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动物生化实验理论讲授课件(2012.12.9)


《动物生物化学实验》 基本理论讲授 霍金龙

何为生化研究技术?
生物化学研究技术是指用物理学、化 学和生物学的现代技术来研究生命物质的 化学组成、结构及生命过程中各种化学变 化的科学。 研究内容主要为生物体的化学组成、 新陈代谢与代谢调节控制、生物大分子的 结构与功能、酶学研究、生物膜和生物力 能学、激素与维生素、生命起源、方法学 等。

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生物化学基本实验技术
1、离心技术 2、光谱技术(分光光度技术) 3、层析技术 4、电泳技术 5、沉淀分离技术

一、离心技术
1. 概念
根据物质的质量、沉降系数及浮力 因素等不同,应用高速旋转产生强大的 离心力,使物质分离、浓缩、提纯的方 法称为离心(centrifugation)技术。

2. 离心的基本术语
① 离心力(F):在一定角速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的 离心力。 F=ω2r (ω是旋转角速度,以弧度/秒为单位;r是离心转子的半径,以cm为单位 ) ② 相对离心力(RCF):离心力转化为重力加速度(g)的倍数 。 RCF=ω2r/g=(1.119×10-5)n2r n为转子每分钟的转数(rpm) 一般情况下,低速离心时常以转速“rpm”来表示,高速离心时则以“g” 表 示。 ③ 沉降系数(S):颗粒在单位离心力作用下粒子移动的速度。 S的物理意义是颗粒在离心力作用下从静止状态到达等速运动所经过的时 间,单位为秒。 S在实际应用中常在10-13秒左右 ,即10-13s为1S 。文献中常用沉降系数以描 述某些生物大分子或亚细胞器大小。

3. 离心机分类
(1)普通离心机:最大转速6000 rpm左右,分离形式是固液沉降 分离,转子有角式和外摆式,其转速不能严格控制,通常不带 冷冻系统,于室温下操作,用于收集易沉降的大颗粒物质,如 红血球、酵母细胞等。 (2)高速冷冻离心机:最大转速为20000~25000 rpm,分离形式 是固液沉降分离,一般都有制冷系统,通常用于微生物菌体、 细胞碎片、大细胞器、硫铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工 作,但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分 子。 (3)超速离心机:转速可达50000~80000 rpm,分离的形式是差 速沉降分离和密度梯度区带分离,离心管平衡允许的误差要小 于0.1克。超速离心机的出现,使生物科学的研究领域有了新的 扩展,它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分 级分离,还可以分离亚细胞器、病毒、核酸、蛋白质和多糖等。

4. 离心管的选用
离心管主要用玻璃、塑料和不锈钢制成
(1)玻璃离心管绝对不能在高、超速离心机上使用。 (2)塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE),聚碳酸酯(PC),聚 丙烯(PP)等,其中PP管性能较好。具体如下: A 、PA管:化学性能稳定,半透明,能耐高温消毒。 B 、PP管:化学性能稳定,半透明,能耐高温消毒。 C 、PC管:透明度好,硬度大,能耐高温消毒。但不耐强酸强碱及 某些有机溶剂。主要用于5万(转/分)以上离心。 D、 CN管:质地较软,透明,但不耐强酸强碱及某些有机溶剂,不 能高压消毒。适合于蔗糖、甘油等密度梯度离心。因透明,利于收 集。 (3)不锈钢离心管强度大,不变形,能抗热,抗冻,抗化学腐蚀。 但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品,如强酸、强碱等 。

5.离心机的使用注意事项
(1) 离心机要置水平位置,以保证旋转轴与地面水平面垂 直。保持良好的通风环境,避免阳光和热源直接照射。 (2) 使用前应检查离心机转头转速,不得过速使用。禁止 离心机不加转子空转且确认转子已放稳,一定要选择 适宜的转子。 (3) 样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡(台称), 平衡后把它们放置于转子的对称位置,严禁装载奇数 的离心管。严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。 (4) 离心机工作前一定要检查离心机盖是否盖严,之后打 开电源开关,调整离心时间。

5.离心机的使用注意事项
(5) 启动离心时转速应由小至大,缓慢升速,达到预定转 速后再调整离心时间至预定时间。 (6) 在使用过程中,若发现声音不正常,应立即停机。 (7) 离心结束,要等到转速为零时才能打开离心机盖,取 出样品。调整调速旋钮至零位,同时关闭电源。 (8) 每次使用后,要仔细检查转头,及时清洗、擦干。长 期不使用,应将转子取下擦拭涂油并妥善保管。

二、光谱技术(分光光度技术)
1.分光光度法的概念
利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物 质的吸收光谱,利用此吸收光谱对物质进行定性定 量分析和物质结构分析的方法,称为分光光度法或 分光光度技术,使用的仪器称为分光光度计。 分光光度计灵敏度高,测定速度快,应用范围 广,其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研 究工作中必不可少的基本手段之一。

2. 常用光谱分析术语
① 光吸收:当一定波长的光通过某介质时,该介质有选择地吸收 某一波长的光,使入射光的强度减弱,这种现象称为光吸收。 ② 吸光度(A)(absorbance): 又称光密度(OD)或消光度 (E),表示光被吸收的量度。它与被测溶液的浓度(C), 液层的厚度(L)成正比,消光度越高,溶液对光吸收的程度 越大。 ③ 透光度(T)(transmittance)——表示光线透过的量度。通 常以百分数表示 。 ④ 消光系数(ε):是溶液对光吸收的比例常数,消光系数的物 理意义是吸光物质在单位浓度以及单位厚度时的吸光度值,用 ε表示。 ε值取决于溶质性质、入射光波长和温度。ε越大,吸收光的能 力越强,相应的分光光度法测定的灵敏度就越高。

3. 朗伯-比尔定律及应用
(1)朗伯-比尔(Lambert—Beer)定律:
① 朗伯定律: 一束单色光通过溶液后,由于溶液吸收了一部 分光能,光的强度就要减弱,若溶液浓度不变,则溶液的厚 度愈大,光的强度减低也愈显著(吸光度或消光度愈大)。 ② 比尔定律:当液层厚度一定时,透过光线的强度(透光度) 随溶液浓度的增加成指数函数减少。 ③ 朗伯-比尔(Lambert—Beer)定律 :光密度(OD)或吸 光度(A)与被测溶液的浓度(C),液层的厚度(L)成 正比;而透光度(T)的对数则与溶液的浓度(C),液层 的 厚 度 ( L ) 成 反 比 , 表 示 为 OD= KCL , 此 关 系 即 为 Lambert-Beer定律。式中K为消光系数,C为溶液浓度,L 为液层厚度)

(2) Lambert—Beer定律的应用:
① 标准管法: 根据OD1=K×C1×L OD2=K×C2×L 则OD1/OD2=C1/C2 待测定液浓度(C1)=(待测液光密度OD1/标准液光密度 OD2)×标准液浓度(C2) 此测定方法要求两者的浓度必须在光度计有效读数 范围内(一般在0.1-1.0之间),同时要求配制的标准溶液的 浓度应尽量接近被测定溶液,不然将出现测定误差。

(2) Lambert—Beer定律的应用:
② 标准曲线法
在光度计的测定范围内,配制一系列已知不同浓度的标准溶 液,在同一光度计中分别测出它们的光密度值(OD)。以测得的OD 值(A值)为纵坐标,相应的溶液浓度为横坐标,可作出一光密度 与浓度成正比通过原点的直线图。此直线称为标准曲线。 各个未知溶液只要按相同条件(与标准溶液相同)处理,在同一 光度计上测得光密度值,即可迅速从标准曲线上查出相应的浓度 值。此称为标准曲线法。 在被测同一物质的多个样品、浓度各不相同时,用标准管法测 定,需要配制许多标准溶液,十分不方便。标准曲线法在实验反 应条件比较恒定,样品数量多的测定中是十分方便准确的。

4.分光光度计种类
(1)可见分光光度计:在可见光区,除某些物质对光有吸收外, 很多物质本身并没有吸收,但可在一定条件下加入显色试剂或经过 处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深 浅的因素较多,且常使用单色光纯度较差的仪器,故测定时应用 标准品或对照品同时操作。 (2)紫外分光光度计:紫外光/可见光分光光度计基本装置中采用 高强度的钨灯作为光源,能够在可见光范围(400~700nm)调节。 氘灯用于紫外分光光度测量(200~400nm);使用氘灯时要用石 英杯,因为紫外线不能透过玻璃。 (3)红外分光光度计:

(4)原子吸收分光光度计: 其中紫外光区,波长范围为200~400nm;可见光区,波长 范围为400~700nm;红外光区,波长范围为700nm~500? m;无线 电波区,波长范围为1-5m。在生物化学领域里,应用最多的是波 长区域是可见光和紫外光。

5. 分光光度计的组成及测定原理
组成:(1)光源;(2)单色光器(包括产生平行光和把光 引向检测器的光学系统);(3)样品室(比色杯);(4)接 收检测放大系统;(5)显示或测量仪表。 光源 单色器 样品室 检测放大系统 显示器

测定原理:光源发生的光经单色光器变为一定波长的单色光, 此光通过吸收池,被吸光物质所吸收,吸收后,透出的光照 到接受器上产生电流,电流推动测量仪表以光密度或透光率 表示出来 。

7200型可见分光光度计的使用方法 ★
1. 开机前的检查:开机前打开样品室盖,检查样品室内是否有物品挡在光路上。 光路上有阻挡物将影响仪器的自检,甚至造成仪器故障。 2. 接通仪器电源,预热20~30分钟后,用波长选择旋钮设置测试所需波长。 3. 将校正黑体置于光路,用〈MODE〉键选择“T”测试方式,调节T为 “000.0”。 4. 将空白溶液与待测溶液分别倒入比色皿中,把盛有溶液的比色皿放入比色架 中(注意比色皿的光面和毛面不要放反),盖上样品室盖,使空白溶液对准 光路,用〈MODE〉键选择“T”测试方式,按“100%”键调节光度计读 数为“100.0”。用〈MODE〉键选择“A”测试方式,看光度计读数是否为 “0.000”。如是,则可以开始测定待测溶液的吸光度值。 5. 轻轻拉或推动比色架固定拉杆,使第二个比色皿溶液处在光路中,此时读数 即为该溶液的吸光度。 6. 依次拉或推出第三,第四个比色皿,分别读取溶液的吸光度值。 7. 测定完毕,先打开样品室盖,再关闭电源。将比色皿取出洗净,并将比色皿 座架及暗箱用软纸擦净。

三、层析技术
1. 概念和原理:
又称色谱技术。利用被分离混合物中各组分的物理、 化学及生物学特性(主要指吸附能力、溶解度、分子 大小、分子带电性质及带电量的多少、分子亲和力等) 的差异,当它们通过一个由互不相溶的两相——固定 相和流动相组成的体系时,由于混合物各组分在两相 之间的分配比例、移动速度不同而将混合成分分开的 技术。层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一, 运用这种方法可以分离性质极为相似,而用一般化学 方法难以分离的各种化合物,如各种氨基酸、核苷酸、 糖、蛋白质等。

2. 层析分类
(1)按固定相分类:根据固定相的形式不同,可分为:

纸层析、薄层层析和柱层析。
纸层析:用滤纸作液体的载体,点样后用流动相展开。 薄层层析:将适当粘度的固定相均匀铺在薄板上,点样后,用流 动相展开; 柱层析:固定相装于柱内,使样品沿着一个方向移动而分离; (2)按流动相分类,可分为 :

气相层析和液相层析。
气相层析:是指以气体为流动相的层析方法。 根据固定相的性质不同又可以分为气-固层析(GSC)和气-液 层析(GLC)。 液相层析:是以液体为流动相的层析方法,称之为液相层析。 同理,根据固定相的性质不同又可以把液相层析分为液-固 层析(LSC)和液-液层析(LLC)。

2. 层析分类
(3)按分离原理分类,可分为: ① 凝胶层析(gel chromtography):凝胶层析又称为凝胶过 滤、分子筛过滤、凝胶渗透层析等。其基本原理是利用被分离 物质分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点,将被 分离物质各成分按分子大小分开从而达到分离的方法。 分子筛效应:凝胶颗粒具有多孔网状结构,小分子易进入 凝胶网孔,流程长而移动速度慢,而大分子物质不能进入凝胶 网孔,沿凝胶颗粒间隙流动,流程短移动快。分子量大小不同 的多种成份在通过凝胶床时,按照分子量由大到小的顺序流出层 析柱,凝胶表现分子筛效应,凝胶层析又称分子筛层析。

2. 层析分类
(3)按分离原理分类,可分为: ② 离子交换层析(lon exchange chroma tography): 离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相,利用它 与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种 方法。 离子交换层析技术已广泛于各学科领域。在生物化学及临床生化 检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质,也可用于分离核酸、核 苷酸及其它带电荷的生物分子。以及溶液的中和、脱色等方面。

2. 层析分类
(3)按分离原理分类,可分为: ③ 吸附层析(absorption chromatography):吸附 层析是指待分离混合物随流动相通过由吸附剂组成 的固定相时,由于吸附剂对待分离混合物中不同组 分的吸附力不同,从而使混合物中各组分得以分离 的一种层析方法。 吸附层析常应用于: A. 生物大分子物质的分离、纯化与分析; B. 小分子化合物的分离、纯化及分析; C. 稀溶液的浓缩

2. 层析分类
(3)按分离原理分类,可分为: ④ 分配层析(partition chroma tography): 被分离组分在固定相和流动相 中不断发生吸附和解吸附的作用, 在移动的过程中物质在两相之间进 行分配。利用被分离物质在两相中 分配系数的差异而进行分离的一种 方法,称之为分配层析。 纸层析属于典型的分配层析,且 系统简单,使用方便,在生物化学 的发展中发挥过极其重要的作用。

2. 层析分类
(3)按分离原理分类,可分为: ⑤ 亲和层析(afinity chromatography):在固定 相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基,这些 配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性 结合而进行分离的一种方法,称之为亲和层析。

2. 层析分类
亲和层析特点 :
亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使 生物分子分离纯化的层析技术。 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有: 酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、 激素和其受体、DNA与结合蛋白等。 在成对互配的生物分子中,可把任何一方作为固定相,而对样品 溶液中的另一方分子进行亲和层析,达到分离纯化目的。例如,酶与 其辅酶是成对互配的,既可把辅酶作为固定相,使样品中的酶分离纯 化,也可把酶作为固定相,使样品中的辅酶分离纯化。 亲和层析应用: 亲和层析可用于纯化生物大分子:稀溶液的浓缩;不稳定蛋白质 的贮藏;从纯化的分子中除去残余的污染物;用免疫吸附剂吸附纯化 对此尚无互补配体的生物大分子;分离核酸是亲和层析应用的一个重 要方面。

2. 层析分类
(3)按分离原理分类,可分为: ⑥ 金属螯合层析(metal chelating chromatography) 利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价 金属离子发生螯合作用,结合在固定相上,二价金属离子 可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似 物发生特异螯合作用而进行分离的方法,称之为金属螯合 层析。

2. 层析分类
(3)按分离原理分类,可分为: ⑦ 疏水层析(hydrophobic chromatography):利用固定相 载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发 生可逆性结合而进行分离的方法,称之为疏水层析。

2. 层析分类
(3)按分离原理分类,可分为: ⑧ 反向层析(reverse phase chromatography) 利用固定相载体上偶联的疏水性较强的配基,在一定非极性 的溶剂中能够与溶剂中的疏水分子发生作用,以非极性配基为固 定相,极性溶剂为流动相来分离不同极性的物质的方法,称之为 反相层析。 ⑨ 聚焦层析(focusing chromatography) 利用固定相载体上偶联的载体两性电解质分子,在层析过程 中所形成的pH梯度,并与流动相中不同等电点的分子发生聚焦反 应进行分离的方法,称之为聚焦层析。 ⑩ 灌注层析(perfusion chromatography) 利用刚性较强的层析介质颗粒中具有的不同大小贯穿孔与流 动相中溶质分子分子量的差异进行分离的方法,称之为灌注层析。

3. 与层析法有关的仪器
① 自动部分收集器 当一个管中收集了一定量的洗脱液后,另一个新 的收集管自动接替它的位置。 ② 核酸蛋白检测仪 是层析时监测层析洗脱液浓度变化的仪器 。洗脱 液从柱的出口流出,通过细管被引向一个置于适当 波长的石英玻璃流通池内,光吸收的变化通过一个 光电管来检测,并在图表记录仪上被描绘出来。核 酸—蛋白检测仪是柱层析时的眼睛。 ③ 电脑采集器、电脑 ④ 恒流装置——恒流泵

四、电泳技术
(一)、 基本概念和原理:
概念带电粒子在电场中向其与自身电荷相反的电极移动的现象称为电 泳(e1ectrophoresis)。以此为原理衍生出的各种电泳方法称为电泳技术。

任何物质由于其本身的解离作用或表面上吸附其他带电质点,在 电场中便会向一定的电极移动。
当蛋白质溶液处于某一PH时,蛋白质解离成正、负离子的趋势相 等,即成为兼性离子,净电荷为零,此时溶液的PH称为蛋白质的等 电点(PI)。 如果溶液的pH大于pI,则蛋白质分子和核酸分子会解离出H+ 而 带负电,在电场中向正极移动; 如果溶液的pH小于pI,则蛋白质分子和核酸分子结合一部分H+而 带正电,在电场中向负极移动。

(二)、电泳的分类
1. 按有无固体支持物分为 ? 区带电泳,按支持物的物理性状又分为: 纸电泳、薄层电泳(薄膜及薄板)、凝胶电泳 (琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、硅胶 凝胶)、粉末电泳(如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电 泳)、丝状电泳(如尼龙丝、人造丝电泳) 。 ? 自由界面电泳 支持物为溶液,很少用。 电泳槽的形式也是多种多样的,有垂直的,水平 的,柱状的,板状的,毛细管的,湿小室及幕状的。

(二)、电泳的分类
2. 按支持物的装置形式不同,区带电泳可分为: (1)平板式电泳: 电泳支持物(如凝胶)制成水平板状, 是最常用的电泳方式。 (2)垂直板式电泳:如聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式 电泳。 (3)垂直柱式电泳: 电泳支持物置于玻璃管中,电泳区 带成圆盘状如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳。 3. 按pH的连续性不同,区带电泳可分为: (1)连续pH电泳:即整个电泳过程pH保持不变,如常 用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。 (2)非连续pH电泳:缓冲液和电泳支持物间有不同的 pH的电泳,如SDS-PAGE,等电聚焦电泳等。

(三)、影响电泳的内外界因素
内因: ① 净电荷;② 质点大小;③ 质点形状 外因: ① 电场强度 :电场强度是指单位长度(cm)的电位降,也称电 势 梯度。当电压在500V以下,电场强度在2-10v/cm时为常压电 泳。电压在500V以上,电场强度在20-200V/cm时为高压电泳。 电场强度大,带电质点的迁移率加速,因此省时,但因产生大量 热量,应配备冷却装置以维持恒温。 ② 缓冲液的pH值(pH恒定):缓冲溶液的pH决定被分离物质的解 离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。 若溶液pH处于等电点碱侧,即pH>pI,则质点带负电荷, 向正极移动。若溶液pH处于等电点酸侧,即pH<pI,则质点带 正电荷,在电场中向负极移动。 溶液的pH离pI越远,样品解离程度越大,所带净电荷越多, 电泳迁移率越大。因此在电泳时,应根据样品性质,选择合适的 pH值缓冲液,使各带电颗粒所带电荷差异较大,便于分离。且 该缓冲溶液应具有一定的缓冲能力。

(三)、影响电泳的内外界因素
外因:
③ 溶液的离子强度 :电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移 率的降低。(最适:0.02-0.2) 其原因是带电质点吸引相反负荷的离子聚集其周围,形成一 个与运动质点负荷相反的离子氛(ionic atmosphere),离子氛不 仅降低质点的带电量,同时增加质点前移的阻力,甚至使其不能 泳动。然而离子浓度过低,会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量, 不易维持溶液的pH值,影响质点的带电量,改变泳动速度。 ④ 电渗现象:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为 电渗(electro-osmosis)。 其产生的原因是固体支持物多孔,且带有可解离的化学基团, 因此常吸附溶液中的正离子或负离子,使溶液相对带负电或正电, 故移动。

(三)、影响电泳的内外界因素
外因:
⑤ 支持物的影响:对支持物的一般要求是均匀,吸附力和电 渗小,机械性能好,便于染色或紫外光下检测,故最好透明, 无紫 外吸收。常用的支持物有滤纸,醋酸纤维素薄膜,淀粉 凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖凝胶等。? ⑥ 焦耳热的影响:电泳时会产生焦耳热,使介质粘度下降, 分子运动加快,迁移率增加,同时温度过高会使样 品中的生 物大分子变性失活,因此电泳时,要控制电压或电流,也可 安装冷却散热装置。?

(四)、几种常见的电泳方式及应用
1. 醋酸纤维素薄膜电泳 2. 琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳主要用于分离、鉴定核酸, 如DNA鉴定,DNA限制性内切酶图谱制作等,为DNA分子及 其片段分子量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳:PAGE应用广泛,可用于蛋白质、酶、 核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备,还可测定 分子量、等电点等 。 4. SDS-PAGE:主要用于测定单链蛋白质或者蛋白质分子的亚 基相对分子质量,是目前测定亚基相对分子质量的一种最好方 法。它可用于多肽分子质量分析,变性蛋白质分离。

(四)、几种常见的电泳方式及应用
5. 等电聚焦电泳:其分离原理是在凝胶中通过加入两性电解质 形成一个pH 梯度,两性物质在电泳过程中会被集中在与其等 电点相等的pH区域内,从而得到分离。 (IEF)是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质来分 离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH 单位,因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质 组分。 6. 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳:又称二维电泳(或双向电泳), 第一向是IEF,第二向是SDS-PAGE。可把复杂的蛋白质混 合物中的蛋白在二维平面上分离展开。

(四)、几种常见的电泳方式及应用
7. 毛细管电泳 :Neuhoff等人于1973年建立了毛细管均一 浓度和梯度浓度凝胶用来分析微量蛋白质的方法,即微柱 胶电泳。 8. 免疫电泳:免疫电泳技术是将琼脂电泳与免疫扩散相结 合的一种常用的免疫学实验方法。此项技术由于具有抗原 抗体反应的高度特异性,电泳分离技术的快速,灵敏和高 分辨力,以及实验设备和操作简便等优点,至今仍作为免 疫学的一种基本技术,广泛用于科学研究和临床实验诊断。 数十年来,根据不同的实验目的和要求,在经典的免疫电 泳技术基础上,又衍生出对流免疫电泳、火箭电泳、交叉 免疫电泳及免疫固定电泳等许多新技术和新方法。

(五)、电泳技术的应用

1. 分离各种有机物:如蛋白质、酶、核酸等

2. 分析某种物质的纯度及分子量
3. 电泳技术与层析法结合可用于物质的结构分析

4. 免疫电泳可提高对蛋白质的鉴别能力

五、沉淀分离技术
通过改变某些条件或加入某种物质,使溶 液中某种溶质的溶解度降低,形成不溶性颗粒 而从溶液中沉淀析出的技术。 常用于生物大分子制备过程的初期阶段, 各种色谱和电泳技术常在分离纯化的中后阶段 使用。

(一)、蛋白质的沉淀分离

1. 盐析沉淀法:盐溶、盐析 2. 等电点沉淀法 3. 有机溶剂沉淀法 4. 选择性变性沉淀法 5. 非离子多聚物沉淀法

(二)、核酸的提取与沉淀分离
1. RNA的提取 2. DNA的提取 3. 核酸的沉淀分离: (1)有机溶剂沉淀法 (2)等电点沉淀法 (3)钙盐沉淀法 (4)选择性溶剂沉淀法

本学期实验 理论复习

实验一
实验基本知识与操作

血液样品的采集及组织匀浆的制备

内容提要
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目的 实验内容:
常用生化仪器 ; 玻璃仪器的洗涤 ; 吸量管和微量移液器的使用 ; 试剂配制 ; 离心机的使用方法 ; 实验室常见仪器设备简介 。

一、目的
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1.熟悉实验室规则及常用生化仪器。
2.掌握各种仪器的正规操作。 3.清点洗刷实验用具。

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二.实验内容
(一)常用生化仪器
玻璃仪器: 量器:量筒、容量瓶、吸量管、离心管、微量 取液器 容器:烧杯、试管、锥形瓶、滴管 仪器:离心机、水浴箱、电泳仪、分光光度计等

二.实验内容
(二)玻璃仪器的洗涤
1.初用的玻璃仪器的清洗:
表面附有碱性物质,先用去污粉洗,再用自来水 冲洗干净,然后浸于盐酸溶液浸泡过夜,再用自来水 反复冲洗干净,最后用蒸馏水冲洗1-2次,80℃烤干 备用。

二.实验内容
(二)玻璃仪器的洗涤
2.使用过的玻璃仪器洗涤:
非计量仪器或粗容量仪器涤(烧杯、试管、量筒)等先用 肥皂水刷洗,再用自来水冲洗干净,最后用蒸馏水冲洗1-2次, 洗净之器皿倒臵干净处晾干或烘箱烤干(量筒不可烘烤)。 量器(吸管、滴定管、容量瓶等)先用自来水冲洗,直至不 挂水珠,再用蒸馏水冲洗1-2次,风干备用。若冲洗后仍挂水珠 ,则将其晾干后浸于铬酸洗液浸泡数小时。然后用自来水反复冲 洗干净,再用蒸馏水冲洗1-2次,除吸管可烘干外,其它只能倒 臵晾干。

二.实验内容
(二)玻璃仪器的洗涤
3.操作:
每个人按上述方法刷洗5支试管及烧杯、锥形瓶各 1-2个。洗净后请教师检查。

二.实验内容
(三)吸量管和微量移液器的使用
1.吸量管的使用
(1)正确拿法 中指和拇指拿住吸管上端,食指顶住 吸量管顶端。 (2)取液 用橡皮球吸液体至刻度上,眼睛看着液面 上升;吸完后用食指顶住吸量管上端。

二.实验内容
(三)吸量管和微量移液器的使用
1.吸量管的使用
(3)调刻度 吸量管与地面保持垂直,下口与试剂瓶 接触,并成一角度;用食指控制液体下降至最上一刻 度处;液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。 (4)放液 吸量管移入准备接受溶液的容器中,仍 使其出口尖端接触器壁,并成一角度,吸量管仍保持 垂直。放开食指,使液体自动流出。

二.实验内容
(三)吸量管和微量移液器的使用
2.微量移液器的使用
调节体积选取钮至所需值,套上吸头,旋紧。垂 直持握移液器,用大拇指按下液体吸放钮至第1档,将 吸头插入待吸溶液,松开大拇指使吸放钮回复原位。 将移液器移入准备接受液体的仪器,用大拇指再次按 下液体吸放钮,至第1档后继续至第2档以排空液体。

二.实验内容
(三)吸量管和微量移液器的使用
3.练习吸量管的使用
取50 ml锥形瓶加入未知酸5 ml ,酚酞指示剂1滴

,摇匀,用0.01 mol/L NaOH滴定,记录结果。(无色 酚酞遇酸不变色,遇碱变红。)滴定时边滴边摇动锥 形瓶。

二.实验内容
(四) 试剂配制
1、溶液浓度表示法 2、溶液的配制方法 3、操作
重量浓度 百分浓度 摩尔(mol)和摩尔浓度(mol/L)

百分浓度的配法 摩尔浓度溶液配法 溶液浓度的调整 常用酸碱的摩尔浓度计算

二.实验内容
(四) 试剂配制
1.溶液浓度表示法
(1)重量浓度:有时候溶液的浓度以单位体积溶液中所 含溶质的重量来表示。现在规定容量的单位是升(L) ,所以浓度表示为克/升(g/L)、毫克/升(mg/L)、 微克/升(?g/L)等。

二.实验内容
(四) 试剂配制
1.溶液浓度表示法
(2)百分浓度:过去习惯用百分含量来表示浓度,但其 含意很不清楚,如2%的醋酸可以解释为 每100g溶液 中有2g醋酸(W/W), 每100ml溶液中有2g醋酸(W/V)
每100ml溶液中有2ml醋酸(V/V)

二.实验内容
(四) 试剂配制
1.溶液浓度表示法
(3)摩尔(mol)和摩尔浓度(mol/L):
摩尔浓度是用以表明在每升溶液中所含溶质的 摩尔数。1摩尔浓度的溶液为每升溶液中含溶质1摩尔 (mol/L)。

二.实验内容
(四) 试剂配制
2.溶液的配制方法
(1)百分浓度的配法

a.重量与体积百分浓度(W/V):即每100ml溶液中含有 溶质的克数。如欲配制5%(W/V)NaCl溶液,则称取5g NaCl用少量蒸馏水溶解后,再加水到100ml即可。 b.体积与体积百分浓度(V/V):即每100ml溶液中含有 溶质的毫升数。如欲配制 30%(V/V)的醋酸溶液,即用量简 量取30ml冰醋酸(含醋酸近100%),加入蒸馏水至100ml。

二.实验内容
(四) 试剂配制
2.溶液的配制方法
(2)摩尔浓度溶液配法

如配制1 mol/L NaCl溶液的方法为:已知NaCl的分子量 为 58.5,即精确称取NaC 158.5g,用少许蒸馏水溶解后转入 1000 ml容量瓶中,最后加蒸馏水至容量瓶刻度,混匀即可。 摩尔浓度要求的精确度为1/100。配制时溶质称量应需用 1/1000的天平,溶剂体积要用容量瓶定量。

二.实验内容
(四) 试剂配制 2.溶液的配制方法
(3)溶液浓度的调整 ①溶液稀释法:即将已知浓度的浓溶液稀释成所需要某浓度 的溶液。其方法是根据浓度与体积成反比的原理进行计算配制: C1?V1=C2?V2 V1=浓溶液体积 c1=浓溶液浓度

V2=稀释后溶液体积

c2=稀释后溶液浓度

二.实验内容
(四) 试剂配制
2.溶液的配制方法 (3)溶液浓度的调整
①溶液稀释法: 例:将6mol/L H2SO4 450ml稀释到多少毫升其浓度为 2.5mol/L? 6?450=2.5?V2

即将 6mol/L H2SO4 450ml加水稀释到1080ml,则成2.5mol/L H2SO4 溶液。

二.实验内容
(四) 试剂配制
2.溶液的配制方法
(3)溶液浓度的调整 ②稀溶液调整为浓溶液法:仍按照溶液浓度与体积成反比的 原理及交叉法计算。公式为: C?(V1+V2)=c2?V2+C1?V1 V1=浓溶液体积 V2=稀溶液体积 C1=浓溶液浓度 C2=稀溶液浓度

C=所需溶液浓度

二.实验内容
(四) 试剂配制
2.溶液的配制方法
(3)溶液浓度的调整
②稀溶液调整为浓溶液法:例:现有0.25 mol/L NaOH 800ml, 需加多少毫升1 mol/L NaOH才能使之成为 0.4 mol/L NaOH?
代入公式:0.4?(V1+800)=0.25?800+1?V1 V1=200 即加入200 ml 1 mol/L NaOH即可使800 ml 0.25mol/L NaOH 成为0.4 mol/L NaOH溶液。

二.实验内容
(四) 试剂配制
2、溶液的配制方法
(4)常用酸碱的摩尔浓度计算 实验室中常用的酸Hcl、H2SO4、CH3COOH等及碱NH4OH 等都是液体的,试剂瓶上标有比重、浓度(W/W)、分子量等, 可以按以下公式计算出摩尔浓度:

例:求含量浓度38%(W/W),比重1.19的HCl分子量36.46的摩 尔浓度是多少?

二.实验内容
(四) 试剂配制
3.操作: 每人各配一个百分浓度,一个摩尔浓度的试剂

二.实验内容
(五)离心机的使用方法
离心机是利用离心力将悬浮液中的微粒从溶液中分 离出来的一种仪器。根据最高离心转速的不同可将离 心机分为三种类型:
普通离心机(其最高转速一般在4000转/分至6000转/分) 高速离心机(转速可达10000转/分至25000转/分) 超速离心机(转速可超过50000转/分以上)

生化实验室常使用普通离心机。

二.实验内容
(五)离心机的使用方法
1.使用前先检查变速旋钮是否在“0”位,外套管是否完整无损 和垫有橡皮垫。 2.离心时先将待离心的物质转移到大小合适的离心管内,盛量 不宜过多,占管的2/3体积为宜,以免溢出。将此离心管放入外套 管,再在离心管与外套管间加入缓冲用水。 3.将一对装有离心管的外套管在台称上平衡。如不平衡可调整 缓冲用水或离心物质的量。

二.实验内容
(五)离心机的使用方法
4.将平衡好的套管,按对称方位放到离心机插孔中。把不用的 离心套管取出,盖严离心机盖。

5.接通电源,开启开关,平稳、缓慢移动调速手柄,至所需转 速。计时。
6.当达到离心所需时间后,将调速柄慢慢调回零位,关闭开关 。待离心机自动停止转动后,再打开离心机盖取出样品。 7.用完后,取出套管中橡皮垫洗净,冲洗外套管,倒臵干燥。

二.实验内容
(六)实验室常见仪器设备简介
离心机、分光光度计、电泳仪、电子天平 、pH计、水浴锅、电热干燥箱等。

组织匀浆
组织匀浆: 指将动物组织细胞在适当的缓冲溶液 中研磨,使细胞膜破坏,细胞内容物溶解 或悬浮于缓冲液中形成的混悬液。

实验二
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

内容提要
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?

1.实验目的 2.实验原理 3.试剂和器材 4.操作步骤 5.注意事项 6.思考题

一.实验目的
?

1.了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理 2.掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操 作步骤

?

二.实验原理
蛋白质的存在影响酸碱滴定中某些指示剂的颜色变化,
即改变这些染料的光吸收。在此基础上发展了蛋白质染色测定 方法。可用的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲 酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色,当它与蛋白质 通过范德华键结合后,变为蓝色,且在蛋白质一定浓度范围内 符合比尔定律,可在595 nm波长处比色测定。2~5分钟即呈最 大光吸收,至少稳定1小时。10~100 μg/ml蛋白质范围内均可 。

二.实验原理
优点:
(1)灵敏度高:蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数, 因此蛋白质测定的灵敏度较高,最低检出量为1ug蛋白质。据估 计比Lowry法约高四倍, (2)测定快速、简便:染料与蛋白质的结合,大约只需2分钟 ,结合物的颜色在1小时内是稳定的。因而完全不用像Lowry法那 样费时和严格地控制时间。 (3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、 Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此 测定法。

二.实验原理
缺点:
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲 线时通常选用 γ—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂 、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1M的NaOH,少量的 去污剂可通过用适当的对照消除,而必要时必须预先处理样品。 (3)标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算 ,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

三.实验试剂和器材
1.试剂:
(1)染色液:取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中, 加入100ml 85%磷酸,加双蒸水稀释至1L。该染色液可保存数月,若 不加水可长期保存,用前稀释。 (2)标准蛋白溶液:结晶牛血清白蛋白用蒸馏水配制成1mg/ml浓 度。 (3)样品:经100倍稀释的牛奶。

三.实验试剂和器材
2.器材:
分析天平; 吸管0.1ml×1、1ml×2、5ml×1;

试管10个;
722型分光光度计; 容量瓶100ml、1000ml各一个。

四.操作步骤
1.蛋白质标准曲线的绘制 取11支试管编号,按下表加入试剂。
管号 试剂
标准蛋白(μl)

0 0

1 10 90 5

2 20 80 5

3 30 70 5

4 40 60 5

5 50 50 5

6 60 40 5

7 70 30 5

8 80 20 5

9 90 10 5

10 100 0 5

双蒸水(μl)

100
染色液(ml)

5

混匀,5min后测定各管OD595,并以蛋白浓度为横坐 标,OD595值为纵坐标,绘制标准曲线。

四.操作步骤
2.样品测定:
100倍稀释牛奶,并于1支干净试管中加入适当量(100 ul),按 上法测OD值,对照蛋白质浓度标准曲线,求得蛋白含量,再乘以牛 奶稀释倍数,即得原样品浓度。并将之换算为百分浓度。 计算可得:
测得的蛋白质含量(μg)
样品的蛋白质含量(μg/g鲜重)=

样品鲜重(g)

五.注意事项
1.如果要求严格,最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收 ,因为这段时间内颜色是最稳定的。 2.测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,不 可使用石英比色皿(因不易洗去染色),可用塑料或玻璃比 色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色。塑 料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 3.若选择在旋涡混合器上混合,注意不要太剧烈,以免产生大 量气泡而难于消除。

六.思考题
1.考马斯亮蓝染色测定蛋白质含量的方法有哪些优缺点 ?

2.在对某一样品测定其含量时,为什么有时需对样品做 稀释?采用分光光度法测定样品含量时,有时需稀释 样品,为什么?

实验三
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争 性抑制的观察

内容提要
?

实验原理
实验试剂与器材 操作步骤

?

?

?

思考题

一.实验原理
脱氢酶的作用在于激活并脱下底物上的氢, 使之通过一系列传递体最后传给氧而生成水。在 缺氧的条件下,适当的受氢体也可接受脱氢酶从 底物上脱下的氢。因此,选用适当的受氢体便可 以观察到脱氢酶的作用。

一.实验原理
琥珀酸脱氢酶能使琥珀酸脱氢生成延胡索酸,并将脱下的氢交 给受氢体。当在缺氧的条件下可用甲烯蓝(美蓝,蓝色物质)作为受 氢体时,甲烯蓝被氢还原生成甲烯白(美白,无色物质),其反应如 下:
CH2—COOH + MB 琥珀酸脱氢酶 CH—COOH + MB· 2H

CH2—COOH 无氧条件 琥珀酸 甲烯蓝

CH—COOH 延胡索酸

甲烯白

根据这种蓝色转变为无色的变化过程,就可以判断出琥珀酸脱 氢酶起了催化作用。

一.实验原理
丙二酸的结构与琥珀酸相似,可与琥珀酸竞相结合琥珀酸 脱氢酶的活性中心,从而抑制该酶的活性,是琥珀酸脱氢酶的 竞争性抑制剂。这种抑制作用即属酶的竞争性抑制作用。

由于甲烯蓝容易被空气中氧所氧化,所以实验需在无氧条 件下进行。例如,用液体石蜡(或琼脂)封闭反应液,可以制 造无氧环境,从而不用抽真空设备即可观察实验结果。 琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中一个重要的酶,测定细胞中 有无琥珀酸脱氢酶活性可以初步鉴定三羧酸循环途径是否存在 。琥珀酸脱氢酶活性的检测在生产实际中也具有一定的作用。

二.实验试剂与器材
1.试剂:
(1)1.5% (w/v)琥珀酸钠溶液:称取1.5g 琥珀酸钠,用蒸馏 水溶解并稀释到100ml。(若无琥珀酸钠,则可以用琥珀酸 配成水溶液后,再用NaOH溶液中和至pH7—8)
(2)1% (w/v)丙二酸钠溶液:称取丙二酸钠1g,用蒸馏水溶 解并稀释到100ml。(若无丙二酸钠,则可以用丙二酸配成 水溶液后,再用NaOH溶液中和至pH7—8) (3)0.02% (w/v)甲烯蓝溶液

二.实验试剂与器材
1.试剂:
(4)1/15mol/L Na2HPO4溶液:称取Na2HPO4 · 2O 2H 11.8g,用蒸馏水溶解并稀释到1000 ml (5) 液体石蜡油、石英砂、手术剪、天平、研钵、离心 机、恒温水浴锅、离心管等。

二.实验试剂与器材
2.器材:
石英砂、手术剪、天平、研钵、离心机、恒温水 浴锅、离心管等。

三.操作步骤
1.猪心脏提取液的制备
(1)称取新鲜猪心脏1.5-2g放臵研钵中剪碎;
(2)加入等体积的净细砂和1/15mol/L Na2HPO4溶液3-4 ml,然 后将之研磨成匀浆;

(3)再加入1/15mol/L Na2HPO4溶液6-7 ml,放臵30min,不时摇 动;
(4)于2000rpm离心10min,取上清备用。

三.操作步骤
2.取4支试管,按下表编号操作:
试管号 心脏提取液 (滴) 1.5%琥珀酸钠 (滴) 1%丙二酸钠 (滴) 蒸馏水 (滴) 0.02%甲烯蓝 (滴)

1
2 3 4

10
10(煮沸) 10 10

5
5 5 20

——
—— 5 5

20
20 15 ——

2
2 2 2

三.操作步骤
3.加好试剂后混匀,然后立即在各试管中加入一层(约 5-10滴)液体石蜡油。 4.将各管臵37℃恒温水浴中保温,30 min内观察各管颜 色的变化。比较颜色变化的速度,并试分析其原因。 然后将第一支试管用力振摇,观察有何变化,记录并 解释之。

四.思考题
1.本实验过程中,加液体石蜡油的目的是什么?

2. 各管颜色变化快慢及程度有何不同?为什么?
3. 竞争性抑制作用的原理是什么?用何种方法可 解除或减弱竞争性抑制作用?

实验四
血液葡萄糖的定量测定

内容提要
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实验原理
实验试剂与器材

操作步骤
注意事项

思考题

一.实验原理
葡萄糖(C6H12O6)是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原

性,与碱性铜试剂混合加热,葡萄糖分子中的醛基( C
成羧基 ( C
O H

O H

)被氧化

),而铜试剂中的二价铜(Cu2+),被还原成砖红色的氧

化亚铜(Cu2O)而沉淀。氧化亚铜可使磷钼酸还原生成钼蓝,使溶液呈 蓝色。其生成蓝色的深浅与血滤液中葡萄糖浓度成正比。选用颜色深浅较 接近于测定管的标准管一同比色,即可求出测定管中葡萄糖的含量。 福林—吴宪二氏法测定血糖是在特制福林—吴宪血糖管中进行。该 血糖管于4ml容量处,管颈缩小成一细管状,这样可以减少在煮沸时管液 体与空气的接触,以避免产生的亚铜再氧化。

二.实验试剂与器材
1.试剂:
(1)1/3mol/L硫酸溶液:取浓硫酸(比重1.84)2.3ml , 加 入 到 约 500ml 蒸 馏 水 中 , 再 定 容 至 1,000ml 。 用 0.1mol/L NaOH标定,调整至1/3mol/L。 (2) 10%钨酸钠溶液:将钨酸钠(Na2WO4· 2H2O) 10g溶于蒸馏水,使全量至100ml(此液呈弱碱性,取 10ml 用 0.1mol/L HCL 溶 液 滴 定 , 达 中 和 时 约 需 0.1mol/L HCL0.4ml)。

二.实验试剂与器材
1.试剂:
(3)碱性铜试剂:取无水碳酸钠40g溶于约400ml蒸馏水 中;酒石酸7.5g溶于约300ml蒸馏水中,结晶硫酸铜4.5g 溶于200ml水中,分别加热助溶。冷却后,将酒石酸溶液 倾入碳酸钠溶液中,混匀,移入1000ml容量瓶中,再将 硫酸铜溶液倾入并加蒸馏水至刻度。混匀,贮存于棕色 瓶中。

二.实验试剂与器材
1.试剂:
(4)磷钼酸试剂 取钼酸(HMoO4)70g和钨酸钠10g, 加入10%NaOH溶液400ml及蒸馏水400ml,混合后煮沸 20-40分钟,以除去钼酸中存在的氨(直至无氨味为止) ,冷却后加入浓磷酸(80%)250ml,混匀,最后以蒸馏 水稀至1000ml。

二.实验试剂与器材
1.试剂:
(5)0.25%苯甲酸溶液 (6)葡萄糖贮存标准液(10mg/ml):将少量无水葡萄 糖(A.R)置于硫酸干燥器内过夜。精确称取此葡萄糖 1.000g,以0.25%苯甲酸溶液溶解并转入100ml容量瓶 内,再以0.25%苯甲酸溶液稀释至100ml刻度。置冰箱 中可长期保存。

二.实验试剂与器材
1.试剂:
(7)葡萄糖应用标准液(0.1mg/ml):准确吸取葡萄糖 贮存标准液1.0ml,臵100ml容量瓶内,以0.25%苯甲酸 溶液稀释至100ml刻度。 (8)1:4磷钼酸稀释液:取磷钼酸试剂1份,加蒸馏水4 份,混匀即可。
(9)抗凝血:用草酸钾抗凝。

二.实验试剂与器材
2.器材:
移液管、胶头滴管、试管、试管架、比色皿 、分光光度计、水浴锅、擦镜纸等。

三.操作步骤
1.用钨酸法制备1:10全血无蛋白滤液 2.取4支血糖管按下表操作:
1:4磷钼酸溶液加至25刻度处后,用橡皮塞塞紧管口 颠倒混匀,用空白管调“0”点,在420 nm波长处进行比色 ,读取并记录各管光密度值。

三.操作步骤
空白管 无蛋白滤液 — 低浓度标准管 — 高浓度标准管 — 测定管 1.0

蒸馏水
标准葡萄糖应用液 碱性铜试剂

2.0
— 2.0

1.0
1.0 2.0


2.0 2.0

1.0
— 2.0

混匀,置沸水浴中8min,取出用流动自来水冷却3min(切勿摇动血糖管) 磷钼酸试剂 2.0 2.0 2.0 2.0

混匀后放置2min(使CO2气体逸出) 1:4磷钼酸溶液加至 25 25 25 25

三.操作步骤
3.计算:
高标准管:
测定管光密度 标准管光密度 ×0.2 × 100 0.1 = 测定管光密度 标准管光密度 ×200 =葡萄糖mg/100ml

低标准管:
测定管光密度 标准管光密度 ×0.1× 100 0.1 = 测定管光密度 标准管光密度 ×100 =葡萄糖mg/100ml

四.注意事项
(1)血滤液内除葡萄糖外尚含有其它还原性物质(约占10-20%)。 用此法测得之血糖含量较实际葡萄糖含量稍高。 (2)一定要等水沸后,再放入血糖管。准确加热8分钟,时间过久, 呈色较深,反之则浅,均影响结果的准确性。 (3)血糖管下部的管径较细,以避免还原生成的亚铜被空气中的氧 再氧化,降低实际结果。同理,冷却时切不可摇动血糖管。

(4)加入磷钼酸试剂后显颜并不稳定,故应迅速进行比色。

五.思考题
1.简述福林—吴宪(Folin-Wu)氏法测定血糖的原理。 2.血糖管的结构有何特点?使用时应注意什么? 3.测定血糖为何用无蛋白滤液,而不用全血? 4.测定血糖中福林—吴宪(Folin-Wu)氏法有何优缺点?

实验五
核酸的定量测定 ——紫外吸收法

内容提要
? ? ? ? ? ?

?

1.概述 2.实验目的 3.实验原理 4.实验试剂及仪器 5.方法与操作步骤 6.注意事项 7.思考题

一、概述
核酸定量测定技术包括紫外分光光度法、定磷 法、定糖法三种。紫外分光光度法是目前使用方便、 准确、快捷的常用方法,采用紫外分光光度法可以测 定核酸的浓度和纯度,有微量紫外分光光度计可供使 用。定磷法和定糖法已不太常用,定磷法可测定磷酸 从而计算核酸的含量,定糖法通过测定核糖或脱氧核 糖可测出DNA或RNA的含量。

1.定义:
通常是指研究200-780nm光谱区域内,物质 分子或离子对光辐射吸收的一种方法,也称为吸 光光度法或分光光度法。 利用有色溶液对可见光的吸收来进行定量 测定, 称为比色法。

2. 历史
(1)公元60年,古希腊的普里尼 利用五倍子浸出液估测醋中Fe 元素的含量,直到十九世纪30-40年代,比色法逐渐成为一种普 遍的分析方法。
利用金属离子本身颜色或无机显色剂

例如:NH3使Co2+显色(目视比色法)
Cs~5s为系列标样,其颜色呈梯度变化,用肉眼比较待测液颜 色与标样颜色,选取较为接近的标样管,从而判断其浓度。

Cx Cs C 2s C 3s C 4s C5s

2. 历史
(2) 1852年 Beer定律; 1868年 布特列洛夫 1870年 杜包斯克 目视比色计? 浦氏光度计 1911年 贝格尔 硒光电池比色计 第一台分光光度计 1918年 美国国家标准局 20世纪50年代

20世纪30-40年代 E.B.Sandell“痕迹金属比色测定” 有机显色剂 近二、三十年 信息技术,高新技术,联用技术

二、实验目的与要求
1. 了解紫外分光光度计的基本原理并掌握其使用方 法。 2. 掌握使用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和 方法。

三、实验原理
?

核酸中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双键系统(—C=C—

C=C—),能够强烈吸收250-280nm波长的紫外光。核酸( DNA或RNA)的最大吸收峰在260nm波长处,不同浓度的核 酸含量其在260nm的紫外吸收不一样,因而可以从紫外吸收的 变化来测定核酸物质的含量。
?

若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的 物质,则测光误差较大,应设法事先除去。核酸和核苷酸的摩 尔吸光系数用ε(P)表示。ε(P)为每升溶液中含有1摩尔核 酸磷时的吸光度(即光密度,或光吸收)。

三、实验原理
增色效应与减色效应:
?

增色效应:不同形式DNA 紫外吸光度不同,因为DNA具有双螺 旋结构,当过量的酸、碱或加热使DNA变性,使得DNA或RNA溶 液对紫外光的吸收明显增加,即 ε值(吸光系数或称消光系数) 显著升高,此现象称为增色效应。在核苷酸量相同情况下,ε(P )260nm有以下关系:单核苷酸>单链DNA>双链DNA。

?

减色效应:在一定的条件下,变性的核酸又可以复性,此时ε(P )260nm值又明显减少,回复到原来的核酸分子ε值较低的水平, 即此时DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低,此现象称为减色 效应。

三、实验原理
蛋白质由于含有芳香氨基酸,也能吸收紫外光。蛋 白质的吸收峰在280nm波长处,在260nm处的吸光度仅为 核酸的1 /10或更低,因此核酸样品中蛋白质含量较低时 对核酸的紫外测定影响不大。 RNA的A260nm与A280nm之比在2.0以上,DNA的 A260/A280 之比为1.9左右(该比值在1.8-2.0之间表示DNA 样品较纯)。

四、实验试剂及仪器
1.试剂:
(1)1mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.0):

(2)0.5mol/L的EDTA(pH8.0)溶液 :
(3)TE缓冲液(pH8.0): (4)标准DNA溶液:100ug/ml

(5)待测DNA样品液

四、实验试剂及仪器
2.器材:
(1)UV-4802型紫外分光光度计(上海尤尼柯公司)。
(2)石英比色皿,一套2只。 (3)刻度吸管(1ml、2ml、5ml、10ml)、微量可调移 液枪及枪头、试管、试管架、烧杯、洗瓶、废液缸、 培养皿、卫生纸、擦镜纸、漩涡混合器等。

五、方法与操作步骤
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标准曲线法 标准管法 消光系数法(公式法)

五、方法与操作步骤
1.标准曲线法
(1) DNA标准曲线的制作:取7支干燥洁净试管,按下表加 入各种试剂 各管溶液在漩涡混合器上混匀,以0号试管为空白在紫外分 光光度计上测定各管260nm处的吸光度值A,以标准DNA溶 液的浓度值为横坐标,A为纵坐标拟合标准曲线。

五、方法与操作步骤
1.标准曲线法
试管 标准DNA溶液(mL) 0 0 1 0.6 2 1.2 3 1.8 4 2.4 5 3.0 6 3.6

TE缓冲液(mL)
标准DNA溶液浓度 (ug/mL)
A260

6
0

5.4
10

4.8
20

4.2
30

3.6
40

3.0
50

2.4
60

五、方法与操作步骤
1.标准曲线法
(2)未知样品的测定:

取未知样品约4mL倒入石英比色杯中,仍以0号管 为空白,在260nm处测定其吸光度值,对照计算机上 自动拟合成的标准曲线可自动求出其浓度值。

五、方法与操作步骤
2.标准管法
A测定管/A标准管=C测定管/C标准管
则C测定管= A测定管/A标准管×C标准管
任选一个浓度和未知样品接近的标准品用标准管 法进行计算,将结果和标准曲线法相对比。

五、方法与操作步骤
3.消光系数法(公式法)
(1)将样品配制成每毫升含5~50μg的核酸溶液,于紫外分光光度计上测 定 260nm的吸光度,按下式计算核酸浓度和两者的吸收比值: DNA的质量浓度(μg/mL)=A260/(0.020×L) ×稀释倍数 RNA的质量浓度(μg/mL)=A260/(0.024×L) ×稀释倍数

式中:A260 —260nm波长处的光密度读数。
L—比色杯的厚度,一般为1cm或0.5cm。 0.024— 每毫升溶液内含1.0 μg RNA的光密度值。 0.020— 每毫升溶液内含1.0 μg DNA钠盐时的光密度。

五、方法与操作步骤
3.消光系数法(公式法)
(2)如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核 苷酸,则在测定时需加钼酸铵-过氯酸沉淀剂,沉淀除去大分子核酸 ,测定上清液在260nm处的吸光度作为对照。操作如下:

取两支小离心管,A管加入0.5mL样品和0.5mL蒸馏水,B管加 入0.5mL样品和0.5mL钼酸铵-过氯酸沉淀剂,摇匀,在冰浴中放臵 30min,3 000r /min离心10min,从A、B两管中分别吸取0.4 mL上清 液到两个50 mL容量瓶内,定容至刻度。在紫外分光光度计上测定 260nm处的吸光度。

五、方法与操作步骤
3.消光系数法(公式法)
DNA(或RNA)的质量浓度=

△A260 0.020(0.024) ×L

×稀释倍数

式中:ΔA260—A管稀释液与B管稀释液在260nm波长处的吸光度值之差

核酸的质量分数=

待测液中测得的核酸质量
待测液中制品的质量

×100%

六、注意事项
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1.在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同, 紫外吸收也随之表现出明显的差异,它们的摩尔消光系数 也随之不同。所以,在测定核酸物质时均应在固定的pH 溶液中进行(如TE缓冲液)。 2.测定样品DNA含量时,内含DNA量应调整至标准曲线的 可读范围内。

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六、注意事项
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3.石英比色杯使用时需小心,避免损坏。使用完毕后先 用自来水内外冲洗干净,再用蒸馏水将比色杯内外表 面冲洗干净,将其粗糙面朝下放于培养皿中。 4.切勿将溶液洒落于分光光度计比色室内。

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七、思考题
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1.使用紫外分光光度计时应该注意什么?

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2.使用比色皿时有何注意事项?
3.紫外吸收法如何测定核酸含量? 4.如果测定核酸含量时,样品中混有大量的核苷酸 或蛋白质等吸收紫外光的物质,是否需要处理?

实验六
全血基因组DNA的提取 ——离心柱形试剂盒提取

内容提要
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实验原理 试剂与器材 操作步骤 注意事项

一、实验原理
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DNA是所有生物体的基本组成物质,真核生物DNA主要 存在于细胞核中,以核蛋白的形式存在,因此制备DNA必须 先粉碎组织,裂解细胞膜和核膜,核蛋白方能释放出来。再 除去蛋白质、脂类、糖类和RNA等物质,得到纯化的DNA。 其原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净,又要 保持DNA分子的完整性。 在提取DNA的反应体系中,SDS(十二烷基硫酸钠)破 坏细胞膜和核膜(溶解膜蛋白),使蛋白质变性,将核蛋白 中的DNA与蛋白质分开,并抑制细胞中的DNase的活性。蛋 白酶K可降解所有的蛋白,抑制DNase的降解作用,使DNA分 子尽量完整地分离出来。

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一、实验原理
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在本实验中,独特的结合液CB和蛋白酶K能迅速 裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高 离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通 过一系列快速的漂洗-离心的步骤,抑制物去除液和漂 洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的洗 脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱下来。 提取出的DNA制品可进一步加以鉴定。 DNA提取可用于基因诱变、DNA克隆及DNA测序 、PCR扩增等。

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二、试剂与器材
1.试剂: 全血DNA提取试剂盒(北京百泰克公司);抗 凝剂ACD。 2.器材: 高速离心机、冰箱、高压灭菌锅、水浴锅、移 液枪、Eppendorf管等。

三、操作步骤
1.取200ul新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液,放入1.5mL离心管 (如果全血起始量小于200uL,则用缓冲液BB补足至200ul;如果 起始量介于200~300ul之间,则后操作需要按照比例增加试剂用量 ;如果起始量介于300ul~1ml之间,则需要先进行红细胞裂解操作 )。 溶血:红细胞破裂,血红蛋白逸出称红细胞溶解,简称溶血。可 由多种理化因素和毒素引起。在体外,如低渗溶液、机械性强力 振荡、突然低温冷冻(-20℃~-25℃)或突然化冻、过酸或过碱, 以及酒精、乙醚、皂碱、胆碱盐等均可引起溶血。 2.加入200ul结合液CB,立刻剧烈颠倒轻摇,充分混匀,再加入20 ul蛋白酶K(20mg/ml),颠倒轻摇充分混匀,70℃放臵10分钟, 每隔2 分钟颠倒混匀几次,之后溶液应变清亮,颜色偏黑色。

血清、全血及血浆的区别★
全血:血液经抗凝处理后的全部血液为全血。 血浆:抗凝血离心除去血细胞后所得到的淡黄色液 体为血浆。 血清:如血液不经抗凝处理,让其自行凝固,则在 抽血后的一段时间内,血液会自动在一系列凝血因 子的作用下发生凝集,血液首先凝固成一个整体, 再经过一段时间或用离心机离心,血液中凝固的部 分会与一些清澈淡黄色的液体分离开,这些液体称 为血清。

三、操作步骤
3.加入100ul异丙醇,剧烈颠倒轻摇,充分混匀,此时可 能会出现絮状沉淀。上述操作步骤中适当力度混匀非常 重要,混匀不充分严重降低产量,必要时如样品粘稠不 易混匀时可以旋涡振荡15秒混匀,但不可剧烈振荡,以 免剪切DNA,之后4℃冷却5-10min。 4.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中 ,(吸附柱放入收集管中),10000rpm离心30秒,倒掉 收集管中的废液。

三、操作步骤
5.加入500ul抑制物去除液IR,12000rmp离心30秒,弃废 液。

6.加入700ul漂洗液WB,12000rmp离心30秒,弃废液。
7.加入500ul漂洗液WB,12000rmp离心30秒,弃废液。 8.将吸附柱AC放回空收集管中,13000rmp离心2分钟, 尽量去除漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反 应。

三、操作步骤
9.取出吸附柱AC,放入一个干净的1.5ml Eppendorf管中 ,在吸附膜的中间部位加100ul洗脱缓冲液EB洗脱(缓 冲液事先在65-70℃水浴中预热),室温放臵3-5分钟, 12000rmp离心1分钟。收集离心得到的液体,将所得 的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放臵2分钟, 12000 rmp离心1分钟,得到DNA溶液。 10.取部分DNA用琼脂糖凝胶电泳鉴定。其余DNA溶液可 以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放臵在-20℃ 。

四、注意事项
1.异丙醇、漂洗液WB 、抑制物去除液IR 实验前应置于 4℃冰箱。

2.洗脱缓冲液EB使用前应置于70℃水浴锅中预温。
3.转移DNA时不要用枪头反复吹吸,混匀不可太剧烈, 处理前须将血液标本恢复至室温。

实验七
PCR扩增基因

染色质、染色体、DNA和基因的概念 及其之间的关系? ★
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?

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染色质:在细胞核中,有一种易被碱性染料染上颜色的物质, 叫做染色质。 染色体:染色体是由DNA和蛋白质组成的,一般存在于细胞核 中,是DNA的载体。,染色体只是染色质的另外一种形态。它 们的组成成分是一样的。 DNA:脱氧核糖核酸,DNA和蛋白质组成染色质。 基因:带有遗传信息的DNA片段称为基因,基因在DNA上。 染色体和染色质是同种物质在不同时期的两种表现形式,一般 细胞核中是以细丝状的染色质状态存在的,在细胞有丝分裂前 期染色质高度螺旋化变粗变短,成为染色体。基因是DNA上具 有遗传效应的片段,DNA的基因呈线性排列,有的片段有遗传 效应,有的没有,而具有遗传效应的DNA片段才叫基因。基因 在DNA上,DNA在染色体上 。

内容提要
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实验目的
实验原理

试剂与器材
操作步骤

PCR常见问题和解决办法

一、实验目的
? ? ?

了解PCR概念 掌握PCR反应的基本原理 掌握PCR反应的实验技术

二、实验原理
体内DNA的复制
5? 3’ 5’

3’

二、实验原理
DNA的变性和复性
?

加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离, 形成单链DNA,这称为 DNA的变性。

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解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原 有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。

二、实验原理
PCR (Polymerase Chain Reaction),即聚合酶链 反应,是一种体外基因扩增技术,是在引物和四种脱氧 核苷三磷酸存在下,利用DNA 聚合酶反复作用,使微 量的特定片段得以大量扩增的反应过程。

Tm值:Tm值就是DNA熔解温度,指把DNA的 双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA, Tm值不同。DNA中G-C含量越高,Tm值越高,成 正比关系。

二、实验原理
PCR所需的条件:
①模板 ②引物(决定扩增产物的特异性)

PCR反应中,所设计引物的长度一 般为15~30个核苷酸


dNTPs
④ Taq聚合酶 ⑤

Mg2+

二、实验原理
PCR反应过程:

每三步为一个循环,每循环一次,使模板DNA拷贝数增加1倍,理论上讲 ,30个循环后,扩增产物为230拷贝。

本次实验中的变性、退火和延伸温度分别为 94℃、55 ℃ 和72 ℃

三、试剂及器材
1、试剂
(1)10× reaction buffer:500mmol/L KCl, 100mmol/L TrisHCl(pH8.3),0.1%明胶等。 (2)MgCl2溶液:25mmol/L (3)dNTPs:2.5mmol/L dATP,2.5mmol/L dCTP,2.5mmol/L dGTP,2.5mmol/L dTTP。

(4)Taq酶(5U/ul)
(5)DNA模板

三、试剂及器材
1、试剂
(6)引物溶液(10umol/L):包括Forwand Primer和Reverse Primer两种。 (7) 50×TAE缓冲液:称取Tris碱242g,量取57.1ml冰醋酸及 200ml0.5mol/L的EDTA溶液,用蒸馏水加至1L。 (8)1×TAE缓冲液(pH8.1):将50×TAE缓冲液用蒸馏水稀 释50倍。用作电泳缓冲液及配制琼脂糖凝胶。 (9)6×凝胶加样缓冲液(6×loading buffer):0.25%溴酚蓝, 40%甘油,ddH2O。

三、试剂及器材
2、器材
PCR仪; 琼脂糖凝胶电泳系统

四、操作步骤
1、在0.2mlEppendorf管内配制25ul反应体系:
反应物
ddH2O 10×PCR缓冲液 2.5mmol/L dNTP 25mmol/L MgCl2 引物1 引物2 模板DNA Tag酶

体积(ul)
18.5 2.5 0.5 1 0.5 0.5 1 0.5

旋涡混合器混合,短暂离心之后将样品放入PCR仪。

四、操作步骤
2、按下述程序进行扩增
(1)94℃预变性4min。 (2)94℃变性40s。 (3)50.5℃退火40s。 (4)72℃延伸40s。 (5)重复步骤(2)—(4)30次。 (6)72℃延伸10min。

3、琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物

五、PCR常见问题和解决办法
1.出现假阴性
?

可能原因
①模板 模板中蛋白质没有去除干净 模板中含有Taq酶抑制剂 模板在制备过程中丢失过多 ②反应体系 酶的活性低 引物设计不合理及浓度过低 Mg2+浓度过低 ③循环参数设臵 变性温度过低,时间过短或退火温度过高

五、PCR常见问题和解决办法
1.出现假阴性
?

解决办法
①保证模板的数量及质量 ②选择高质量的酶,尽量减少运输时间; 合理设计引物,摸索出最佳的引物浓度和Mg2+浓度 ③提高变性温度,延长变性时间,降低退火温度

五、PCR常见问题和解决办法
2.出现非特异性扩增带
?

可能原因
① Mg2+浓度过高 ② 引物设计不合理 ③ 退火温度过低 ④ 酶量过多

五、PCR常见问题和解决办法
2.出现非特异性扩增带
?

解决办法
① 降低Mg2+浓度 ② 合理设计引物 ③ 提高退火温度 ④ 降底酶量

五、PCR常见问题和解决办法
3.出现片状拖带
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可能原因 模板量相对过少

?

解决办法 增加摸板量

实验八
琼脂糖凝胶电泳鉴DNA

内容提要
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前言

?
?

实验原理
试剂与器材

?
?

操作步骤
注意事项

一、前言
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1937年,瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪,建 立了移界电泳法,并于1948年荣获诺贝尔奖。70年代以来,电 泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节,不断改进,以实 现下列目标: 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作,缩短电泳时间。

3、扩大应用范围。
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各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域

二、实验原理
电泳:是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷 的电极移动的现象。
电泳技术具有以下特点:
①凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或 定量分析; ②样品用量极少; ③设备简单; ④可在常温进行; ⑤操作简便省时; ⑥分辨率高。

二、实验原理
本实验采用琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA。琼脂糖凝胶电泳是 用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
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琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂糖束→大网孔型凝胶 ——分离、 鉴定、纯化DNA 影响DNA迁移率的因素: DNA分子的大小、构象,凝胶浓度,电压,电泳缓冲液的组成

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?
?

缓冲液pH>DNA Pi,DNA带负电荷,迁移率与分子量对数成反比
DNA分子构象影响迁移率:共价闭环DNA>线状DNA>开环DNA

二、实验原理
? 葡聚糖浓度(%) 不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围 0.3 0.6 0.7
0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3

分离范围(kb)

5-60

1-20

0.8-10

?

凝胶浓度与被分离DNA样品的相对分子质量成反比关系,一般 常用的凝胶浓度为1%~2%。 电泳时,用溴酚蓝示踪DNA样品在凝胶中所处的位臵,但每种 DNA样品所处的准确位臵需要用新型核酸染料GoldView对 DNA分子进行染色才能确定。在紫外光的激发下发出绿色荧光 。

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二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳具有下列优点:
(1)琼脂糖含液体量大,可达98~99%,近似自由电泳,但是样品 的扩散度比自由电泳小,对蛋白质的吸附极微。

(2)琼脂糖作为支持物有均匀,区带整齐,分辨率高,重复性好等 优点。
(3)电泳速度快。

(4)透明而不吸收紫外线,可以直接用紫外检测仪作检测。
(5)区带易染色,样品易回收,有利于制备。

琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、 使用方法、适用范围以及它们的相同和不同之处。
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琼脂糖凝胶电泳原理:琼脂糖是从琼脂中提纯出来的,主要是 由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼 脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中,通常使用的 浓度是1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清,注入模板后室温 下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中 作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形 成较为稳定的交联结构,这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好 的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度 来控制。低浓度的琼脂糖形成较大的孔径。而高浓度的琼脂糖 形成较小的孔径。琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支 持介质,尤其适合于核酸的提纯、分析。

琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、 使用方法、适用范围以及它们的相同和不同之处。
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聚丙烯酰胺凝胶电泳原理:聚丙烯酰胺凝胶电泳简称 为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)是以聚 丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单 体 的 丙 烯 酰 胺 ( Acrylamide )和 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 ( N,N?- methylenebisacrylamide)聚合而成,这一聚合 过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有 两种,化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化 剂 过 硫 酸 铵 ( AP ) 以 及 加 速 剂 四 甲 基 乙 二 胺 ( TEMED)催化过硫酸铵产生自由基。聚丙烯酰胺凝胶 电泳普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖 凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型,大分子核 酸等应用较广。

琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、使 用方法、适用范围以及它们的相同和不同之处。 ★
琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别: 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔 隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度 琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼 脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 聚丙烯酰胺分离小片段DNA 5-500bp效果较好,其分辩 力极高,甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝 胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比 琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电 泳。
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三、试剂与器材
1、试剂:
(1)50×TAE缓冲液:称取Tris碱242g,量取57.1ml冰醋酸及200 ml 0.5 mol/L的EDTA溶液,用蒸馏水加至1L。 Tris(Tris base/三羟甲基氨基甲烷)、acetic acid(乙酸)、EDTA(乙二 胺四乙酸二钠)

(2)1×TAE缓冲液(pH8.1):将50×TAE缓冲液用蒸馏水稀释50倍。 用作电泳缓冲液和配制琼脂糖凝胶。
(3)1%的琼脂糖溶液:称取1g琼脂糖,加入100ml1×TAE缓冲液,微 波炉加热熔化。 (4)核酸染料GoldView(北京赛百盛基因技术有限公司)。 (5)6×loading buffer(含溴酚蓝和二甲苯氰FF)。 (6)DNA marker——DL 2000 Marker(Trans 2K DNA Marker)。

三、试剂与器材
2、器材:
电泳仪(Bio-Rad公司);
电泳槽(北京六一)。

四、实验步骤
1.配制足量的电泳缓冲液(1×TAE或0.5×TBE)用以灌满电泳 槽和配制琼脂糖凝胶。 2.根据欲分离DNA片段大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶 液:应准确称量琼脂糖干粉加到三角烧瓶中。(配制1%的琼 脂糖溶液100ml)。 3.用牛皮纸松松地盖住三角烧瓶口,在沸水浴或微波炉(火力40 ,时间:新胶5分钟,旧胶3分钟)内加热至琼脂糖熔化。

四、实验步骤
4.待熔化的凝胶稍冷却后(不烫手)加入3ul GoldView核酸染料 。轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液。

5.琼脂糖溶液正在冷却时,用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿 的位臵应在托盘底面上0.5-1.0mm,这样琼脂糖浇灌到托盘时 将形成符合要求的加样孔。 6.浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。

四、实验步骤
7.让凝胶溶液完全凝结(室温下30-45min)。加少量电泳缓冲液 于凝胶顶部,小心拔出梳子。倒出电泳缓冲液,将凝胶安放到 电泳槽内。 8.向电泳槽加入电泳缓冲液,刚好没过凝胶约1mm。 9.取出DNA溶液5ul并加1ul 的6×loading buffer(凝胶加样缓冲液 ),混匀。

四、实验步骤
10.用微量移液器及一次性吸头将样品混合液(5ulDNA提取液 +1ul6×loading buffer)缓加至凝胶的加样孔内。DNA marker 加至样品孔最左侧的一个孔内。 11.关上电泳槽盖,接好电极插头。DNA应向阳极(红色插头)侧 泳动。给予1-5V/cm的电压,其中距离以阳极至阴极之间的测 量为准(电压调至130v左右)。如电极插头连接正确,阳极和 阴极由于电解作用将产生气泡,并且几分钟内溴酚蓝从加样孔 迁移进入胶体内。待溴酚蓝和二甲苯氰FF迁移到适当距离( 胶的中部)后再停止电泳。

四、实验步骤
12.当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时,关上 电源,拔出电极插头和打开电泳槽盖。紫外灯(凝胶 成像系统)下观察结果,拍照。

五、注意事项
1.缓冲系统:在没有离子存在时,电导率最小,DNA不 迁移,或迁移极慢,在高离子强度的缓冲液中,电导很 高并产热,可能导致DNA变性,因此应注意缓冲液的使 用是否正确。长时间高压电泳时,常更新缓冲液或在两 槽间进行缓冲液的循环是可取的。 2. 琼脂糖:不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂质含量 不同,影响DNA的迁移及荧光背景的强度,应有选择地 使用。

五、注意事项
3. 凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,溶解的 凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应 避免出现气泡,影响电泳结果。 4. 样品加入量:一般情况下,0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量, 加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定 ,过多的量会造成加样孔超载,从而导致拖尾和弥散,对于较大 的DNA此现象更明显。 5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移,加入DNA标准参照物进行判 定是必要的。

五、注意事项
6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品应使用同样的 缓冲条件以消除这种影响。 7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度,迁移分子的形状及大小。采用 不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可 根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用 聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。

实验九
凝胶层析法分离血红蛋白 和胰岛素

内容提要
? ? ? ? ? ?

实验目的
实验原理

试剂及器材
操作步骤

注意事项
附录:凝胶的洗涤及保存

一、实验目的
? 掌握凝胶层析的基本原理
? 学习利用凝胶层析法分离血红蛋白和胰

岛素的实验技能

二、实验原理
定义:
凝胶层析又称为凝胶过滤、分子筛层析、凝胶 渗透层析等。主要根据混合物中分子的大小和形 状不同 ,在通过凝胶时,分子的扩散速率各异而 达到分离目的的技术。

二、实验原理
凝胶颗粒具有多孔性网状结构,小分子易进入凝胶网孔,流 程长而移动速度慢,而大分子物质不能进入凝胶网孔,沿凝胶颗 粒间隙流动,流程短移动快。这种现象称为分子筛效应。被分离 物质可按分子的大小不同分开。

二、实验原理
用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品, 主要有葡聚糖(商品名为Sephadex)、琼脂糖( 商品名为Sepharose)、聚丙烯酰胺凝胶(商品名 为Bio-gel)及具有一定网眼的细玻璃珠等及这些 凝胶的衍生物。

二、实验原理
本实验主要介绍葡聚糖凝胶,这是由葡萄糖的多聚物与 1-氯-2、3-环氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状 的多聚葡萄糖单位交联起来,凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的 分子和环氧丙烷的比例(交联度)来控制。

带网孔的葡聚糖凝胶珠三维空间结构

带网孔的葡聚糖凝胶珠内部三维空间结构

二、实验原理
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内

大分子不 能进入珠 内,经珠 之间隙流 出

凝胶层析过滤过程示意图

二、实验原理
葡聚糖具有较强的亲水性,其吸水能力与葡聚糖凝胶的交 联度有密切关系。交联度大的,孔径小,吸水少,膨胀的程度 小,反之亦然。 葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示,常以 G-10至G-200号码标记。G后面的数字是其吸水量(毫升水/克 干胶)乘以10所得的值。G-75以上的胶因吸水量大,膨胀后形 态柔软易变,统称为软胶。G-75以下的称为硬胶。

三、试剂及器材
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试剂

1.葡聚糖凝胶:Sephadex G-75
2. 1 mol/L的Na2HPO4储备液

3. 洗脱液:0.1mol/L,pH6.8磷酸盐缓冲液——流动相。
层析流动相:在层析过程中,推动固定相上待分离的物质朝着一个 方向移动的液体、气体或超临界体等都称为流动相。在柱层析时, 流动相又称洗脱剂(液);在纸层析和薄层层析时,流动相又称展 层剂。 4. 待分离样品:胰岛素、血红蛋白。

三、试剂及器材
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器材

运送系统——恒流泵 核酸蛋白检测仪 检测系统 电脑采集器 电脑及相关软件

收集系统——自动部分收集器

四、操作步骤
1.凝胶的处理(由实验室准备) 2.装柱 3.平衡 4.上样和洗脱 5.收集样品

五、注意事项
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凝胶悬液尽量一次加完,以免出现不均匀或分层的凝胶带。如表 层凝胶凸凹不平或胶床出现分层及纹路等毛病,可用玻棒轻轻搅 动,让凝胶自然沉降,使表面平整。

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刚从冰箱中取出的凝胶液,不能马上用来灌柱,应平衡至室温后 再用,不然装好的凝胶会产生大量的气泡影响层析。
在整个灌注凝胶的过程及使用中,凝胶柱面上一定要覆盖着一层 溶液,以免进入空气。若进空气再加入溶液时,凝胶柱中易形成 气泡。 注意胶床表面始终要保留一层薄的液体,否则空气容易进入而使 胶床开裂。

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六、附录:凝胶的洗涤及保存
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由于凝胶对被分离的物质基本无吸附作用,所 以无需“再生”,只要用洗脱液冲洗后即可连续使 用。但因多次使用凝胶颗粒将逐渐沉积压紧,流速

将减慢,所以使用一段时间后应倒出来,清洗后重
新装柱。

六、附录:凝胶的洗涤及保存
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凝胶暂时不使用可浸泡在溶液中,存放在4℃冰箱 中。若放在室温保存应加入0.02%叠氮钠(NaN3)或

0.01%乙酸汞等防腐剂,以防发霉。用时以水洗去防腐
剂即可使用。

六、附录:凝胶的洗涤及保存
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凝胶长期不用,可用水洗净,分次加入百分浓度

递增的乙醇溶液,每次停留一段时间,使之平衡,再
换一下浓度的乙醇,让凝胶逐步脱水,再用乙醚除乙 醇,抽干即可。或将凝胶洗净后抽干,在表面皿上 30℃逐步烘干。

考试题型
1. 单项选择题

2. 填空题
3. 判断题

4. 名词解释
5. 问答题

6. 计算题


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