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Co-IP_图文

免疫共沉淀 (Co-Immunoprecipitation)
制作者:徐君丽

My Name is protein

免疫沉淀技术分类

1) 免疫沉淀(Individual protein immunoprecipitation, IP):利用抗体特异性 从细胞裂解物或其他可溶性生物样品中纯化已知特定蛋白质。
2) 免疫共沉淀(Protein complex immunoprecipitation , Co-IP):利用抗体沉淀 相应特定抗原,同时沉淀与该抗原相互结合的其他分子,主要用于研究蛋白质相 互作用。 3) 染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP):在活细胞状态下 固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断,通过免疫沉淀复合体特异性富集目的 蛋白结合的DNA片段,再通过对DNA片段的纯化和检测,获得蛋白质与DNA相互 作用的信息。 4) RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP):其原理与ChIP相近,但 RNA免疫沉淀是用来研究与蛋白质结合的RNA在基因表达调控中的作用。

免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP)
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究 蛋白质相互作用的经典方法。 是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有 效方法。

原理

利用共价结合蛋白A或蛋白G的琼脂糖或磁性微球将反应后的抗原-抗体复合物富集纯 化。蛋白A和蛋白G能特异地和抗体的保守区Fc段结合,形成稳定的抗原-抗体复合物 附着在微球上,溶液内无关的分子可以通过洗涤微球被清除,最后,再采用一系列 方法分析纯化抗原或与抗原结合的其他分子。

优点

1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态; 2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响; 3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点
1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用; 2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用; 3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测 不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

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免疫沉淀实验成功的关键在于第一步样品处理。免疫沉淀实验本质是处于天 然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反 应中抗原的质量,如抗原的丰度及抗原的构象状态。

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在考虑抗体特异性的同时,还需考虑抗体对抗原的亲和力,如单克隆抗体只对抗 原的单一表位具有良好的特异性,因此在免疫沉淀中如果抗原表位暴露不充分, 受到破坏,或受其他因素影响,造成抗体不能识别抗原,无法有效形成免疫沉淀 复合物,那么这将直接影响免疫沉淀的结果。而多克隆抗体或混合单克隆抗体可 以和抗原的多个表位结合,从而解决亲和力的问题。

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目前广泛应用于免疫沉淀的微球以结合了蛋白 A或G的琼脂糖和磁性微球为主。在免疫沉淀操 作中需要采用离心的方法达到固液分离,而反复离心产生的物理应力极易破坏蛋白的天然构象 及完整性,磁性微球可以在外加磁场中表现磁性,实现快速有效分离,大大缩短实验操作时间 。温和的磁性分离方式避免反复离心对蛋白天然构象及完整性的破坏。

注意事项
1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用 ,多采用非离子变性剂(Np40或Triton x-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经 验确定。 2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用 3)使用对照抗体: 单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体:正常兔IgG 4) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗 体的使用有助于避免污染的发生; 5) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀; 6) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进 行蛋白质的定位来确定。