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线粒体的功能及检测方法


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医学综述 2011 年 1 月第 17卷第 1 期 M ed ical R ecap itu late Jan 2011 V o. 17, N o. 1 , , l [ 11] [ 12] [ 13] 任锦, 钦传光, 徐春兰, 等. 细胞穿膜肽作 为药物载体的 研究进 展 [ J]. 药学学报, 2010, 45( 1) : 17-25. Torch ilin VP. Tat pept ide -med iated intracellu lar delivery of phar a mceut ical nanocarriers[ J]. Adv D r D eliv Rev, 2008 60( 4): 548 . ug , -558 S chw arze SR, H o A, V ocero kban i A, et al. In vivo protein trans -A du ct ion: delivery of a b iologically act ive p rote in into the m ou se [ J]. Science 1999, 285( 5433) : 1569-1572. , B ian J Popovic ZB, Ben ejam C, e t al. E ffect of cel- based interce, l l lu lar del ivery of transcript ion factor GATA 4 on ischem ic card iomyopathy[ J] . C irc R es 2007 100( 11) : 1626-1633. , , B isp ing E, Ikeda S K ong SW, et a l. G ata4 is requ ired for m ain te , n ance of postn atal card iacfunction and protect ion from pressu re o verload -indu ced heart failu re[ J] . Proc N at l A cad Sci U SA, 2006 , 103( 39) : 14471 -14476 . Cao G, PeiW, G e H, e t al. In vivo del ivery of a B c-xL fus ion pro l tein contain ing the TA T protein transduction doma in protects a gain st isch em ic brain in ju ry and neu ronal apop tos is[ J] . J N euros c,i 2002, 22 ( 13) : 5423 -5431. K ilic E D ietz G P, H er ann DM, et a l. In travenou s TAT-Bc-X l is , m l protective after m idd le cerebral artery occlus ion in m ice[ J ]. A nn N euro,l 2002 52 ( 5) : 617-622 , . H arada H, H iraoka M, K izaka-K ondoh S A n titum or effect of TAT. oxygen-dep endent degradat ion-caspase-3 fusion protein specifically stab ilized and activated in hypox ic tum or cells[ J] . Can cer R es , 2002 62( 7 ): 2013 , -2018 . R ousselle C, C lair P, Sm irnovaM , et a l I proved brain up take and . m phar acolog ical act ivity of dalargin u sing a pep tid e m -vector m ed ia ted strategy[ J] . J Phar acol Exp Ther 2003 306 ( 1) : 371-376 m , , . 王莉, 孟刚, 牛微, 等. CPP T at49 促 进 外源 CTL 表 位进 入 -57 MHC- 类抗原呈递途径 的机制 研究 [ J] . 免 疫学 杂志, 2006 , 22( 3) : 247-251. 高梅, 赵京 卉, 冀治 鸿, 等. hC lock2 ( 35247) 的表达、 纯化 及其 功能的检验 [ J] . 航天医学与医学工程, 2007 20( 4 ): 250 , -253 . 刘秋英, 王一飞, 熊 盛, 等. TAT 2N DPK 2A 蛋白的 构建表 达及 穿膜初步研究 [ J] . 中国药学杂志, 2007 142( 19) : 652-655 , . F ischer R, K h ler K, Fotin-M leczek M, et al. A stepw ise d issection of the in tracellu lar fate of cation ic cel-p enetrating pep tides[ J] . J l B iol Ch em, 2004 279 ( 13) : 12625-12635. , V iv s E Schm idt J P legrin A. Cel- penetrating and cel- targeting , , l l pept ides in drug delivery[ J] . B ioch i B iophys A cta, 2008, 1786 m ( 2) : 126-138 . 收稿日期: 2010 -08-12 修回日期: 2010 -12-06

有高特异性和很强的亲和性。至于细胞靶向肽能否 达到希望的运输目的还有待于进一步的研究。 随着蛋白载体 CPP s和细胞靶向肽的出现, 药物 结构的范围扩大了。虽然 CPP s穿 膜机制尚未完全 确定, 但不可否认 CPPs在基因治疗、 分子生物学及 临床治疗方面都具有良好的应用 前景。在 CPPs全 景被揭示之前, 其治疗潜力让人充满期待。 参考文献
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线粒体的功能及检测方法

中图分类号: R 34



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( 综述 ), 陈凤玲

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( 审校 )

( 1. 蚌埠医学院, 安徽 蚌埠 233030; 2 上海交通大学医学院附属第三人民医院内分泌科, 上海 201900) . 文献标识码: A 文章编号: 1006 -2084( 2011) 01 -0012 -04

线粒体位于细胞核外, 既能产生能量又携带遗传信 直接观察线粒体的形态变化。每种方法均 有各自 的原理 和优缺 点, 临 床需根 据实际 选择合 适的方 息, 其结构的特殊性决 定其 法, 且尚需探索更为理想、 简单、 经济的检测手段。 损伤 及 修 复 的 方 式 与 核 关键词: 线粒体; 呼吸链; 功能; 检测 DNA 有 所不 同。检 测 线 粒 M itochondrial Function and D etection M et hods W AN G X in1 , C EN F eng-ling2 . ( 1 B eng bu M ed ica l H . Colleg e, B engbu 233030 Ch ina; 2 D epart ent of E nd ocrinology, N O. 3 People sH os ita l Aff iliated to Shang- 体呼吸链功能对于诊断线粒 , . m p ha i Jia otong Un iversity S chool of M ed ic ine, Shangha i 201900 Ch ina ) , 体疾病 是必要的。近年来, Abstract D etection ofm itochond ria con tributes to the d iagnosis of m itochondrial d isease. Curren t detec : t ion m ethods cons ist of m itochondrial resp iratory contro l ratio ATP produ ct ion rate, ion channel openness , , 发现了许多检测线粒体呼吸 variat ion in m itochondrial m emb ran e potent ia, and forear aerob ic exercise test M itochondrial m orphology l m . 链功能的方法, 但是各 具其 can b e directly observed by u sing an electron m icroscopy. E ach m ethod has its ow n underlying rationality, m erits and drawbacks A n idea, s i ple and econom ica lm ethod sh ou ld b e in p lace for clin ical practice , . l m . 局限性。现主要就线粒体的 K ey w ords M itochond ria; R espiratory chain Fun ct ion; D etect ion : ; 功能及检测进行概述, 临床 可根据 目 的选 择 从 功 能 上 或 形 态 学 上 来 检 测 线 基金项目: 国家自然科学基金 ( 30870954) 粒体。
摘要: 对线粒体进行检测有助于线粒体疾病的诊断。目前对线粒体功能检测的方 法有呼吸控制 率、 线粒体 ATP生成率、 离子通道开放状态、 线粒体膜 电位变化、 前臂有 氧运动实验等。通 过电镜可

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1 线粒体的结构与功能特点 线粒体具有自我 复制、 录和编码功能。被称 转 为 能量工厂 的线粒体, 人体至少有 90 的能量由 % [ 1] 其产生 。在人体各个细胞都存有线粒体, 单个细 胞包含 200~ 2000个线粒体, 但是不同组织的细胞内 线粒体的数量是不同的, 而在相同 组织的细胞内线 [ 2] 粒体数量是接近的 。 2 线粒体基因的特点 在人类, 线粒体 DNA ( m tDNA )是长 16 569 bp的 闭合双链环状分子, 每个 m tDNA 分子编码 13个氧化 磷酸化 蛋 白亚 单 位, 2 个 与这 些 基因 翻 译有 关 的 r NA( 12S rRNA 和 16S rRNA )和 22个转录 RNA, 其 R 中这 13个亚单位与核 DNA 编码的其他亚单位共同 组成呼吸链。此外, 还含有一段与 m tDNA复制、 转录 有关的非编码区 ( D环区 )。由于缺少组蛋白的保护 与有效的校读系统, m tDNA 极易受到氧化磷酸化过 程中产生的活性氧簇 ( react iv e oxygen spec ies, ROS) [ 3] 的损害而突变, 其突 变率较 DNA 高 10~ 100 倍 。 由于线粒体 DNA 的修复机制不完善, 效率低下, 线 粒体 DNA 的 突变可 导致线 粒体 功能 缺陷, 线粒 体 DNA 只有过度复制产生数量惊人的拷贝才能补偿此 [ 4] 缺陷 。因此在一些线粒体相关疾病中, 线粒体功 能受损可导致能 量生成减 少而引 起一 系列临 床症 [ 5] 状。线粒体及线粒体 DNA 由卵母细胞传给子女 , 呈母系遗传, 不符合孟德尔遗传规律。在 m tDNA 缺 陷疾病患者的细胞中可同时存在突变型和野生型 2 种 m tDNA, 称作杂胞质性。 3 线粒体基因的损伤与修复 3 1 线粒体基因损伤发生的主要原因及 机制 造 . 成核 DNA损伤的因素均可引起线粒体 DNA 损伤, 如 紫外线、 电离辐射、 烷化剂、 碱基类似物、 修饰剂引起 碱基对的突变等, 此外线粒体 DNA 也会产生自发性 损伤, 如复制 时产生 碱基错 配、 基自 发改变 导致 碱 DNA 损伤。线粒 体 DNA 损伤可 分为 DNA 单链 断 裂、 双链断裂、 碱基修饰、 DNA 链间交联等。线粒体 DNA 直接暴露于氧化磷酸化过程所产生的 ROS 和 自由基中, 无组蛋白保护, 几乎完全由编码区组成, [ 3] 缺乏有效的修复系统等, 因此突变频率较高 。线 粒体 DNA 突变 [如 tRNALeu ( UUR ) 3243A G] 可影 [ 6] 响线粒体复合酶 的活性 。线粒体呼吸链功能障 碍使 ROS过量产生而又不能被及时清除, 导致线粒 [ 7] 体内脂质和 m tDNA 的氧化加强 。线粒体是 ROS 的主要来源, 也是氧化攻击的主要目标, 长期暴露在 高游离脂肪酸环境中, 可使 ROS生成增多, 从而激活 氧化应激, 产生过多的氧自由基, 使细胞及线粒体膜脂 质过氧化, 导致线粒体功能障碍, ATP 生成减少, 钙泵

失活使细胞内钙增多, 激活磷脂酶活性, 使膜磷脂分 [ 8] 解 。有研究表明, 线粒体突变与年龄及呼吸链功能 [ 9] 下降密切相关 。 3. 2 线粒体损伤修复 3. 2 1 碱基切 除修复 碱基切除修复是通过 一种 . DNA 糖基酶, 这种酶可以识别损伤的碱基, 裂解其糖 苷键。该修复系由一些列 包括尿嘧啶 DNA 糖基 化 酶、-氧鸟嘌呤 DNA 糖基化酶、 8 胸腺嘧啶乙二醇糖基 化酶、 3 甲基腺嘌呤 DNA 糖基化酶、 核酸内切酶、 AP DNA 聚 合 酶、DNA 连 接 酶 等 参 与 的 酶 促 反 应 完 成的。 3. 2 2 重组修复 田鼠的 m tDNA 可以通过重组修 . 复去除顺 铂 ( 含重 金属 化合 物 ) 引 起的 链内 交联。 [ 10] Thyagra jan等 在体外用人体线粒体蛋白质抽提物 可以在质粒间建立重组, 此实验有力地支持了 这一 假设: 哺乳动物线粒体可以利用同质性碱基重 组修 复损伤的 DNA。 4 线粒体氧化呼吸链功能、 结构的检测 线粒体氧化呼吸链的功能可以从多方面检测的 结果来评价, 如呼吸控制率 ( respira tory con tro l ratio, RCR) 的检测、 线粒体 ATP 生成率 ( m itochondria l ATP productio n rate MAPR) 的改变、 , 线粒体膜离子通道的 开放状态、 线粒体膜 电位的变化等。线粒体结构 变 化的检测形态学变化如电子显微镜下直接观察线粒 体形态。从整体水平可以通过有氧前臂运动试验来 检测线粒体呼吸链功能。 4. 1 RCR检测 测定 RCR 既可以反映线粒体的完 整程度, 又可以反映 线粒体氧化呼吸链的功能。线 粒体氧化呼吸链系由一系列的递氢体和递电子体按 一定的顺序排列组成的 连续反应体系, 代表着 线粒 体的最基本功能, 可以通过 RCR 来测定其线粒体外 膜及 功能 完整 性和氧 化磷 酸化 效率, RCR 为加 入 ADP 时 ( Stage 3) 的呼吸速率 与 ADP 耗竭后 ( S tage 4) 的呼吸速率之比。线粒体的呼吸耗氧耦联着 ADP 与 P i合成三磷酸腺苷的磷酸化反应, ADP /O 值是指 线粒体每消耗 1 m o l氧 原子的同时, 生成 ATP 的摩 尔数。 RCR 通常与 ADP /O比值一起, 成为衡量线粒 体结构完 整与否及 氧化磷酸 化耦联 程度 的灵敏 指 标, 在线粒体氧化呼吸链功能受损的情况下, S3值、 RCR、 ADP /O比值下 降, S4值 则显著升 高。一般 使 用氧电极法检测, 该方法要求待测定的线粒体 是新 [ 11] 鲜的, 否则所得数据会发生很大误差 。 4. 2 MAPR MAPR的测定也可以作为评价线粒体 呼吸链功能的一项指标。该法是建立在 ATP 与重组 荧光素酶及底物荧光素 反应的基础之上, 但是 敏感 度较低, 而且每次检测需要 0 5~ 1 0 g 的骨骼肌作 . .

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为标 本, 这 样 导 致 临 床 取 样 时 损 伤 较 大。 之 后 [ 12] W ibom 等 采用一种改良 的发光技术检测 MAPR, 该法比最初的方法敏感度要高 50 ~ 220 , 而且每 % % 次检测只需 25 m g 的骨骼肌标本。采集的样本迅速 用差速离心法将线粒体分离出后, 用生物发光技术 对最终的部分线粒体悬液进行 MAPR检测。反应混 合物包括荧光 素- 光素酶 AT P 检测试剂等。检测 荧 MAPR 时通常选取骨骼肌作为样本, 随着技术的不断 改良, 现在已经广泛应用于医学、 生理学、 毒理学等 [ 13-15] 领域的研究 。 4 3 离子通道的检测 线粒体渗 透转换孔是横跨 . 在线粒体内外膜之间非选择性高导电性通道, 通常 保持关闭状态, 是线粒体渗透转换功能的基础。线 粒体渗透转换孔对环孢素有较高的敏感性, 对细胞 内外多种离子浓度变化非常敏感, 特别是对在细胞 内信号转导系统有重要作用的钙离子浓度的变化非 常敏感, 可因钙超载或 ROS 生成而被诱发开启。线 粒体渗透转换孔转换孔大量开启能引起膜电位崩解 并导致细胞凋亡。线粒体渗透转换孔的检测方法有 活性物质标记法、 膜片钳法、 分光光度法等, 其中分 光光度法较为简单易用。 [ 16] 4 4 膜电位的检测 Chu等 曾用激光共聚焦检 . 测大鼠肠黏膜细胞线粒体跨膜电位变化, 该法采用 线粒体跨膜电位检测试剂盒 ( JC-1) 。 JC-1是一种广 泛用于检测线 粒体膜电 位 m 的理 想荧光探 针。 可以检测细胞、 组织或纯化的线粒体膜电位。在线 粒体膜电位较高时, JC-1聚集在线粒体的基质中, 形 成聚合物, 可以产生红色荧光; 在线粒体膜电位较低 时, JC-1不能聚集在线粒体的基质中, 此时 JC-1为单 体, 可以产生绿色荧光。这样就可以 非常方便地通 过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常 用红绿荧光的相 对比例来 衡量线 粒体 去极化 的比 [ 17] 例。 L i 等 用四苯膦等脂溶性阳离子渗透入线粒 m 体膜基质, 然后通过检测四苯膦的 浓度来确定膜电 位, 需要注意的是此法在检测过程中对溶液 p 值的 H 稳定性要求较高, 否则将影响实测值。膜片钳技术 是一种以记录通过细胞膜上的各种离子通道的离子 电流来反映细胞膜上单一或多个离子通道活动的技 术, 其反映的 电流特 征可 以用来 评价线 粒体功 能。 全自动膜片钳技术效率高, 是传统膜片钳技术的 20 ~ 300倍, 操作技术简单; 缺点是仅适用于悬浮细胞的 [ 18] 检测 。线粒体膜是线粒体与周围环境联系、 反应 的桥梁, 膜磷脂含量与流动性的改变与疾病的发生、 发展密切相关。脂质过氧化作用可以导致膜磷脂的 减少, 线粒体膜磷脂的检测对判断 线粒体功能具有 [ 19] 重要意义 。

4. 5 线粒体形态学检测 20世纪 60 年代初, Enge l [ 20] 等 首先用 MGT 染色发现线粒体肌病患者肌膜和 肌纤维之间呈不规则的 红染颗粒改变, 称为粗 糙红 纤维, 为线粒体肌病 具有特征性的形态学改变。宋 [ 21] 东林等 曾用电镜观察线粒体肌病时发现在骨骼肌 肌膜下线粒体异常增多, 并有巨大畸形线粒体出现, 线粒体嵴型异常, 可呈同心漩涡状、 迷宫状或矩形结 [ 22] 晶状结构。姚英民等 曾用电镜观察轮状病毒感染 时线粒体形态变化时发 现线粒体外形肿胀, 电 子密 度增高, 基质中在大量具有紊乱的峭和晶状物, 峭模 糊不清, 基质凝集。 4. 6 有氧前臂运动试验 线粒体肌病患者因 骨骼 肌线粒体氧化磷酸化受损, 致使无氧代谢增加, 引起 [ 23] 血浆乳酸 水 平增 高。 T aivassa lo 等 在 2002 年 发 现, 有氧前臂运动试验是一种新的、 敏感的检测骨骼 肌氧化代谢能力的方法, 并观察到与健康人群比较, 运动前线粒体肌病患者的血氧饱和度 ( SO2 ) 和血氧 分压 ( PO 2 ) 明显降低。陈健华 等 对 42例线 粒体 肌病诊断明确患者行此试验。试验前, 所有受试 者 需在运动侧肘正中静脉置管, 受试者需在运动前、 运 动结束前 30 s 运动后 10 m in取血, 分别检测其 PO2、 、 SO2、 血液乳酸等, 发现在运动中, PO2 和 SO 2 的 pH、 变化与细胞氧化代谢能力损伤的程度呈正相关, PO2 下降越少, SO2 下降幅度不明显反而升高, 说明病情 越重。运动前 ( 或运动中 ) pH 较低、 运动前血乳酸水 平高于正常亦提示线粒 体有异常的可能, 而且 研究 表明该方法较肌肉活检更敏感。 [ 25] 4. 7 磁共振诊断与波谱分析 M orava等 曾建立 一个线粒体疾病综合评 分系统, 用于诊断疑是 线粒 体疾病 患者。该系统 是对包 括临床 症状、 征, 代 体 谢、 影像学、 理学改 变等多 方面因 素进 行综合 评 病 价, 其中磁共振诊断与波谱分析起着重要的作用, 因 为属于非侵入性检查, 特别对于儿童, 有良好的依从 性。后二者的结果将决 定是否进行下一步检查, 如 [ 26] 分子分析、 病理活检等。黄文才等 曾观察 7 例线 粒体脑肌病伴高乳酸血症与卒中样发作事件脑内卒 中样病灶的磁共振成像表 现, 发现在超急性期 ( 3 d 内 ) 以细 胞毒性水肿为特 征, 呈边 界清楚的高信 号 1 灶。H 磁共振波谱进行分析时发现脑卒中样病变在 早期以高耸的双乳酸峰为特征。故认为磁共振成像 和磁共振波谱对评价卒中样发作具有重要价值。 5 总结与展望 在真核细胞内线粒体除了产生能 量之外, 在 调 节细胞正常功能如细胞分裂、 分化、 凋亡、 维持内环 境稳态及肿瘤的发生中也起着重要的作用。在疾病 早期, 线粒体功 能的改 变往 往先于 临床症 状出现。
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因此, 对于线粒体结构及功能的检 测可以及时察觉 其功能的改变并做相应的处理, 可 以阻止或延缓疾 病的进一步发生、 发展。虽然现在有 多种方法用来 可以检测线粒体的功能, 但是由于 工作人员的操作 技能、 所涉及仪器的运行环境、 成本、 效率等多方面 的限制, 目前绝大多数方法仅局限于科研, 距离真正 的临床实际应用仍然有很长的路要走。 参考文献
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神经递质与睡眠觉醒及学习记忆的关系研究
王雅丽
中图分类号: R741; R277. 7
1

( 综述 ), 黄俊山

2

( 审校 ) 文章编号: 1006 -2084 ( 2011 ) 01 -0015-04

( 1 福建医科大学附属协和临床医学院中医科, 福州 350004 2 福建省中医药研究院, 福州 350003 ) . ; . 文献标识码: A

人的一生约有 1 /3的时 间是在睡眠中度过的, 睡眠 作为 维 持生 命 所必 需 的 过 程, 是机体复原、 整合和巩固 Study on the Relationship of N eurotrans itters w ith Sleep, Awakeness L earning and M em ory m , 记忆的重要环节, 是健 康不 WAN G Ya-li1, H UAN G Jun-shan2. ( 1. D epa rt en t of T rad itional Ch ineseM edic ine, F ujian M edical U niversity m 可缺少的组成部分。神经递 Un ion H os ita l Fuzhou 350004, C hina; 2 F ujian Institu te of Ch in ese M ed icin e Fuzh ou 350003, Ch ina ) p , . , Abstract S leep is an act ive neural regu lat ion process wh ich is closely associated w ith the in terna l 质是神经末梢分泌的化学组 : , s tr cture of n ervous system and the ro le of neurot ransm itters A t p resen t the m echan is s of sleep and aw ake u . , m ness rema in unclear It is d iscovered that m any neu rotran s itters are involved in the regu lat ion of sleep- 分, 许多神经递质通过 突触 . m aw ak eness cycle. N eurot ransm itters also have various ef fects on learn ing and m em ory. Th is paper w ill rev iew 传递的方式参与体内各种活 neu rotransm itters such as acetylchol ine norep in eph rine, dopam ine, seroton in n itric oxide, and h istam ine re , , , gard ing th e ad justation of s leep and aw aken ess and effects on learn ing and m em ory . 动, 如睡眠与觉醒、 学习与记 K ey w ords N eurotran s itter S leep Aw akeness L ear ing; M em ory : m ; ; ; n 忆等。对睡眠的各种研究近 些年越来越受到关注, 现从神经递质与睡眠觉 醒和 基金项目: 福建省医学创新课题 ( 2009 -CX-11) 学习记忆的关系方面出 发, 阐述神经递质对睡 眠觉
摘要: 睡眠是一个主动的神经调节的过程, 与神经系统内部的结构和神经递质的 作用密切相关。 目前关于睡眠与觉醒的机制尚未完全明确, 许多神 经递质参 与睡眠与 觉醒周期 的调节, 神 经递质对 学习记忆能 力也有不同的 影响。现对乙酰胆 碱、 去甲肾上腺 素、 多巴胺、 -羟色胺、 5 一氧 化氮及组胺 等几种神经递质对睡眠与觉醒的调节及对学习记忆的影响予以综述。 关键词: 神经递质; 睡眠; 觉醒; 学习; 记忆


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