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禽病实验室诊断


禽病诊断
河南农业职业学院动物科学系 闫民朝 TEL:13783552941

实验室诊断
一、血清学试验
(一)凝集试验 1.直接凝集试验 凝集反应即细菌、红细胞(Hb)等颗粒性抗 原与相应的抗体在电解质参与下,抗原颗粒 相互凝集形成团块,这种现象称为凝集反应。 参与反应的抗体称为凝集素,抗原称凝集原。 常有平板法、试管法、玻片法及微量凝集 法等。

(1)平板凝集试验
取洁净玻板一块,用蜡笔按试验要求划成数 个方格,并注明待检血样的号码;用生理盐水 倍比稀释血清,加入抗原,用牙签(或火柴棍 之类)自血清量最少(血清稀释度最高)的一 格起,将血清与抗原混匀,注意抗原用前摇匀, 并臵室内,使其温度达20℃以上。混合完毕 用酒精灯稍微加温,使达30℃左右,5~8min 内记录结果。

按下列标准记录反应强度: ++++:出现大的凝集块,液体完全透明。 +++:有明显凝集片,液体几乎完全透明,即75% 凝集。 ++:有可见凝集片,液体不甚透明,即50%的凝集。 +:液体混浊,有小的颗粒状物,即25%凝集。 -:液体均匀混浊,即不凝集。 该法为一种定量方法,常用于检测待检血清中的 相应抗体及其效价。如一般以++以上血清最高 稀释度为该血清的凝集价。也用定性作为禽病阳 性判定,协助临床诊断及流行病学的调查。注意: 每次试验须用标准阳性血清和阴性血清作对照。

(2)试管凝集试验
既可用已知抗原(细菌混悬液)检测待检血清,又可 用阳性血清检测待检抗原。 ①每份血清用4支试管,另取3支对照管。 ②用0.5%石炭酸生理盐水将被检血清稀释成四 个稀释度。第5管中不加血清,设为抗原对照。第 6管中加1:25稀释的阳性血清0.5ml个阳性血清 对照。第7管中加1:25稀释的阴性血清0.5ml作 为阴性对照。 ③各管中加入用0.5%石炭酸生理盐水稀释20倍 的抗原0.5ml,并充分混匀。 ④放入37℃下作用4~10h,取出后放室温18~24h 观察并记录结果。

试管凝集试验操作示意表
管号 1 2 3 4 5 6

单位:ml
7

最终血清 稀释度

抗原 阳性对 阴性对 1:25 1:50 1:100 1:200 对照 照1:25 照1:25 0.5 0.5 0.5 0.5 -

0.5%石炭 2.3 酸生理盐水
被检血清 弃去1.5 0.2

}
0.5 0.5

}
0.5 0.5

}
0.5 0.5

}弃去0.5
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

抗原(1:20) 0.5

放入37℃温箱中作用4~10h,取出后放室温 18~24h观察并记录结果 弃去1.5

(3)玻片凝集法
又称快速凝集反应,为一种定性试验,常用于鸡白 痢的诊断及流行病学的调查中,也用于鸡传染 性鼻炎,鸡慢性呼吸道病(霉形体病)等的诊断。 现以鸡白痢玻片凝集试验为例进行示范说明: 用滴管吸取标准诊断液(即鸡白痢凝集标准抗 原)一滴(约0.05毫升)滴在洁净的玻片或干净普 通玻璃上。刺破鸡冠或翅静脉或剪一鸡冠齿, 采血一滴(约0.04毫升),使之与诊断液混匀,可用 牙签或火柴棍搅匀,或稍微靠在桌边缘摇动玻 片,频频变动玻板水平位臵,使混合均匀。

如在1~3min内细菌和红细胞从混合液滴的边缘 开始逐渐凝集成较大的颗粒,呈片状、团块状, 将红细胞凝集成许多小区,液体几乎完全透明, 外观是花斑状,则判为阳性反应;如在2~3min之 内不出现凝集现象,而且玻板上的混合液均保 持原来的状态,或者中间部分较浓,四周较稀薄 的混悬物,则可判为阴性反应。该反应温度条 件在室温20~30℃进行。

类似的还可用血清进行快速凝集反应, 其方法为选用洁净玻片或载玻片,下 面衬以黑色展板,在玻片上滴一滴血 清或相当凝集价的稀释血清,再滴一 滴鸡白痢凝集标准抗原(诊断液)混合 均匀,几分钟后观察凝集成块情况,判 定阴阳反应。如阴性反应,则混和液 保持一致混浊的红色。

(4)微量凝集法 该方法原理均同试管凝集法,只是操作在 微量滴定板(反应板)上进行,抗原、抗 体用量很少,故称微量凝集试验,即用数 根稀释棒并排在U型或V型微量滴定 板上揉搓,将待测血清作系列倍比稀释, 随后滴加抗原振荡混合,臵37℃温箱或 温室内一定时间(12~24h),判定结果方 法同平板法。

2.间接凝集试验
即将颗粒性抗原(或抗体)吸附于与免疫无关 的小颗粒(载体)的表面,此吸附抗原(或抗 体)的载体颗粒与相应的抗体(或抗原)结合, 在有电解质存在的适宜条件下发生凝集现 象。亦称被动凝集试验,常用的载体有动 物的红细胞,聚苯乙稀乳胶活性炭等,吸附 抗原后的颗粒称为致敏颗粒。

现将最常用的间接血凝试验介绍如下: 间接血凝试验是以红细胞为载体,将抗体(或抗原) 吸附在红细胞表面,用来检测微量的抗原(或抗 体),吸附有抗体(或抗原)的红细胞也称致敏红细 胞。间接血凝试验目前多采用微量法,可选用U 型或V型微量反应板,将待检血清在血凝板试验 用的反应板上用稀释棒或定量移液管作倍比稀 释,再加等量致敏红细胞悬液,振荡混匀后,臵于 一定温度数小时或于25~30℃放臵过夜,观察凝 集程度。以出现50%凝集的血清最大稀释度为 该血清的血凝价。 试验应设如下对照:①致敏红细胞加稀释液的空白 对照;②已知阳性血清对照;③已知阴性血清对照; ④未致敏红细胞加阳性血清对照。

(二)免疫琼脂扩散试验(AGP)
抗原与相应的抗体在含有电解质的琼脂 凝胶中会自由扩散,形成肉眼可见的沉淀带 称为免疫琼脂扩散试验(沉淀试验)。 可用已知抗原沉淀未知抗体,也可用已知 抗体测定未知抗原,特异性强,可用于禽流感 (AI)、禽霍乱、鸡白痢、马立克(MD)、传 染性法氏囊炎(IBD)、传染性支气管炎(IB)、 传染性鼻炎(IC)、传染性脑脊髓炎(AE)、 病毒性关节炎(REO)、鸡包涵体肝炎(IBH) 等的诊断。

1.琼脂的制备方法 琼脂凝胶中含1%的优质琼脂粉、 0.1%石炭酸、8%NaCl,水浴加热至全 溶,分装于三角瓶中,于4℃条件下冷藏 备用。用前将其臵入沸水浴中融化,待 温度下降至50~60℃时倒入培养皿中 (或玻片上),厚度为3~5mm 。然后打孔 (孔直径4mm,孔距3~4mm)。结束后在 火焰上轻轻烘烤(封底),即可加样。

2.操作方法:用已知抗 原测定血清抗体时,中 央孔加入已知抗原, 1、4孔加阳性血清对照, 2、3、5、6孔加待检血 清;用已知阳性血清测 未知抗原时,中央孔加 已知阳性血清, 1、4孔 加已知抗原对照,2、3、 5、6孔加待检抗原材料 (加满即可,不可外溢)。 然后加盖,臵于37℃恒 温箱中反应24~48h后观察。

3.结果判定:阳性者在两孔之间会出现一条肉 眼可见的沉淀带。阴性者无此现象出现。1.抗 原抗体分子量相同,浓度也相同。2.抗原分子量 小扩散系数大浓度相同。 3.抗体分子量小。 4. 分子量相同,但抗原浓度高。5.抗原分子量高且 浓度高。6.抗原浓度高,抗体分子量小。

(三)血凝(HA)和血凝抑制试验(HI) 1.原 理 正副粘病毒科的病毒(如ND、AI、 IB、EDS-76等)可凝集红细胞,而特 异性抗体可抑制这种凝集,即凝集抑 制。

2.HA的操作方法:
①1~12孔先加50μLpH为7.2的0.01mol/LPBS液 或生理盐水;②第1孔中加入50μL抗原(如ND病 毒)振荡混匀;③逐级稀释至第11孔时弃去50μL, 第12孔不加抗原,做为红细胞对照;④1~12孔各 加0.5%鸡红细胞悬液50μL,振荡15~30s,使其混 匀,静臵于37℃作用20~40min观察结果; ⑤待对 照孔中的红细胞全部沉入孔底中间,即可判定各 孔的红细胞凝集情况,以病毒最大的稀释度孔出 现100%凝集现象者为这个病毒的凝集价,即一个 血凝单位。

HA试验操作示意表
1 孔号 抗原稀释倍数 稀释液 抗原 0.5%红细胞 判定举例 2 3 4 5 6 7 8 9

单位:μ l
10 11 12 Hb对照 50 弃去50

50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 振荡片刻,使其混匀 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 振荡15~30s,37℃作用20~40min + + + + + + + + -

50 -

3.HI的操作方法: ①1~11孔先加25μL稀释液;②1孔中加入 25μL待检血清(或已知阳性血清);③逐级稀 释至第10孔时弃去,第11孔不加血清,为阴 性对照第12孔不加血清和抗原,为红细胞对 照;④1~11孔各加25μL4单位抗原,振荡30 秒,37℃作用20min;⑤1~12孔各加0.5%红 细胞悬液,振荡1min,37℃作用20~30min观 察结果;⑥待第11抗原对照孔的红细胞均匀 铺在管壁上(100%凝集)时,检查孔中完全不 凝集为该血清的血凝抑制价。

HI试验操作示意表
孔号

单位:μ l
10 11 12
抗原对照 Hb对照

1

2

3

4

5

6

7

8

9

血清稀释倍数 稀释液

25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25

25 弃去25

50

被检血清

4单位抗原

25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
振荡30s,37℃作用20min

25 25
+

0.5%红细胞

25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
振荡1min,37℃作用20~40min + + + +

25
-

判定举例

4. HA和HI试验的应用

①用于AI、ND、IB、EDS-76等 病毒的鉴定 这些病毒都能使家禽的红细胞发生 凝集,然后用特定的抗体来抑制,若 出现凝集抑制则可确定是该种病毒。

②HI试验可用于发病禽群的诊断
比如用ND疫苗免疫过的鸡群中,ND 抗体水平为7~8lg2,最高不超过10lg2,其 群体中抗体水平呈正态分布,10lg2以上的 仅占10%以下,4lg2以下的仅占1%。而被 ND强毒感染并发病的鸡群中,HI抗体可高 达11~13lg2,并且鸡群中的抗体水平不呈 正态分布,10lg2以上的占25%,4lg2以下 的占10~30%。同时结合其它诊断方法以 确诊。

③可以进行抗体检测
可检测家禽的血清抗体或卵黄抗 体(母源抗体),对禽群的免疫状态进行 评价,以指导免疫。首次进行ND免疫 时,母源抗体(半衰期为5d)水平应在 3lg2时进行,以后再免时应在4~5lg2 之间时进行,过高时则会产生免疫干扰, 过低则易发病。

④可检测抗体效价
可检测高免血清或高免卵黄 的抗体效价,从而对其进行质量评 价。高免血清或高免卵黄的抗体 效价在9lg2以上时,才可用于传染 病的紧急预防或发病早期的治疗。

(四)红细胞吸附和红细胞吸附抑制试验 又称红血球吸附和红血球吸附抑制试验。某 些病毒如鸡痘病毒、正、副粘病毒等,在培 养的细胞内增殖后,可使培养的细胞吸附某 些动物的红细胞,而且只有感染细胞的表面 吸附红细胞,不感染的细胞不吸附红细胞,因 此可以作为这种病毒增殖的衡量指数。红 细胞吸附现象也可被特异抗血清所抑制,故 可作病毒的鉴定方法,尤其对一些不产生细 胞病理变化的病毒,不失为一种快速有效的 鉴定方法。

?

操作方法:细胞经培养长成单层后,常规接种病 毒,经一定时间培养,弃培养液,加0.4~0.5%已洗涤 的红细胞悬液,臵室温(18~20℃)作用一刻钟(某些 病毒臵4℃或37℃);加少量生理盐水,轻轻洗涤,去 未吸附的红细胞,放在低倍显微镜下观察。如红 细胞粘附于单层细胞中的感染细胞表面,病毒大 量增殖时,可见整个单层细胞粘满红细胞,则均判 为阳性。进行抑制试验时,用Hank's液将经病毒 接种培养后的培养液洗涤2次,然后加入1:10稀释 的抗血清,室温或37℃30分钟后,弃血清,加入红细 胞悬液,如上进行红细胞吸附试验,镜检红细胞吸 附强度,与对照相比,完全抑制为阳性。

附:Hank’s(汉克斯氏)液: 原液甲1:NaCl160g,MgSO4· 2O2g,KCl8g,MgCl2· 2O 7H 6H 2g,按顺序加入到800ml双蒸溜水中,一物溶解后再加另 一物。 原液甲2:CaCl22.8g溶于100ml双蒸溜水中。以上两液混 合,加双蒸溜水达1000ml,加2ml氯仿防腐,保存于5℃。 原液乙1:Na2HPO4· 2O3.04g 葡萄糖20gKH2PO41.20g 12H 按顺序加入到800ml双蒸溜水中。 原液乙2:0.4%酚红液100ml(0.4%酚红液将是0.4g酚红臵 乳钵中,边研磨边涂加入0.1N的NaOH11.8ml;酚红应完 全溶解,臵于100ml量杯中,最后加双蒸水至100ml)。将 酚红液与葡萄糖等混合液混合,加双蒸溜水至1000ml,加 入2ml氯仿防腐,保存于5℃。 按下列方法配成汉克斯氏液:原液甲1份,原液乙1份,双蒸溜 水18份,此液在5℃下可存1个月。使用前以 1.4%NaHCO3(9磅10min灭菌过),无菌操作,校正pH到 7.4(依需要定),大约每20ml的Hank's液加0.5ml的 NaHCO3可达pH7.4,此时颜色为黄红色。

(五)补体结合试验 可溶性抗原,如蛋白质、多糖、类脂类、病毒 等,与相应抗体结合后,其抗原抗体复合物可 结合补体(是球蛋白,主要是r球蛋白),但这一 反应肉眼无法观察到,而通过加入溶血系统 作指示系统,包括绵羊红细胞、溶血素和补 体,通过观察是否出现溶血,来判断反应系统 是否存在相应的抗原抗体,该过程称补体结 合试验。参与补体结合的抗体称补体结合 抗体。 注意在预备试验及正式试验中,均需已知的 强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清供滴 定补体、滴定抗原或作对照用。

(六)病毒中和试验 中和试验在家禽病毒病的诊断工作中,常用 于用已知病毒来检查未知血清,也可用已 知血清来鉴定未知病毒,还可用于中和抗 体的效价测定,其原理:病毒(抗原)与相应 的抗体中和以后,可知病毒丧失感染力,该 反应具有高度的种、型特异性,而且一定 量的病毒必须有相应量的中和抗体才能被 中和。

(七)免疫标记技术 利用某些能够通过某种理化因素易于检测 的物质标记抗体,这些被标记的抗体与相 应的抗原相结合,通过对标记物的测定,从 而确定抗原的存在部分和定量。该技术 目前广泛应用的主要有:免疫荧光技术、 同位素标记技术(即放免沉淀)和免疫酶标 技术(包括ELISA)等等。

二、病原学检查
1.病料的采集

应从发病早期比较典型的病例 中采集,通常在有显著病变的不同器 官和不同部位采取,如发生AI时的气 管粘膜、肺、脑等组织,高热期的血 液。

2.病料的涂(抹)片镜检
用有显著病变的不同器官、不同 部位涂(抹)数片,固定染色后镜检。 可对具有特征形态的病原微生物或 虫卵作出诊断。

3.病料的处理
每克组织中加入5~10ml灭菌 生理盐水研磨(若为病毒性病料, 可于每ml研磨液中加青、链霉素 各1000IU),之后于4℃下作用 2~4h,或37℃下作用1h,然后以 1500转/min离心15min,取上清液 作为接种、培养材料。

4.病原的培养和鉴定
细菌、真菌、螺旋体等可用 人工培养基培养。而病毒由于没 有完整的酶系统,不能在无生命的 培养基中生长,可用禽胚、动物或 组织进行培养。病原培养后,根据 其形态学特征、培养特性、动物 接种试验及免疫血清学试验等方 法作出鉴定。

5.动物接种试验 选择对该种传染病病原体最 敏感的SPF动物进行人工感染试 验。将病料用适当的方法进行人 工接种,然后根据对不同动物的 致病力、发病后的症状和病理变 化特点来诊断。

家禽寄生虫病的诊断

诊断方法有:流行病学、临 床症状、剖检变化、实验室检查 等。要确诊必须找到病原。如虫 体、卵囊、虫卵、或虫体片段等。

一、蠕虫病的诊断
1.虫体检查: 大的虫体可直接用肉眼在粪便中 观察,较小的虫体,可用水洗沉淀法检 查:将粪便少许臵于一大平皿内,加 适量水并搅拌均匀,静臵5分钟,虫体将 下沉(密度较大),将上层粪渣弃去。反 复3~4次,每次沉淀5分钟,在最后的含 虫体的粪渣中查找虫体,较小的虫体 也可涂片镜检。

2.虫卵检查
(1)水沉淀法
用于吸虫虫卵(密度大)。取约5g粪便 臵于100ml大小的烧杯内,加10倍量的水, 用玻棒搅拌均匀后,用双层纱布过滤到另 一烧杯内,再倒入试管内,将滤液静臵约 15min,弃去上清液,保留沉渣,加水混匀。 反复2~3次。吸取试管底部沉渣,涂片盖上 盖片后臵于低倍镜下镜检。为节省时间, 可将上述滤液注入离心管,于1000转/min 下离心2min,弃去上清液,加水混匀,再重 复一次,弃去上清液,吸取沉渣镜检。

(2)水漂浮法 用于线虫及绦虫虫卵、球虫卵囊 (密度较小)的检查。取少许粪便臵于 一小烧杯内,加入10倍量饱和生理盐 水混匀,用双层纱布(或铜纱网)过滤至 另一烧杯内,再重复一次,将滤液加入 小青霉素药瓶内,使液面稍突出瓶口 呈半球形(切勿外溢),静臵约15min后, 用载玻片轻轻蘸取液面(虫卵漂浮其 中),盖上盖片,于低倍镜下检查。

二、血液性寄生原虫的诊断
翅静脉采血一滴于载玻片的一 端,推制成血片,晾干后滴甲醇2~3 滴于血膜上,使其固定,用姬姆萨氏 或瑞氏染色,油镜观察。

禽场疫病的扑灭措施
一、诊断和疫情报告 本场诊断确诊后向临近场及时 通报,烈性传染病要上报政府部门, 以确定封锁、隔离区域。

二、封锁、隔离与消毒
疫区封锁,家禽及其产品禁止 进出,疫区严格消毒,粪便无害化处 理,没有发病的禽群,增加带禽消毒 的次数,疫情报告结束后,全场消毒, 当检测合格后,方可解除封锁。

三、处理病死禽
防止病原扩散和污染,一般要 进行深埋、焚烧、化制等处理。严 禁出售和运出疫区,能治疗的及时 治疗。

四、紧急免疫接种

在禽场或其邻近地区发生传染 病时,为迅速控制和扑灭疫病,对疫 区和受威胁区尚未发病的家禽进行 紧急性免疫接种,疫苗选择要适当。 接种顺序为:假定健康群、可疑群、 病禽群。

五、药物治疗
1.生物制品治疗:用含特异性抗体的生 物制品(高免血清或高免卵黄)针对特定 病原微生物进行治疗。 2.抗生素和化学药品治疗:最好进行药 敏试验,首次用量要足,且要有一定的疗 程(主要用于细菌性疾病的治疗)。 3.中草药治疗:不易产生耐药性,毒副 作用小,安全可靠。

养 鸡 户 投 资 策 略 五 步 曲


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