮166
HK一3

18.05士1.35

15.26+1.24

9.92士O.98

11.55i-0.75

l 1.42a=1.46 3.02土o.73

5.56-x-O.35

4.42_40.87 16.36t:1.35

5.1 5+I.80 10.92_+0.94

3.42士O.40 9.45=t-0.65

17.054-1.45 7.50圭O.68

lO.12士1.38

6.361-0.65

5.10-J=!.03

4.42-士o.86

3.32i-0.77

6.5帕=0.50
5.54=L-0.60

4.32.-L-0.72

6.10-]=1.72

4.12--+O.42

3.72--+0.74

HK-16

4.32士o.72

5.10士1.56 14.10士1.85

2.02--t=C1.42 13.02--+0.49

3.02士O.75 13.021"-0.70

HK.25

14.5帕=0.66
20.054-1.05

13.32士O.74 18.16-J=1.42

HK枷
m(-63
HK072

9.95=[-0.91

11.45-J=1.38

10.72-士1.22

13.36士2.02

12.454-1.80

lO.15i0.88

9.95=[-0.72

9.25+1.42

6.50士0.58

432士o.74

5.10-J=1.72 15.10a=1.86

4.02--1:0.42 12.02-L-'-O.49

3.72--+0.76 13.02.-+0.75

HK.77

14.5帕=0.69
9.57士O.83

14.32土o.74

HK.85

8.58士0.74 16.16a:1.34

5.42-+-0.97

5.93+1.20

4.78a=0.86

HK.9l
HK.98

18.03+1.12 14.36a:2.25

9.92-+0.86

9.55:L-0.46

10.32=1=1.26

12.05:t=1.87

10.05i0.80

9.94=[-0.63

9.25:L1.40

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由表禾1可以看出: (1)各菌株在5种培养基上都可以生长,但是生长特性(生长速率,颜色鲜艳程 度等)有所不同。在PDA上生长很快,有的菌株在96h后培养基中就分泌出了色素。 SDAY培养基其次,而大多数菌株在察氏,淀粉和酵母蔗糖培养基中生长相对缓慢, 192h后才有色素生成。由初筛的结果可以看出RCEF4029与RCEF0241生长情况最好, 6d[/I]可长满平皿,说明菌株活力较强,且色泽较为鲜艳。其次的是HK.-60、RCEF0242、
LR.063、HK.9 1、RCEF0708、RCEF0649、RCEF0689、RCEF0458、LR.1 1 3、RCEF0442、

RCEF0961、RCEFl903、RCEFl439,生长情况良好。由此可见它们的菌株活力较强, 无论是从开发高产天然色素方面考虑,还是从阐明真菌的环境毒理或抗虫机理方面, 这些菌株值得进一步研究。 (2)不同地理来源、不同寄主、不同种属的菌株,其菌丝生长速率存在着较大差 异。总体而言,镰孢属和粉拟青霉属的生长速率较大的菌株较多,菌丝生长速率平均
约在10.00mm/d以上。

(3)同种的不同菌株其菌丝生长速率也差别很大。这种种内差异大的现象是可能 是由于不同菌株的寄主来源不同,或来源地生态环境不同,或转接传代的次数所不同 造成的,因为来源于不同寄主的菌株,由于长期与寄主的协同进化作用,可能会产生 了不同质或量的细胞毒物质;同时,大量资料表明虫生真菌是一类较易变异退化的真 菌,同一菌株在人工培养基上继代培养,有时毒力会迅速下降。 (4)以上试验数据表明大多数菌株在PDA培养基上生长速率最大,颜色也最为 鲜艳(虽然RCEF0444、RCEF0501、RCEF0197、RCEF0799在淀粉培养基中生长速 率较大,RCEF0679、RCEF0639在SDAY培养基中生长速率较大,但颜色均不鲜艳, 有的几乎为无色)。 所以选择PDA培养基为各菌株生长的基本培养基。初筛得出生长速率较大的15 株菌株分别是:RCEF4029、RCEF0241、HK.60、RCEF0242、LR.063、HK-91、
RCEF0708、RCEF0649、RCEF0689、RCEF0458、LR-113、RCEF0442、RCEF0961、 RCEFl903、RCEFl439。

42

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】R,-'E】q029 2 RC】,H)24I j R【一bP0242


匦j隧!黛j 腻辫i囤蕊i
JlK 3 5 HK-72 6¨K-85

目4.I部*苗落特征

Fi94-111l…nt口colony cbaracLcris[ics
4.2菌株的复筛试验
分别测定仞筛所得1。五株菌株的胞内也素OD值、胞外色秉OD值,通过比较两项
数值犬小、综合胞内外OD值大小以及苗丝体|熏大小筛选出目标茼株。复筛具体结 果如表4-2所示。
表4.2胞内外色素OD值&苗&体十熏
Tablc 4 211lcOD ofinsldc and outsldc ce|l

a耐Ihc

dryweight ofmyeellum

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由表4—2可以看出:RCEF4029胞外色素OD值为O 39,胞内色素OD值为0 大的。HK一60虽然胞内色素OD值较大为o 64,但其胞外色素OD值较小为0

63,

是综合OD值最大的菌株,其菌丝体千重为3 119,也是所有菌株中菌丝体干重值最
14。

综合胞内外OD值人小、菌丝体干重和荫株牛眭活力等多项凼素考虑,复筛得出的高
产菌株RCEF4029为H标菌株。


3目标菌株的鉴定
l目标菌株形态学特征

4.3

RCEF4029在PSA培养基上7卜长良好,平扳培养扯5d后菌落中央的菌丝体顶部 长山少量浅黄色从七突起,5~7d后荫落中央颜色变深,并逐渐变成紫红色,苗蒋背 面出现也斑=if二有波纹m现。8~lod厉于[!}予的数量已经牛H当多,卣薄背而旱深紫红色, 气生菌丝发达,密到二丛市,少匍匐,蔺落致密,质地早棉絮状下展。25℃培养Io ̄12d 直径i:1f达到诮落阿径哒7—8Cln左打,无渗¨:液,尤特殊气啉,边缘整齐(见图4_2)。




7l二茁丝和堆内菌丝均很}市,坫山茼矩交织紧密,有人量分支,小断裂。基内

茼始‘一红色;气_一曲矩体发j占,只横隔,分牛胞了梗单,J,柔…l或直,长约15~25“m.

V!端¨、膨大。瓶槛牡部呈桂状,向L变成一坌}l|K颈部(幽a、b、c、c)。孢子形态为

镰刀形战椭划形、生链状州例、光滑,大小为3
长过程t"分泌剑细胞外的(见幽4-31。 ~

0-5

09m(图c)。结合以r特征,可

以将RCEF4029初步鉴定为埘r濂川苗埔。图4-2 d中lJr以叫显打H{色素是菌丝体生

惑。璧
目4 2自株RCEF4029自落Ⅳt

Fi酷一2Colonial

morphology orRCEF4029

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目4-3

H生孢f和孢子
sD0∞of
RCEF4029

Fi94-3 Conitliophore and

4 3

2培养特征

RCEF4029柚人多数特征上齐养牡1.的苗落特缸·干燥、不透叭表而里敛甯的棉
絮状,卜确一薄层淡红色干粉:菌溶和培养牡链接紧密,难以挑墩:茼落的JI:反而颜

色在不同的培养牲1.柯时会不一样。茼株能在大多数培养基】一生K良好,。L生菌丝大 多数为红色,基山苗她在不同培养基上变化较人,旱紫红色、红色、黄色或无色等。

该菌株在各利啭征培养基』二的具体培养特征如表4-3所,再。
表4.3 RCEF4029培养特征 charact明stlc‘1f【tcE刚029
Table 4 3The culturatlon

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4 3 3

RCEF4029菌株的分子生物学鉴定

分子生物学方法越来越多地被应刚于真菌系统学研究和分类鉴定,DNA序列分 析被认为是真菌鉴定最卣接、最明确的指标之一。为了进步确定活性较高的 RCEF4029菌株的分类地位,利_|=}J分子生物学方法对其进行确定。
4.3 3 1

RCEF4029菌株DNA提取电泳结果(见陶4—4)

国44 RCEF4029菌株的DHA结果电泳目
Fi94—4

Eject‘叩horg口m

ofRCEF4029DNA

4 3

3.2RCEF4029悄林PCR打增电泳

RcEF4029曲林利用引物n S4}[IITS5-JJ。增得到的PcR J扎物,大小(k500bp--700bp 之间(图4—5),洲J孚结粜表n)]PeR扩增得到rITS一5 8srDNA区域的目的”段。


国4


鏊甍謦墨
PCR扩增镕果自泳目

Fi94 5 E1ectrophorgram ofRCEF4029 pCR

4 3 3.3

RCEF4029菌株的序列分析

经纯化的PCR产物直接送上海英骏生物技术公刊洲序,测JF所得RCEF4029菌 株的nrDNAIq S区的准确JF列己在Get,Bank巾注册,』C学录号为EU360591。 将测得的ITs序列在GenBank序,Ⅱ侔中做BLASq、,找…与之最人J11似性的序列, 下载相似序列的ITS区域,HjClustal W(BioEdit7


0软件1进行序列kgX'J'(Multiple

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alignments)。RCEF4029与在GenBank中登录的串珠镰刀菌(Fusarium momiliforme,
EF488401.1)和镰刀菌(Fusarium sp.EF488399.1)等相似度为99%。

因此判定RCEF4029菌株为串珠镰刀菌(Fusarium momiliforme.)。将EU与登录号 为EF488401.1的序列比对如下:(其中Query为RCEF4029序列,Sbjet为EF488401.1序
列)
Query


GTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAC-CGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAA

60

…II I|Il ll II II I|…I|II…l||I II ll II lI I|…|I||II Il|I II Il ll
Sbjct
Query 3

GTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAC狮ATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAA
AcCCcTGTGAACATACCTATAATTTGcCTCGGCAGACTCAACGACGGTGcTCCGAGAGAT

62

61

120

Sbjct

63

AcCCCTGTGAACATACcTATAA瞅C1、cGGcAGACTc从CG^cGGTGCTCCGAG从AT
cGGGCGcCGcTCGCTGGCAGAGGAAcCcC从ACTcTATGTATTCTTGTGGATclvrCmAG

l|Il II¨|I Il lI If||…|I l|||I|I lI…I|I…|||I II Il ll|l…l

I I

122

Ouery

121

180

Sbjct

123

II…I|I|…Il lI||I||I lI I|I|||II|l…Il II……I|I||I lI lI I|I CGGGCGCGGCrCGCTGCCAGAGGAACCCC从ACTCTATGTATTCTTGT(而^TI珂TCl’GAG
T从从C从从CAAATA从TC从从cTl’TC从CAACGGATcTCTTGGTTCTGGCATCGATG

182

Query

181

240

Sbjct

183

……………||I|||I……Il I|…|I lI II…Il Il||Il…l|… TAAAACAAAACA从TAAATCAAAACTTTC从CAACGGATCTCTl’GGT7rCTGGCATCGATG AAGAAcGCAGcGJm、TlZGATAAGTAATGTG从1vI优AGAATTCAGTGAATCATCGAATC Il…|I…|I…|||I II…l…II II¨II¨Il…II Il lJ…I|……

242

Query

241

300

Sbjct
Query

243

从GAACGC嬲AAATGCGAT』诅GTAATGTGAA”陷CAG从TTCAGTG从TCATCG从1℃
lI I|I|Il¨…I|I|…|I I¨…|I…|l…l Il…¨…Il||…|I lI

302

301

’I。I。I‘G从c(;CA(二A.I’I’GC(五CC(℃CAGlIA。I”I.c’I'G(×X×××:A’IIGCCI.G’I”IU;^l××汀CArl’I℃
1vrTG^^cGCACATTGCGCCcGCCAGTAlvrCTGGCGGGcATGCCTGTTCGAGcGTCAlvrTc

360

Sbjct
Query

303
361

362 420

AACCCTCAAGCCCCTAG(舄CIvI粥TGT,rGGI∞ATCGGCGATAGl℃GCCGTCCCCC~执TC II I||l II…I I lI…Il JI…¨I|II|I…I|…I|l||l I|lI|l||II||
AACCCTc从GcCC—TAGGGcTTGGTGTTGGGGATCGGCGATAGTCGCCGTCCCccA从Tc

Sbjct
Query

363

421

421

TAGTGGcGGTCTCGCTGTAGCCTCCAlV眦TAGTAGCT从CA(舢GCAACT(沿从cGC
I|I||I lI…II l||J||……|I II l…I|lI l fI lI II II II l……|I II I TAGTGGCGGT(丌CGcTGTAGoC7r(℃ATl’GCG驯屺TAGCTAACACCTcGC从CTGG从CGC
GGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGG—’TAGGAA

480

Sbjct

422

481

Query

48 1

539

¨Il…||…|I II…lI|I II|l lI J|lI|I l||lI II j|I||I…II…I|I
Sbjct
482

GGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGGTAGGAA

541

与登录号为EF488399.1的序列比对如下:(其@Query为RCEF4029的序列,Sbjct
为EF488399.1的序列)

47

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Query



GⅨ4C舢卯7研比g玎锚7矧优嬲伍侧猫谢Z翻,翻巧黝G77翻翻一(及fr潮
If I|Il…||…Il II II l ll Il I|ll l II|l lI|I|I ll II Il ll I|I|l|I||l I| GTAAC从GGTcTcGGTTGGTG从CCAGoGG^GGG^TCATTACcGAGTTTAC从CTccCA^

60

Sbjct
Query



60

61

KCC吼吼G№讯憾双峨氏晡n瓯吼C蕊c№撇C弛娲№漱骶瞄嗡嗡峨
ll lI ll…ll Il I ll ll Il…ll…l|ll I|I||I…|I Il|I¨Il|l|I||II

120

Sbjct

61

ACcCC飞吼G醯c帆阮既岍^娜1虢研CGGc№撇c憾G№添m既C魄晦陋鼹
cGGGCGCCGC,I'CGCl优CAGAGG从cCCCAAACTcT^TGTAll’CTTGTGG^TCTTcTGAG II II……II……II l|ll II II II…lf……|I||I|…I|……II
cGGGCGcCGCTcGCl'GCCAGAGG从CCCCAAuACTCT^TGTAlvrcTTGTGGATCTTcTGAG

120

Query
Sbjct

121

180

121

180

Query

181

TAAAACAA从C^叠A11AAATCAAAAC’I耵CAACAACGGATCTCll脚TCl僦ATcG^TG
T从AACAAAACA^ATAAATCAAAAC?m’C从CAAC粥A’I伽T1粥TTCTGGCATC铋TG
AAG从CGCAGCGAAATGcGATAAGT从TGTGAATTGCAGAAlvrCAGTG从TcATCG从TC II¨|I II…II II Il lf ll ll I||I|I Il ll lI||lI lI II Il lI…|I Il l|…l

240

Sbjct
Query

181

240

241

300

Il¨…l|…lI II l II…ll lI|I II I|I…Il…lI ll…I||I II|I l lI I
Sbjct
241

从G从CGCAGCGA从TGCGATAAGTAATGTGAA7门、GCAG从TTCAGTGAATCATCG从TC

300

Query

301

mG从CGCACATTGCGCCCGCCAGTAlKT唧G(把ATGCCl‘G1vrCGAGCGTCAr盯C
|I……ll…l|l||I l|lI}Il…l|l I|f||I||||I||||I II||…||…
’Ivll’GAACGCAc』~TTGCGCCCGCCAGTATTCTGGOGGGCAT(七CTGTTCGAGCGTCATTTC

360

Sbjct

301

360

Query

36 l

AACCCTCAAGCCCCTAGGGCTTGGTGTTGGGGATCGGCGATAGTCGCCGTCCCCCAAATC

420

…|l|I…II|I||I|…||II||…………l||l I|……lI|l Il ll l
Sbjc t Query
36 1 42 1

AACCCTCAAGCCCCTAGC迅CTTGGTGTTGGGGATCGGCGATAGTCGCCGTCCCCCAAATC TAGTGGCGGTCTCGCTGTAGCCTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAACGC

420 480

…I|II I||l l||l|l||If…II lI lI I||||||I I||I l|II ll Il…¨lj…
Sbjct Query
42 1

TAGTGGCGGTCTCGCTGTAGCCTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAACGC GGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCC-AACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGG

480

48 1

537

|I|l|l…I||I…|I II|||l I lI l||l lI¨¨¨j||I l||I Il……I l
Sbjct 481 GC圯GCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGG 538

4.4红色素的提取
4.4.1红色素含量测定所用最佳波长的确定

由于提取液中存在着蛋白质、核酸等众多物质,这些物质在紫外区均有吸收,因 而选取可见光的最大吸收波长测定提取液中的OD值,可以提高色素含量测定的灵敏 度和稳定性,避免其它因素的干扰,能够更准确的反映色素的相对含量。故后继研究 中天然色素相对含量的确定均以OD435为指标。

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‘0∞《B


棚0口。



。。

删啪蛳l

姻∞睡

嘲嚣岔
,:7



图4石红色素可见光波长吸收值
Fi94—6 The absorbing values ofred pigment in visible light wavelength

4.4.2色素的提取 4.4.2.1破壁提取红色素效果的比较

本试验研究的红色素为细胞内产物,破壁的效果直接影响红色素的提取率、质量 和生产成本。因此,研究红色素破壁具有重要的现实意义。本文采用了五种破壁方法, 细胞碎片用二氯甲烷溶解后在435nm处测定其吸光度,吸光度越大说明其破壁效果 越好。
Table4-4

翱红色素破壁效果的比较
Comparision of the effect of destroying the red pigment‘s cell wall

从表4.4可以看出:五种破壁方法中,酸热法的破壁效果最差,几乎没有色素从 细胞内释放出来;其次是甲苯法,溶液的吸光度只有0.39;然后是细胞自溶法和超声 波法。其中超声波法的破壁效果较显著,总吸光度达到1.79;破壁效果最好的是研磨 法,总吸光度达到2.58,而且研磨法实验步骤简单,所需时间短,实验结果的准确度 较高。所以本实验选择研磨法为最佳破壁方法。 4.4.2.2菌体干湿状况对色素提取的影响 在实验中发现,将过滤得到的湿菌体直接用有机溶剂浸提的效果不够理想。所得 到的浸提液色素含量很低,且对浸提液进行浓缩时,因含水过多,有机溶剂蒸发慢。 而将湿菌体予50。C恒温干燥箱中干燥24h,再将干燥菌体碾磨成粉末,浸提速度明显 高于湿菌体,且浸提液色价也明显提高,进行浓缩时所需时间短、温度低,避免了因
49

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长时间浓缩而使红色素发生部分聚合反应,导致浓缩液结块产生沉淀而变性。因此将 菌体烘干后进行色素提取效果较好。 4.4.2.3有机溶剂提取法 目前最常用的色素的提取方法是有机溶剂浸提法,该方法所要求的设备简单,操 作容易;本实验中试用了超声波提取和微波提取,并对其提取效果与经典的浸提法作 了比较;另外,超临界流体萃取(Supercritical fluidextraction,SFE)是70年代末在工 业上得到应用的一种新型分离技术;它具有提取无有机溶剂残留的特点,能否在本实 验中运用有待研究。 (1)单一溶剂提取实验结果 单一溶剂提取的实验结果见图4.7,本实验分别对石油醚、丙酮、甲醇等8种有 机溶剂对红色素的提取效果进行了比较。 其中,二氯甲烷和丙酮的提取效果最好,其次为甲醇、乙酸乙酯、甲苯、石油醚、 乙醇,正己烷的提取效果较差。方差分析结果表明,不同溶剂对红色素提取的效果间 有显著差异(p<O.01),而提取效果最好的二氯甲烷,所以本实验选用二氯甲烷为最佳 提取溶剂。

石油醚

丙酮

甲醇

正己烷 溶剂

甲苯

乙醇

乙酸乙酯二氯甲烷

图4-7单一溶剂提取实验结果
F.94-7 The experiment of solution factor

(2)混合溶剂提取实验结果 混合溶剂提取实验的结果如图4—8:本实验选择了12种混合溶剂比较其对红色素 提取的效果。从图中可以看出,混合溶剂二氯甲烷:丙酮--2:1时,提取色素的吸光度 最高,说明其提取效果较好;其次是二氯甲烷:甲醇=1:l,二氯甲烷:丙酮=1:2,二氯 甲烷:乙酸乙酯=1:l,二氯甲烷.o丙酮=l:l,丙酮:甲苯=l:l,二氯甲烷:丙酮=5:l。其余 的混合溶剂提取效果较差。 因此本实验选择混合溶剂二氯甲烷:丙酮=2:l为最佳提取溶剂。

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3 互 5 2 L 5 l 仉 5 0

趔口。

:∥∥么∥一>
3 2.5 2

[蜜.圉。图.雷 。雪。雪

。雷

。雪

。宙

.图.蚕 。由。

智1.5 o


0.5



温度(℃)

图4_9温度单因素实验结果
Fi94-9 The experiment

oftemperature factor

(4)时间单因素实验结果 实验结果如图4—10。从图中可以看出,当提取时间从30min增加到60min时,吸 光度略有增加,当提取时间达150 min时,吸光度达到3.144。但时间继续延长,吸 光度无明显上升趋势。经方差分析,提取时间对实验结果没有显著影响(p>O.05),
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由于提取时间越长,越容易使色素分解。 所以实验选择150min为最佳提取时间。
4 3·5 3 2.5



2 1.5 l O.5 O 30rain 60rain 90rain 120rain 150min 240min

时间

图4—10时I司单因素实验结果 Fi94—10 The cxpcdmcnt oftimc
factor

(5)料液比单因素实验结果 实验结果如图4一11所示:实验比较了料液比为1:10,l"15,l:20,1:30和1:40时, 对红色素的提取效果;经方差分析,料液比对提取效果有极显著的影响(p<0.01)。从 图4—11中可以看出,料液比为1:30时总吸光度EA最大,总吸光度ZA越大,说明 提取效果越好。 所以本实验选择浸提的最佳料液比为1:30。
25

20

15 《 W 10



0 1:20

料液比 图4-1 1料液比单因素实验结果
Fi94—1 1 The

experiment ofmaterial/liquid factor

(6)红色素提取的正交实验结果 对红色素的提取做正交实验,以获得最佳提取条件。实验结果见表4—5。

52

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表4—5以红色素提取率为指标的正交试验分析表
Fig.4—5 Analysis oforthogonal

experiment for the extraction ofred pigment

平均提取率(%) 试验号
A TestNO. B C D extraction rate

提取率(%)

extraction
● 2 l 。 , 。 2 8437 85.64 82.38 79.68

rate

84.13 d D





2 3

80.05

81.47

80.40 eE



l 2

3 。



88.56

87.58

86.64
90.65

87.49cC

4 5





89.58

88.85

89.69b BC 91.26bB







. 2

92.56 93.14

90.08 95.65

91.15 96.05





3 ,

。 3

94.95

aA

7 8

3 3



70.15

7I.24

71.18

70.869G 72.15 gG 76.65fF







72.05

73.25 77.32

71.15 76.18



3 7 5 豇3 7 8 2 Z7 I

K 磁 磁
k 乜 b 极差R

6 5 &9 7

~ ~ 一
蝴 蚴 一



~ 一 ~





~ ~ ~




76.45

8 4 e:4

9 l 97 7 3 22




1.35


1.75

16.89

4.62

从表4—5可以看出A的极差值最大,其次是B、C,为进一步考察各因子对指标 的影响,进行完全随机模型方差分析。
表4石正交设计方差分析表(完全随机模型)
Table4-6 Variance analysis

ofthe orthogonal experiment(total random model)

变异来源
variation origin A

平方和
square 1594.42

自由度
freedom

均方
mean square
797.2l

F值
F value


显著水平
significant level
幸幸

640.05
59.9l 4.18



149.24 10.40

74.62

●●



5.20



误差
22.42
erl'or

1.25

总和
total

1754.07

53

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根据显著性检验结果可知:在99%的置信度下,因子A、B对色素提取效果具有 极显著性影响,因子C对色素提取效果具有显著性影响。由上表可确定最佳工艺条 件为A283Cl,即料液比为1:30,提取时间为180min,温度40"C。 (7)红色素提取级数的确定 实验结果见表4—7,第4次提取红色素后,VxA只有0.057,说明红中的色素几 乎全部被提取出,所以选择4次提取的吸光度之和作为红色素的总的吸光度。从表 4.7可以看出,红色素经3次提取后,提取率就达到了99.47%,因此确定红色素的提 取级数为3级。
表4—7红色素的提取级数
Table4·7 Extraction ofred pigment series

浸提次数
2 extraction 3 4

times

4.4.2.4超声波提取实验 实验结果如图4.12所示:在超声波清洗器功率一定的条件下,当提取时间从10min 增加到50min时,吸光度一直上升,再延长提取时间,吸光度的变化呈下降趋势。经 方差分析,超声波提取时间对此实验的提取效果有极显著影响(p<O.01),选择50min 为超声波提取的最佳时间。


3.5 3 2.5

磐2 o
1.5 l O.5 0 40min 50min 60min 70min

时间(rain)

图4.12超声波实验结果 Fi酣·12 Ultrasonic甑tract
experiment

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4.4.2.5微波提取实验结果 (1)微波提取功率的确定 试验结果如图4.13所示:图中显示了微波炉功率分别为70W,210 W 350 w:490 w和700 W时对红色素的提取效果。在功率为490W时,测得提取液的吸光度值最 大,功率70W时吸光度值最小。经方差分析,使用不同微波功率提取的效果间无显 著差异Q>o.05)。为降低能耗,本实验中选择70W为最佳提取功率。由于实验中使 用的是普通的微波炉,只有以上几个固定的功率,不能完全按照实验要求具体的选择 条件,否则或许有更加适合提取红色素的微波功率。



1.5

趔 8


o.5

O 70W 210


350



490



700



功率(W)

图4.13微波提取功率实验结果

Fi睁13 (2)确定微波提取的最佳时间

Microwave power extract experiment



1.5



0.5

0 40



80

loo

图4-14微波提取时问实验结果
Fi94-14 Microwave time
extract

experiment

实验结果如图4—14:在微波功率为70W的条件下,当时间从20s增力nN60s时,提

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取液吸光度增加到最大;从60s至U增NN80s,吸光度没有明显变化;从80s开始,吸 光度开始有下降趋势。经方差分析,微波提取的时间的长短对实验结果有极显著影响 O<0.01)。因为随着微波提取时间的延长,溶剂的挥发也增加,因此本实验选择微波 提取时间为60s。 4.4.2.6三种方法的比较结果 由实验方法3.2.4.3,比较了浸提、超声波提取和微波提取三种方法的提取效果, 实验结果见表4—8:其中超声波提取所得溶液的吸光度最大,微波提取后溶液的吸光 度最小,说明超声波提取的效果好;在本实验中这三种方法都是比较好的提取方法, 但是还不够理想,比如有机溶剂浸提的方法简单,但实验所需时间较长;超声波提取 所需时间较短兼有破壁的功效,但是需要专用设备,而且不方便控制温度;而微波提 取的时间最短,但是温度无法控制,导致溶剂挥发严重。由于本实验中所用的超声波 清洗器是固定功率且不能控制温度,无法找到最适合提取的条件。而有机溶剂浸提可 以达到实验的要求,且便于实验室操作,因此选择有机溶剂浸提法作为该实验的提取 方法。
表4—8三种方法的比较结果
Table,4—8 Comparison ofresults ofthree methods

4.5红色素的性质
4.5.1红色素的外观特征 50"C烘箱烘干的菌丝体经粉碎机粉碎得到紫红色粉末状色素粗产品,该色素产品 经高温处理颜色不发生变化仍为紫红色,说明该色素有较好的耐高温的性质;经冷冻 干燥处理的发酵液色素粗产品也为紫红色粉末,该色素产品经低温处理颜色不发生变 化仍为紫红色,说明该色素有较好的耐低温的性质。 4.5.2红色素的溶解性 该色素为脂溶性色素,易溶于碱性溶液,可溶于酸性溶液,但酸性越强颜色会发 生变化。可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正己烷、甲苯、石油醚等有机溶剂,极易溶 于氯仿、二氯甲烷、丙酮等有机溶剂。 4.5.3红色素的色泽变化性

.(1)红色素在酸陛条件下显棕黄色,pH值越低,紫红色越弱;碱性条件下显紫红
色,碱性越大,红色越深。科学研究表明健康血液(人体最重要、量最多的体液)的pH

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值呈弱碱性,为7.35 ̄7.45。如果低于7.30,人体就处在亚健康状态,极有可能得各 种严重疾病,如心脑血管病、骨质疏松、肾结石、关节炎、痛风、高血压、癌症、高 脂血症等等。所以多食用碱性食品有利身体健康。本实验所研究红色素在碱性条件下 颜色变深,在弱酸条件下颜色变化不显著,这一性质可将其作为碱性食品色素添加剂
开发。
表4-9色素在变色范围pH2.0--12.0缓冲液中的颜色特征
Table4-9 Characteristics ofcolour
on

red pigment in the p82.O~12.0

buffer

溶液pH值
solution pH value 3.8 4.1 4.4 4.6 4.8 5.1 5.5 6.0

色素颜色
the color of

棕黄色
light brown
red

浅红色 浅红色
一.1ightred

浅红色 light red
light

浅红色 红色 :
red

红色
red

红色 red

pigment


red

处理条件
treatment conditions

颜色反应 color
reaction

可见光下水溶液
aqueous solution under visible light

紫红色
purplish

red

紫外光下水溶液
aqueous solution

紫红色
purplish

under trY-light

red

氨水处理
ammonia treall"neat

紫红色
purplish red

浓硫酸介质中
oil ofvitriol

黄色
yellow

FeCI,溶液
FeCl3 solution

暗红色 darkred 紫红色沉淀
dark

中性醋酸铅溶液 neutro-Pb(CH3COOh solution 盐酸溶液
hydrochloric acid

purplish red

黄绿色
yellow-green

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Na2C03溶液
Na2C03
solution

暗红色
dark red

由表4.10可见,该色素经不同的物理、化学处理后,其颜色会有所不同。在可 见光和紫外光下所显紫红色是其本色;而经氨水、浓硫酸介质、FeCl3溶液、盐酸溶 液、NaEC03溶液处理显示的颜色变化是由于溶液的pH值不同所致;铅离子使色素 形成沉淀,可能是因为与色素形成络合物,从而形成沉淀。 4.5.4红色素的光谱特征 用酶标仪对色素提取液进行全波长扫描,确定色素溶液的最大吸收波长为 435nm,具体见图4—6。
4.5.5红色素的稳定·陛

4.5.5.1温度对红色素稳定性的影响 在不同温度条件下,色素液的吸光度与时间的关系如图4-15。由图可以看出,在 室温20。C条件下红色素保持稳定,随着时间延长,其吸光度变化不大;在一定的温 度条件下加热红色素,吸光度增加且随着温度的升高,在60。C以下随时间的延长吸 光度值变化不大,说明红色素在60。C以下比较稳定;当温度为70℃时,随着时间的 延长,溶液的吸光度略有下降的趋势。总体来说该红色素的耐热性较好。 由于红色素是一种脂溶性色素,而有机溶剂大部分都易挥发,一旦温度升高就会 造成溶剂的损失,从而使其浓度增加,导致吸光度值升高,实验的误差必然增大。所 以本实验将温度控制在60。C以下,以减少溶剂挥发,从而在一定程度上减小误差。
20℃ 30℃ 40℃ 50℃

60℃ 70℃

图4.15温度对红色素稳定性的影响
Fi94-15 Effect

oftemperature

On

red pigment stability

4.5.5.2光照对红色素稳定性的影响 由图4.16可知,红色素溶液在避光和室内散射光照射下,其吸光度值随存放时 间的延长无大的变化;在室外散射光照射下其吸光度值随存放时间的延长会略微下

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降,总的来说该红色素有较好的光稳定性。 由图4.17可知,紫外光对红色素的稳定性有一定的影响,溶液在紫外灯下放置 90分钟后,色素的残存率为开始的50%。


2.5

避光 室内散射光 室外直射光



●C

趔l·5



0.5

0 O 5 lO 15 20 25

时间(h)

图4.16不同光照对红色素稳定性的影晌 Fi酣一16
3 Effect ofillumination
on

red

pigment stability

2.5

2 《

趔1.5
口 o l

O.5

O O lO 20 30 50

时间(Min) 图4.17紫外线对红色素稳定性的影响

Fi胂17

Effect ofUV-ray irradiation on

red pigment stability

4.5.5.3金属离子对红色素稳定性的影响
表4.1l金属离子对红色素稳定性的影响
Table4-1 1 Effect ofmetal irons
on

red pigment stability

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结果表明,大多数所测金属离子对色素色泽无明显影响,Na+、M92+、A13+有增 色效应,Fe3+对吸光度有影响,可使溶液产生沉淀。一般常见的金属离子不会对稳定 性有太大影响,所以食品中含有的微量金属离子不会对色素产生不良影响。 4.5.5.4氧化剂对红色素稳定性的影响 在红色素提取液中加入不同浓度的双氧水后,其吸光度与色素溶液存放时间的关 系曲线如图4—18所示。由图可以看出,随着时间的延长,红色素溶液的吸光度降低, 随着过氧化氢浓度的增加,红色素的吸光度值下降的幅度也在增加。但是总体来说下 降的幅度较小,由此可见,红色素对双氧水是比较稳定的。

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忡静,■。o

2 5





运1.5





^,

仉 5

l_


,7








lO

15



20


25

30
,:.?

j“。

o:

l…,、j

时间(h)t。

一….J,j‘

图4.18氧化剂对红色素稳定性的影响
Fi94-18

Effect ofoxidizer

on

red pigment stability

4.5.5.5还原剂对红色素稳定性的影响 在红色素提取液中加入亚硫酸钠和抗坏血酸后,其吸光度与色素溶液存放时间的 关系曲线如图4.19所示。由图可以看出,由图可知,还原剂对红色素有较好的保护 作用,随着放置时间增加,红色素吸光值没有明显变化。

+亚硫酸钠 +抗坏血酸

图4·19还原剂对红色素稳定性的影晌 Fi94-1 9
Effect ofreducing agents
on

red pigment stability

4.5.5.6酸度调节剂对红色素稳定性的影响 在红色素提取液中加入不同的酸度调节剂后,其吸光度与色素溶液存放时间的关 系曲线如图4.20所示。由图可以看出,加入苹果酸和柠檬酸钠,随着时间的延长, 红色素溶液的吸光度降低,但是总体来说下降的幅度较小,所以苹果酸和柠檬酸钠对 红色素稳定性基本上没有太大影响;加入柠檬酸和氢氧化钠,随着时间的延长,红色 素溶液的吸光度升高,所以柠檬酸和氢氧化钠对红色素有增色的效果。

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图缸20酸度调节剂对红色素稳定性的影响
Fi94-20

Effect ofacidity agents

Oil

red pigment stability

4.5.5.7维生素对红色素稳定性的影响 在红色素提取液中加入不同的维生素试剂后,其吸光度与色素溶液存放时间的关 系曲线如图4—21所示。由图可以看出,加入VA、VB和VD试剂,随着时间的延长, 红色素溶液的吸光度略有降低,但是总体来说下降的幅度较小,所以VA、VB和VD 试剂对红色素稳定性基本上没有影响;加入VE试剂,随着时间的延长,红色素溶液 的吸光度升高,所以vE对红色素有增色的效果。
3.5 ----O---VA 3 2.5 ——一VE —●■一VB —★一VD





Q 。1.5 l O.5

O 0 5 10 15 20

时间(h)

图4—2 I维生素对红色素稳定性的影晌
Fig.4-21

Effect ofVitamine

01"1

red pigment stability

4.5.5.8常用食品添加剂对红色素稳定性的影响 在红色素提取液中加入相同浓度的葡萄糖、明胶、氯化钠和苯甲酸钠等常用食品 添加剂,其吸光度与色素溶液存放时间的关系曲线如图4—22所示。由图可以看出, 加入葡萄糖、氯化钠和蔗糖后,随着时间的延长,红色素溶液的吸光度略有降低,但

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是总体来说下降的幅度较小,所以葡萄糖、氯化钠和蔗糖对红色素稳定性基本上没有 影响;加入明胶和苯甲酸钠后,随着时间的延长,红色素溶液的吸光度升高,所以明 胶和苯甲酸钠对红色素有增色的效果。

+葡萄糖 一明胶 +蔗糖

*氯化钠

--.x--苯甲酸钠

图4-22常用食品添加剂对红色素稳定性的影晌 Fi94—22 Effect of normal
food additive
on

red pigment stability

4.5.5.9防腐剂对红色素稳定性的影响 在红色素提取液中加入相同浓度的苯甲酸钠、山梨酸钾和柠檬酸,其吸光度与色 素溶液存放时间的关系曲线如图4—23所示。由图可知,色素液中加入山梨酸钾以后, 其吸光度随存放时间的延长几乎无变化;色素液中加入苯甲酸钠后吸光度几乎无变 化,说明色素液对苯甲酸钠和山梨酸钾有较好的稳定性。加入柠檬酸后,随着时间的 延长,红色素溶液的吸光度升高,所以柠檬酸对红色素有增色的效果。
3·5



2·5



王P—/∥一 +苯钾酸钠 +柠橡酸 i司垂一茔王 +山梨酸钾


趔 8
l·5



O·5

O 0 5
lO 15 20 25

时间(h)

图4.23防腐剂对红色素稳定性的影响
Fig 4-23

Effect ofpreservation

on

red pigment stability

4.5.6红色素粗提物抗氧化性能研究

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天然色素在应用中,除了着色功能外,还可能具有抗氧化作用,为了进一步探索 红色紊的应用价值,本论文对红色素粗提物进行了抗氧化性能的探讨。 根据DPPH抗氧化筛选模型法得RCEF4029自由基清除率(%)=(18 说明RCEF4029具有一定的抗氧化活性,具有较大的开发利用价值。
4 59±017)%,

6红色素安全性及应用实验
1红色素安全性实验 本研究咀中国仓鼠卵巢CHO细胞株作为肿瘤细胞模型,用Resazurin法检测生长抑

4.6

制率,对目标菌株进行体外抗肿瘤活性试验。凼为体外细胞毒性试验可在短期内经济、 简便地显示供试品对细胞新陈代谢的影响,是所有生物学评价实验中的首选项H,以 求初步评价其在人体应用的生物安全性。 根据CHOCytotoxicityAssay模型进行测定得RcEF4029的细胞毒性(%)=
(3 02±0

23)%,说|!jJRCEF4029所产红色素基本无毒,是种安全性较高的天然色

素,冈此具有较大的扑发利用价值。
4,6

2红色素的应用实验

(1)大米染色:人米经处理后为紫}r色热食,说明改色素可应川于食品调色剂。 (2)白御染色:实骑结粜表叫啦色素能使l’l布染成深红色,洗脱液的OD渤-0 005。
¨I此说明改色桑的着色力较强,可应用与日j染方10 J。 分别对大米年¨『,I靠进行染色,实验证明改红色豢着色力较强,洗脱处理基本小掉 色,除了可以作为食品调色剂来丌发,还可以应用到印染产业。其体见图4.24。

】’l&£wHⅧ

2^*me



r丁4女e

目4 24红e素应用实验
Fi94·24

Applleation experiment of red p,口n∞I



7红色素发酵条件的研究
1营养性凼秦对RCEF4029茼株,“红色素的影响

4.7

从微生物的营养要求来看,所有的微q:物都需要碳源、氮源、无机元素、氧气等 等。微生物叶三长发育过程和生物合成过程也需要大量元素和微量元素,如镁、硫、磷
等。另外有些产品的生产还需要使用诱导剂、前体和促进剂。在实验室规模【一配制含

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有纯化合物的培养基是相当简单的,虽然它能满足微生物的生长要求,但在大规模生 产上往往不适合,而研究RCEF4029产红色素的发酵条件时,其根本宗旨是为以后工 业化生产提供依据,因此在发酵条件的筛选上,力求筛选出既可以最大限度地提高红 色素的色价和色素的分泌率,又使用一些廉价的材料,降低生产成本。
4.7.1.1碳源对RCEF4029菌株产红色素的影响

发酵过程中碳源的选择主要取决于发酵的产品,不同的发酵产物,其所需的碳源 也不同。就红色素而言,以其色价和色素分泌率为目的的培养基中,其碳源种类是不 尽相同的。在单一碳源的筛选试验中比较了9种不同碳源对RCEF4029产红色素的影 响,结果见图4.25。由图可知,培养液各种碳源中,以可溶性淀粉作为碳源时RCEF4029 产红色素色价最高达295.54Um/1,色素分泌率达72%。其余依次为麦芽糖、蔗糖、乳 糖、白砂糖、葡萄糖、甘油、麸皮、玉米粉。同时可溶性淀粉生产成本较低,故确定 可溶性淀粉为RCEF4029液体培养最佳碳源。
80

圈圜色价 60+分泌率
70



50,、







20 lO O

图4—25碳源对红色素合成及分泌的影响 Fi94—25 Effect
of carbon
Oil

red pigment

4.7.1.2氮源对RCEF4029菌株产红色素的影响

从图4—26可以看出,氮源不同对RCEF4029产红色素有较大影响,其中以蚕蛹 粉作氮源时RCEF4029产红色素色价最高达305.88Um/1,色素分泌率达72%,高于其 它8种氮源。其余依次为蛋白胨、黄豆粉、硝酸铵、硫酸铵、酵母粉、硝酸钠、牛肉
膏、豆粕。

因此确定蚕蛹粉为RCEF4029液体培养最佳氮源。

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350

80

300

70—_色价
60

夺分泌率
V 薄

250

乓200
=)

50; 40瓣 30求
20

¥150 卸
100

50

lO O



∥矿≯矿蒂拶梦≯≯
氮源

图4-26氮源对红色素合成及分泌的影晌
Fi94—26

Effect ofnitrogen

on

red pigment

4.7.1.3无机盐对RCEF4029菌株产红色素的影响
350 300




250





{200


的的
∞ ∞ 蛉
o KH2P04 NaCI

枣150 幽
100 50 0

,、 !一争耵

一。雠警一:,

M92S04 CaCl2 FeqS04K2HP04 ZnCl2



‘“无机盐



‘。‘o””
·7

图4.27无机盐对红色素合成及分泌的影响

Fi萨-27

Effect of inorganic salt

on

red pigment

在许多培养基中,无机盐是微生物生命活动所不可缺少的物质。无机盐可为微生 物提供除碳、氮以外的各种重要元素,参与细胞结构物质的组成、能量转移、物质代 谢以及调节细胞原生质的胶体状态和细胞透性等。无机盐可分为大量元素和微量元素 两大类。P、Mg、K均属于大量元素,磷酸盐是生化反应过程中一些含磷化合物如核 酸、磷脂、ATP等合成所需磷元素的主要来源,此外,磷酸盐还对细胞和环境中的 pH起缓冲调节作用。镁离子参与组成叶绿素和菌绿素等光合色素,同时也是一些酶 作用的激活剂或调节剂,还可以作为核糖体和膜结构的稳定剂,对某些重金属对生物 细胞的毒害还具有一定的拮抗作用。钾离子不仅是许多酶的激活剂,而且还对原生质

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的胶体状态和细胞膜的透性起调控作用。因此,选取KH2P04、NaCI、Mgl2S04、CaCh、 Fe2S04-7H20、K2HP04、ZnCl2研究不同无机盐对RCEF4029菌株产红色素的影响。 研究发现利用KH2P04作为无机盐因子,色素产量明显高于其它无机盐的色素产 量,色价高达284.88Um/l,色素分泌率达70%。所得数据如图4.27所示。 4.7.1.4最优培养基正交实验结果分析 采用实验3.2.7.3的方法,对红色素发酵条件的研究做正交实验,以获得最佳发酵 条件。实验结果见表4-12。
表4-12以红色素色价为指标的正交试验分析表
Table4—12Analysisoforthogonalexperimentforfermentationconditionswithcolorvaluesofredpigment

注:表中数据表示平均值±标准差;同列数据后不同字母表示差异显著,小写字母表示0.05水平上的差异显著水 平,大写字母表示O.Ol水平上的差异显著水平。
Note:The data in the table
are

mean+SD;those within



column followed by

different letters indicate significantly extremely significant

different,small letters
difference
at

are

significant

difference

at

O.05 level,while

capital letters indicate

0.01 level.

从表4.13可以看出A的极差值最大,其次是B、C,为进一步考察各因子对指 标的影响,进行完全随机模型方差分析。
表4-13正交设计方差分析表(完全随机模型)
Fi94—13
Variance analysis ofthe oRhogonal

experiment(total random model)

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按各因素对活性物质生成的影响,将各因素的主次顺序表示如下: 主△
如0 辐0 如0 饬O ∞O 一.【是n)¥∞蹲 垢O 加O
50 O Al A2 C3 B1 B2 B3



垦-



各因素水平 图4.28培养基各组分与指标的关系图
Fig 4-28 Therelationship

ofmedium ingredients and free mdical scavenging mte

由图4.28中可以看出各因素对RCEF4029产红色素的影响程度由大到小依次为 A>C>B,其中A因素对指标红色素色价的影响极显著,B显著。由上表可确定最 佳组合为AlB3C3,即5%可溶性淀粉,20%马铃薯汁,0.25%蚕蛹粉,0.075%KH2P04。 4.7.2非营养性因素对RCEF4029菌株产红色素的影响 4.7.2.1种龄、接种量、装液量及转速对菌体活性成分生成的影响 生长旺盛的菌体是目标代谢产物产生的基础,接种量的大小决定了菌体的生长繁 殖速度,合适的接种量对接种后菌丝的生长起着重要的作用;由于菌体在生长发育过 程中,不同生长阶段的菌体的生理活性差别较大,接种种龄的控制就显得较为重要; 摇瓶的装液量直接反映了液体发酵的通气量,从而影响菌丝体生长所需的氧气供给和 废气排放,因此对菌丝的生长和代谢物的生成有直接影响;摇床的震荡频率可以影响 液体培养的溶氧量,它的大小与氧在发酵而中的传递速率与发酵液的均匀性有关。以 上几种非营养性因素在液体发酵过程中相互影响,故选取种龄(A)、装液量(B)、 转速(c)、接种量(D)为变量,以色价为指标,用正交试验来综合确定其最佳配比 见表4一14、表禾15和图4.29。
表4一14以色价为指标的正交实验分析表
Table4-14 Analysis ofthe
content

ofcolorvalues orthogonal

experiment

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4 5 6 7 8 9

2 2 2 3 3 3

1 2 3 l 2 3

2 3 l 3 l 2

3 l 2 2 3 l

328.88 353.18 414.42 345.06 330.02 310.36

330.82 354.74 413.57

329.24 354.32 415.8 343.24 330.26 311.16

329.65士1.03 eE 354.08:£-0.81 cC

414.60士1.13 bB
243.89-a:1.01 dD 330.81士1.16 eE 311.70-J:!.68 hH

343.38
332.14 313.58

注:表中数据表示平均值±标准差;同列数据后不同字母表示差异显著,小写字母表示0.05水平上的差异显著水 平,大写字母表示O.Ol水平上的差异显著水平。

№搬The data
different,small
difference
at

in the table letters
arc

are

mean±SD;those within
at



column followed by different letters indicate significantly
level,while capital letters indicate

significant difference

0.05

extremely significant

0.01 level.

由表4.15中可以看出,以色价为指标,接种量的极差最大,其次为装液量、种 龄和转速,也即是表明接种量对菌体中红色素的生成影响最大。为直观地反映各因素 对红色素生成的影响,现将各因素的主次顺序表示如下:
表4.-15正交设计方差分析表(完全随机模型)
Table4—15 Variance analysis oforthogonM

experiment(total

random

model)

为了进一步考察各因子对指标的影响,进行了完全随机方差分析(表4—18),四 个因子在99%置信度下,接种量、装液量和种龄对指标的影响都是极其显著的 (P<0.01),而转速在95%置信度下对指标的影响是显著的。从表4-12得最佳培养 条件的组合是D282AlC2,即以色价为指标,RCEF4029菌株液体的最佳的培养条件 是AlB2C2D2即接种于固体斜面的种子培养5d后作为液体摇瓶的种子,以10%的接种 量接种于装有lOOml发酵培养基的250mi三角瓶中,转速为150rpm。 按各因素对活性物质生成的影响,将各因素的主次顺序表示如下: 主△
g 望 垒-



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450 400 350




300

≥250

翥200
:喧150 100 50 0 Al A2 A3 B1 B2 B3 Cl C2 C3 Dl D2 D3

各因素水平

图4-29各因素与指标的关系图
Fi94-29 The relationship offactors and content

4.7.2.2不同pH值对菌株产红色素的影响 发酵过程中的pH对菌体的生长和目的产物的积累有很大影响。在25。C恒温条件 下,研究菌体在发酵过程中的pH变化,以及初始pH对红色素生产的影响,发现该 实验菌株在PDA培养基发酵过程中,pH一直维持在6.0左右。研究起始pH为5.0、 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0等条件下对红色素产量的影响,发现菌体在
pH6---8之间可良好生长,当pH偏低或偏高时,菌体生长都受到影响,且菌体自溶发

酵物粘度增加。结果表明,pH为7.5时色含量达到最高(如图所示4.30)。
500 450 400 350 O 9

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