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chap14核酸类药物


第十四章 核酸类药物
第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产 一、RNA与DNA的提取与制备 一、RNA与DNA的提取与制备 (一) RNA的提取与制备 RNA的提取与制备 1.工业用RNA的提取 1.工业用RNA的提取 (1)RNA及其工业来源 RNA及其工业来源 从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。 从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。 通常在细菌中RNA占 通常在细菌中RNA占5%-25%,在酵母中占2.7%~15%, 25%,在酵母中占2.7%~15%, 在霉菌中占0.7%~28%, 面包酵母含RNA4.1%~7.2%。 在霉菌中占0.7%~28%, 面包酵母含RNA4.1%~7.2%。 培养酵母菌体收率高,易于提取RNA,在工业上主要 培养酵母菌体收率高,易于提取RNA,在工业上主要 由RNA生产5‘-核苷酸。 RNA生产5‘-核苷酸。

(2)高RNA含量酵母菌株的筛选 )高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株,也可以用诱 可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株,也可以用诱 变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。 变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。

糖蜜



种子 揺瓶发酵

酵母浆 保温抽提 配料 抽提液 分离 抽提清液 酸化 酸化液 过滤 RNA 洗涤干燥 RNA干粉 磨粉包装 成品

糖蜜配料液 水解 水解液 中和 中和沉淀 过滤 清糖水

种子培养物 种子发酵 种子发酵培养物 连续发酵 发酵液 收集菌体 酵母菌体 水洗涤

发酵法生产高含量RNA酵母及其RNA提取工艺流程

(3)用工业废水培养高含量RNA酵母 )用工业废水培养高含量RNA酵母 减少环境污染,降低粮食消耗 (4)RNA的提取实例 RNA的提取实例 啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。 啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。 取100g压榨啤酒酵母(含水70% ),加入230ml含NaOH 100g压榨啤酒酵母(含水70% ),加入230ml含 3g的水,20℃以下搅拌30min。用6mol/L HCl调至pH7, 3g的水,20℃以下搅拌30min。用6mol/L HCl调至pH7, 搅拌15分钟,离心得上清液255ml。冷至10℃以下, 搅拌15分钟,离心得上清液255ml。冷至10℃以下, 6mol/L HCl调pH2.5,置冷过夜,离心等RNA1.8g(纯 HCl调pH2.5,置冷过夜,离心等RNA1.8g(纯 度80%)。 80%)。

(二) DNA的提取与制备 DNA的提取与制备 1.工业用DNA的提取 1.工业用DNA的提取 取新鲜冷冻鱼精20kg,用绞肉机粉碎2 取新鲜冷冻鱼精20kg,用绞肉机粉碎2次成浆,加入等体 积水,搅拌均匀,倾入反应锅内,缓慢搅拌,升温至 100 ℃,保温15分钟,迅速冷却至20~25 ℃,离心去 ,保温15分钟,迅速冷却至20~ 除鱼精蛋白等沉淀物,共获得35L含热变性DNA溶液。 除鱼精蛋白等沉淀物,共获得35L含热变性DNA溶液。 加乙醇沉淀,可得到固体DNA产品。 加乙醇沉淀,可得到固体DNA产品。 2.具有生物活性DNA的制备 2.具有生物活性DNA的制备 动物内脏加4倍量生理盐水经组织捣碎机捣碎1 动物内脏加4倍量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟,匀 浆于2500rpm离心30分钟,沉淀用同样体积的生理盐 浆于2500rpm离心30分钟,沉淀用同样体积的生理盐 水洗涤3次,每次洗涤后离心,将沉淀悬浮于20倍量的 水洗涤3次,每次洗涤后离心,将沉淀悬浮于20倍量的 冷生理盐水中,再捣碎3分钟,加入2倍量5 冷生理盐水中,再捣碎3分钟,加入2倍量5%十二烷基 磺酸钠,并搅拌2 磺酸钠,并搅拌2~3小时,在0 ℃2500rpm离心,在 小时,在0 2500rpm离心,在 上层液中加入等体积的冷乙醇,离心即可得纤维状 DNA,再用冷乙醇和丙酮洗涤,减压低温干燥得粗品 DNA,再用冷乙醇和丙酮洗涤,减压低温干燥得粗品 DNA。 DNA。

二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 (一)酶解法及碱水解法制备核苷酸 1.酶解法制备脱氧核苷酸 1.酶解法制备脱氧核苷酸

桔青霉或熄曲霉 液体培养2天 发酵液 压滤除菌体 酶液 混合,调pH 保温 酶解液

鱼精 绞肉机粉碎 鱼精匀浆 热变性 冷却,过滤 DNA溶液

加热使酶失活,调pH9.0置冷过夜,过滤 DNA降解液 吸附于氯型阴离子交换树脂分步洗脱

脱氧胞苷酸 dCMP

脱氧腺苷 dAMP

脱氧胸苷酸 dTMP

脱氧鸟苷酸 dGMP

2.酶解法制备戊糖核苷酸 2.酶解法制备戊糖核苷酸
桔青霉M843培养 产生核酸酶P1 酵母提取 RNA

RNA降解成5‘-核苷酸 阳离子树脂分离 无离子水洗涤 流出液pH1.5 UMP浑浊液 碳柱吸附,解析 2.0~3.5 3.5~4.0 3.5~4.5 GMP,CMP混和液 CMP稀溶液 AMP稀溶液 阴离子树脂 减压浓缩 CMP溶液 阴离子树脂 GMP浓溶液 乙醇沉淀 GMP干粉 GMP浓溶液 乙醇沉淀 GMP干粉 AMP浓溶液 乙醇沉淀 AMP干粉

除盐等杂质UMP 阴离子树脂 UMP稀溶液 乙醇沉淀 UMP干粉

3.双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸(I+G) 3.双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸(I 呈味核苷酸
桔青霉M843培养 产生核酸酶P1 曲霉M1197培养 产生AMP脱氨霉 RNA溶解,调pH升温

RNA降解,AMP脱氨 阳树脂分离(I+G) 减压浓缩 乙醇结晶 干燥 产品(I+G)

4.菌体自溶法生产核苷酸 4.菌体自溶法生产核苷酸
离心 自溶 pH10 离心 pH3.5 结晶 阴阳离子交换树脂 清液 单核苷酸纯化液 除盐

谷氨酸发酵液

湿菌体

菌体自溶液

无盐提取液

浓缩

浓缩液

结晶单核苷酸

5.碱水解法生产2‘,3’-混合核苷酸 5.碱水解法生产2‘,3’-混合核苷酸 RNA中的磷酸二酯键对碱性条件不稳定的特性,很 RNA中的磷酸二酯键对碱性条件不稳定的特性,很 容易生成2‘,3’-环状磷酸酯,水解生成2‘, 容易生成2‘,3’-环状磷酸酯,水解生成2‘,3’ -核苷酸。 取RNA配成3%~3.5%的水溶液,加氢氧化钠达 RNA配成3%~3.5%的水溶液,加氢氧化钠达 0.3mol/L浓度,升温38C,保温16-20小时,用6mol/L 0.3mol/L浓度,升温38C,保温16-20小时,用6mol/L 盐酸中和至pH7.0,从RNA水解成2‘,3’-核苷酸降 盐酸中和至pH7.0,从RNA水解成2‘,3’-核苷酸降 解率达95%以上。 解率达95%以上。 (二)发酵法生产核苷酸 1.发酵法生产肌苷酸(IMP) 1.发酵法生产肌苷酸(IMP) 肌苷酸钠是一种高效增鲜剂,在谷氨酸钠中添加2 肌苷酸钠是一种高效增鲜剂,在谷氨酸钠中添加2%,鲜 度可以增加3 度可以增加3倍。 2.发酵法生产黄苷酸(XMP)及酶法转化成鸟苷酸 2.发酵法生产黄苷酸(XMP)及酶法转化成鸟苷酸 (三)半合成法制备核苷酸

三、核苷的制备 (一)RNA化学水解法制备核苷 (一)RNA化学水解法制备核苷 (二)发酵法生产核苷 1.发酵法生产肌苷 1.发酵法生产肌苷 2.发酵法生产鸟苷和黄苷 2.发酵法生产鸟苷和黄苷 3.发酵法生产腺苷 3.发酵法生产腺苷

第二节 核酸类药物 核酸类药物可分为两类:一类为具有天然结构的核酸类 物质,有助于改善机体的物质代谢和能量平衡,加速 受损组织的修复,促进缺氧组织恢复正常生理机能。 临床上用于放射病,血小板减少症,急慢性肝炎,心 血管疾病,肌肉萎缩等代谢障碍。如肌苷,ATP,辅酶 血管疾病,肌肉萎缩等代谢障碍。如肌苷,ATP,辅酶 A,脱氧核苷酸,肌苷酸等 第二类为自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类似物或 聚合物,这一类核酸类药物是当今治疗病毒,肿瘤, 艾滋病得重要手段,也是产生干扰素、免疫抑制的临 床药物。已经正式在临床应用的8 床药物。已经正式在临床应用的8个抗病毒核苷酸类药 物。

一、叠氮胸苷(AZT) 一、叠氮胸苷(AZT) (一)结构与性质 AZT治疗艾滋病的新药。化学名为3 -叠氮-2 AZT治疗艾滋病的新药。化学名为3‘-叠氮-2’-脱氧胸 腺嘧啶核苷,商品名为Refrovir。 腺嘧啶核苷,商品名为Refrovir。 68%的病人临床表现为减轻症状,延长寿命的显著效果, 68%的病人临床表现为减轻症状,延长寿命的显著效果, 常见副作用为贫血,白血球减少,部分病人骨髓坏死 等。 AZT的药理作用是在体内经磷酸化后生成了3 -叠氮-2 AZT的药理作用是在体内经磷酸化后生成了3‘-叠氮-2’ -脱氧胸腺嘧啶核苷酸,取代了正常的胸腺嘧啶核苷 酸参与病毒DNA的合成,含有AZT成分DNA不能继续复 酸参与病毒DNA的合成,含有AZT成分DNA不能继续复 制,从而达到阻止病毒增殖的目的。 (二)生产工艺

O HN

O H2N
N N N H P

O H2N
N N N

HO

O O

N

pynpase

HO

O

HO

O

OH OH

OH OH OH OH


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