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生物竞赛资料


建议实验一、死活细胞的鉴定
一、实验原理
死活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况,需要经常测定细胞的存活率;在肿瘤细胞的研究中,为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力,也需要测定肿瘤细胞的存活率。在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用,例如为了检测某一男子的生育能力,测定精子细胞的存活力是比较常用的办法。精子存

活率以“活”精子比率表示,若不活动的精子较多,应体外活体染色检查,以鉴别其死活。活精子的细胞膜能阻止伊红Y、台盼蓝等染色剂进入细胞内,故不被染色;死精子细胞膜完整性受损。失去屏障功能,可被染色成橘红或蓝色,有生育力男性伊红染色法的活精子率≥75%。
死活细胞的鉴定方法有很多种,常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法,简便,易于操作。但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活,实验结果很容易受操作者的主观因素的影响,存在一定的误差,所以,在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。
不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理,但无论采用何种办法,都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。常用的方法包括染色法和仪器分析法。
死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括:
死活细胞细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜是一种选择透性膜,对细胞起保护和屏障作用,只允许物质选择性的通过;而细胞死亡之后,细胞膜受损,通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝,又称锥蓝,是一种阴离子型染料,不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色,而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。
死活细胞在代谢上的差异:是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料,氧化型为蓝色,还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用,使细胞内9能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型,因此美蓝染色后活的酵母细胞无色;而死细胞或代谢缓慢的老细胞,则因它们的无还原能力或还原能力极弱,使美蓝处于氧化态,从而被染成蓝色或淡蓝色。
中性红是一种低毒性染料,为常用的活体染料之一,可以使活细胞液泡着红色,而细胞质和细胞核不被着色;死细胞的液泡不被着色或浅染,染料弥散于整个细胞中,细胞核和细胞质被染成红色。中性红是一种弱碱性 pH 指示剂,变色范围 pH6.4~8.0 之间(由红变黄)。在中性或微碱性环境中,植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌,由于液泡在一般情况下呈酸性反应,因此,进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色,在这种情况下,原生质和细胞壁一般不着色;死细胞由于原生质变性凝固,细胞液不能维持在液泡内,因此,用中性红染色后,不产生液泡着色现象,相反,中性红的阳离子,却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合,而使原生质与细胞核染色。
二、实验目的
掌握死活细胞鉴定的原理和常用方法。
三、实验材料与仪器
1、实验材料:洋葱表皮,酵母,口腔上皮细胞
2、实验仪器:载玻片、盖玻片、普通光学显微镜
四、试剂配制方法
1.0.4%台盼蓝染液:称取4g台盼蓝,加少量蒸馏水研磨,加双蒸水至100ml,用滤纸过滤,4度保存,此为4%台盼蓝母液。使用时,取1ml母液,用9ml PBS稀释至0.4%,即可。
2.1/3000中性红染液:取0.1g中性红于10ml Ringer溶液中,稍加热(30-40摄氏度)使溶解,用滤纸过滤,装入棕色试剂瓶,暗处保存,否则易被氧化,失去染色能力,此为母液。1/3000中性红溶液(用时现配),取母液1ml,加入29ml Ringer溶液,即成。
3.0.1%吕氏碱性美蓝染液:0.3g美蓝溶于30ml 95%酒精中制成30ml美蓝酒精饱和液。取0.1g氢氧化钾定容于1L容量瓶中制成0.1g/L氢氧化钾溶液。用时将30ml美蓝酒精饱和液与100ml 0.1g/L的氢氧化钾溶液混合摇匀即可。
4. PBS溶液:在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,用HCl调节溶液的pH值至7.4加水定容至1L,在15lbf/in2(1034*105Pa)高压下蒸汽灭菌20min。保存于室温。
5. Ringer溶液:在100mL蒸馏水中分别溶解NaCl 0.85g,KCl 0.25g和CaCl2 0.03g。
五、实验前准备
主要仪器:普通光学显微镜(25台/班,1台/组)
辅助仪器:镊子25把/班,1把/组;载玻片250个/班,10个/组;盖玻片300个/班,12个/组
耗材:擦镜纸、吸水纸(各25包/班,各1包/组)
药品试剂:0.4%台盼蓝、0.1%中性红、1%中性红、1%甲基蓝、1%中性红-甲基蓝、浓蔗糖溶液均为2.5ml/班,0.1ml/组
六、实验方法及步骤
1、材料的处理:取洋葱鳞茎内表皮细胞或人的口腔粘膜上皮细胞,室温放置30min以上。
2、死活细胞的鉴定
(1)台盼蓝法
取洋葱鳞茎内表皮细胞(新鲜与放置后的材料),用0.4%的台盼蓝染液染1~2min,封片观察。注意比较放置材料和新鲜制备材料染色效果是否存在差异,二者在死活细胞比率上有无区别。
以人的口腔黏膜上皮细胞重复同样的操作。
(2)中性红法
取洋葱鳞茎内表皮细胞(新鲜与放置后的材料),用1/3000的中性红染液染5min,封片观察、比较。对两类材料染色后,于盖片的一侧滴加浓蔗糖溶液,在另一侧用吸水纸吸,5分钟后观察比较染色效果是否发生变化。
(3)美蓝法
取酵母细胞(新鲜与放置后的材料),用0.1%吕氏碱性美蓝染液染2min,封片观察、比较。
七、实验结果与分析

图1 洋葱表皮-台盼蓝法 图2口腔上皮细胞-台盼蓝法

图3洋葱表皮-中性红法 图4酵母细胞-美蓝法
分析:
1.台盼蓝法染色鉴定中,蓝色的为死细胞,不被染色的为活细胞。
2.中性红染色法鉴定中,活细胞只有液泡着色,而死细胞则是细胞核和细胞质均被染成红色,由于洋葱表皮有大液泡,故而质壁分离处理后,效果更为明显。
3.美蓝染色法中,活细胞为无色,死细胞为蓝色。
八、注意事项及改进
1.洋葱表皮细胞材料的放置:糙面向上,以利于与染液的均匀接触。
2.取口腔粘膜上皮细胞前要漱口,同时注意刮取的部位。材料要涂抹均匀在载玻片上。
3.注意比较死、活细胞染色效果的不同,不同材料(新鲜与放置后)的死活细胞的比率。
4.质壁分离的目的是为了观察中性红对液泡专一染色的效果(液泡太大,充斥整个细胞质空间,似乎是整个细胞都着色了)。
5.台盼蓝染洋葱表皮时,要洗去浮色。
6.中性红染色时间要5min左右,时间过短,不易着色。
九、问题与讨论
1、染色法是一种便捷的鉴定死活细胞的常用的方法,它通常利用了死活细胞哪两个性质上的差异?
答:一是利用了死活细胞膜通透性的差异,二是利用了死活细胞新陈代谢的差异。
2、中性红用于死活细胞鉴定的原理是什么?
答:利用的是中性红可以使活细胞的液泡着色,而原生质和细胞核不被着色;死细胞则是细胞核和原生质都被着色,不产生液泡着色现象。
3、三种染色法是否都需要洗去浮色?
答:台盼蓝染色法需要洗去浮色,而中性红和美蓝法染色后不需要洗去浮色,可以直接进行观察。
4、在空气中放置一段时间的洋葱内表皮细胞经中性红染色后会发现几乎每个细胞中都有一个被染成红色的细胞核,而新鲜的洋葱内表皮细胞经同样的方法染色后却很少在细胞中观察到细胞核,即使偶尔观察到也不着色。这种现象说明了什么问题?
答:说明在空气中放置了一段时间以后的洋葱表皮细胞死细胞比率增加。
5、假如将染色时间延长,对实验结果的判断是否影响,为什么?
答:会有影响,时间过长会造成死细胞的数量增加,使观察到的现象偏离事实。
十、建议课时安排
实验完成需要50min,建议1.5个课时。
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细胞建议实验二 细胞的凝集反应实验
一、实验原理
红细胞凝集包括由病毒、细胞凝集素和抗体而引起的三种类型的细胞凝集现象。凝集素(lectin)是从各种植物的种子和动物组织中提取的糖蛋白或结合糖蛋白,因为能凝集红细胞,故名凝集素。
凝集素最大的特点是能识别糖蛋白和糖脂中,特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构,即细胞表面的糖基。通过与细胞表面的糖分子相连,在细胞间形成桥,从而引起细胞的凝集。一种凝集素只对某一种特异的糖基具有特异结合的能力,如刀豆素A与吡喃糖基甘露糖结合,马铃薯凝集素专一结合的是N-乙酰氨基葡萄糖二聚体和N-乙酰氨基半乳糖。加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集作用。
另外,凝集素还具有多价结合的能力,能与荧光素、酶生物素、铁蛋白、胶体金结合而不影响其生物活性,可用于光镜或电镜水平的免疫细胞化学研究。
二、实验目的
1、理解细胞凝集的原理。
2、显微镜下观察细胞凝集反应。
三、实验用品
1、器材和仪器
仪器:电子天平,大烧杯,小烧杯,显微镜,移液器,离心机,玻璃棒,镊子。
耗材:10ml小试剂瓶,载玻片,盖玻片,1.5ml离心管,擦镜纸,吸头(蓝、黄)。
2、试剂:PBS缓冲液,3.8%的柠檬酸钠,生理盐水,
3、材料:鸡血,土豆。
四、实验前准备
主要仪器:普通光学显微镜(1台/组,共25台/班);离心机(1台/班);电子天平(1台/组,共5台/班);移液器(1套/组,25套/班)。
辅助仪器:镊子(1把/组,25把/班);玻璃棒(1根/组,25根/班);100mL烧杯(1个/组,共25个/班);大烧杯(1个/组,共25个/班)。
耗材:10ml小试剂瓶(1个/组,25个/班),载玻片(3片/组,75片/班),盖玻片(若干),1.5ml离心管(1个/组,25个/班),吸头(蓝黄吸头各1盒/组,各25盒/班),擦镜纸(若干)。
试剂:PBS缓冲液(10ml/组,250ml/班),3.8%柠檬酸钠溶液(5ml/班),生理盐水(13~15ml/组,375ml/班)
备注:
PBS缓冲液:称取7.2g NaCl ,1.48g NaH2PO4 ,0.46g KH2PO4 ,用蒸馏水定容至1000ml,调pH为7.2。
生理盐水:称取0.9g NaCl加水定容至100ml。
3.8%柠檬酸钠溶液:称取3.8g柠檬酸钠(或是4.33g带结晶水的柠檬酸钠)加水定容至100ml。
五、实验方法及步骤
1、凝集素的制备:用1/100电子天平称取2g去皮土豆块茎,加10ml PBS缓冲液在烧杯中浸泡2h,粗提液中即含有土豆凝集素。
2、2%鸡血红细胞的制备
① 用烧杯取5ml 3.8%的柠檬酸钠溶液,取一只鸡的鸡血于烧杯中,不断轻轻搅拌防止血凝。(注:一只鸡的血大约50ml左右,按10%的用量加入3.8%的柠檬酸钠。)
② 用1.5ml的离心管取血液1ml,2000rpm离心5min,用移液器轻轻吸取上清去除;加入1ml生理盐水清洗红细胞,2000rpm离心5min,重复洗2—3次(注:从离心机内拿出离心管时切勿震荡,不要倾倒离心管倒上清,以免红细胞流出。清洗红细胞时用移液器缓缓抽打,防止红细胞破裂)。
③ 在小试剂瓶中加入9.8ml生理盐水,用移液器吸取200μl血红细胞加入小试剂瓶中,混匀,即是2%的红细胞悬液,贴上标签备用(注:吸取红细胞加入试剂瓶时可吸取生理盐水清洗几次吸头,使得红细胞全部在悬液中)。
3、凝集反应现象
用移液器吸取红细胞悬液,在三片载玻片上各滴一滴,其中一片加一滴土豆凝集素,一片再加一滴PBS缓冲液,充分混匀,另外一片只有红细胞悬液做空白对照,盖上盖玻片,待干后于显微镜下观察血细胞凝集现象(注:红细胞悬液放置一段时间会发生沉降,取用之前应当轻轻摇匀)。
六、实验结果与分析
1、肉眼观察实验结果

图1 左边是血红细胞加PBS缓冲液;中间是血细胞加凝集素;右边是血红细胞悬液
如图1所示,加土豆凝集素的血红细胞在肉眼下明显可以看到红细胞发生凝集,未加土豆凝集素的红细胞则没有变化,加入PBS缓冲液的红细胞可以保存时间较长。
2、显微镜下观察实验结果

图2 红细胞未发生凝集

图3 加入土豆凝集素红细胞发生凝集
显微镜下观察到红细胞是分散的,如图2所示;加入土豆凝集素后红细胞就发生凝集,由于许多的红细胞凝集,重叠一起使得颜色变得更深,如图3所示。
七、注意事项及改进
1、离心机使用时,要将配平后的离心管对称放置在离心机内,禁止未配平就放入离心机和非对称放置离心管。
2、从离心机内拿出离心管时切勿震荡,不要倾倒离心管倒上清,以免红细胞流出。清洗红细胞时用移液器缓缓抽打,防止红细胞破裂。
3、红细胞悬液放置一段时间会发生沉降,取用之前应当轻轻摇匀。
4、红细胞长时间放置后,滴在载玻片上干了细胞容易破裂,会影响实验的观察,所以红细胞应改当天制备使用。
八、建议课时安排
建议课时:2小时
九、回答问题
1、Lectin所介导的红细胞的凝集反应与同种组织细胞间的粘连反应有何异同?
答:不同点:红细胞凝集反应是自由分布的红细胞加入凝集素后,许多红细胞被聚集在一起;细胞粘连是红细胞本身表面具有粘连蛋白导致红细胞粘接连在一起。
相同点:都是红细胞聚集在了一起。
2、绘制细胞凝集原理图?
答:(图略)
3、大豆中有没有凝集素?食用时如何去除?
答:大豆中也含有凝集素,植物凝集素为一种蛋白质,加热即被破坏。食用时要加热到100°C以上充分煮熟煮透去除大豆中的凝集素,以防止食物中毒。
4、植物凝集素中毒的原理是什么?
答:植物中含有的凝集素,对胃肠黏膜有较强的刺激作用,并对血红细胞有凝集作用。

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细胞建议实验三 细胞膜的渗透性实验
一、实验原理
红细胞放置在几种等渗溶液中,根据红细胞对各种溶质的透性不同,有的溶质可进入,有的溶质不能进入,进入红细胞的溶质能提高红细胞的渗透压,使水进入红细胞,引起溶血。
由于溶质透入速度不同,溶血时间也不同。
二、实验目的
了解细胞膜的渗透性及各物质进入细胞的速度。
三、实验用品
1、器材:移液器,烧杯,试管,试管架;
2、试剂:阿氏液(或3.8%柠檬酸钠溶液),0.17mol/L氯化钠,0.17mol/L氯化铵,0.17mol/L硝酸钠,0.12mol/L草酸铵,0.12mol/L硫酸钠,0.32mol/L葡萄糖,0.32mol/L乙醇,0.9%生理盐水。
3、材料:鸡血。
四、实验前准备
器材:移液器(1套/组,25套/班),烧杯(1个/班,25个/组),试管(10支/组,250支/班),试管架(1个/组,25个/班)。
试剂:阿氏液(5ml/组,125ml/班),0.17mol/L氯化钠,0.17mol/L氯化铵,0.17mol/L硝酸钠,0.12mol/L草酸铵,0.12mol/L硫酸钠,0.32mol/L葡萄糖,0.32mol/L乙醇,生理盐水(各5ml/组,各125ml/班),鸡血悬液(5ml/组,125ml/班)。
备注:
阿氏液:葡萄糖2.02g,氯化钠0.42g,柠檬酸钠0.80g,柠檬酸0.055g,蒸馏水加到100ml,灭菌。
生理盐水:称取0.9g NaCl加水定容至100ml。
0.17mol/L氯化钠:称取0.9928g氯化钠加水定容至100ml;
0.17mol/L氯化铵:称取0.9095g氯化铵加水定容至100ml;
0.17mol/L硝酸钠:称取1.445g硝酸钠加水定容至100ml;
0.12mol/L草酸铵:称取1.488g草酸铵钠加水定容至100ml;
0.12mol/L硫酸钠:称取1.7045g硫酸钠加水定容至100ml;
0.32mol/L葡萄糖:称取5.76g葡萄糖加水定容至100ml;
0.32mol/L乙醇:称取1.474g乙醇加水定容至100ml。
五、实验方法及步骤
1、3%鸡血红细胞的制备:
① 取5ml 3.8%的柠檬酸钠溶液(阿氏液)放在烧杯中,再取一只鸡的鸡血于烧杯中,不断轻轻搅拌防止血凝(注:一只鸡的血大约50mL左右,按10%的用量加入3.8%的柠檬酸钠)。
② 取上述血液1mL放在1.5ml的离心管中,2000rpm离心5min,用移液器轻轻吸取上清液,弃去;加入1mL生理盐水清洗红细胞,2000rpm离心5min,重复洗2—3次(注:从离心机内拿出离心管时切勿震荡,不要用倾倒离心管方法倒上清液,以免红细胞流出。清洗红细胞时用移液器缓缓抽打进行悬浮,防止红细胞破裂)。
③ 在小试剂瓶中加入9.7mL生理盐水,用移液器吸取300μL血红细胞加入小试剂瓶中,混匀,即是3%的红细胞悬液,贴上标签备用(注:吸取红细胞加入试剂瓶时可吸取生理盐水清洗几次吸头,使得红细胞全部在悬液中)。
2、细胞溶血现象观察
取试管一支,加入5ml蒸馏水,再加入0.5ml制备好的鸡血,注意观察溶液颜色的变化,由不透明的红色逐渐澄清。红细胞发生破裂,造成100%红细胞溶血,使光线比较容易透过溶液。
2、红细胞的渗透性
(1)取试管一支,加入0.17mol/L氯化钠溶液5ml,再加入0.5ml制备的鸡血,轻轻摇动,注意颜色变化。
(2)分别在下列几种等渗溶液中进行实验,步骤同(1):
0.17mol/L氯化铵 0.17mol/L硝酸钠 0.12mol/L草酸铵 0.12mol/L硫酸钠 0.32mol/L葡萄糖 0.32mol/L乙醇
六、实验结果与分析
等渗溶液中加入血红细胞,在水和乙醇中可以发生瞬间溶血;在铵盐溶液中加入血红细胞放置一段时间可以看到血细胞发生溶血,但是溶血比较缓慢;在钠盐溶液中不发生溶血,放置一段时间后红细胞基本全部沉降到试管底部;在葡萄糖溶液中放置一段时间后发生了少量的溶血,但是大部分的血红细胞未发生溶血沉降到试管底部,如图所示。

图1刚加入红细胞震荡后现象(自左往右等渗溶液依次为:乙醇,水,氯化铵,草酸铵,硫酸钠,葡萄糖,氯化钠,硝酸钠)

图2 加入红细胞静置一段时间后现象(自左往右等渗溶液依次为:乙醇,水,氯化铵,草酸铵,硫酸钠,葡萄糖,氯化钠,硝酸钠)
七、注意事项及改进
1、鸡红细胞的稀释要用0.9%生理盐水,加入的生理盐水体积与第一步取的鸡血的体积相等。
2、离心机使用时,要将配平后的离心管对称放置在离心机内,禁止未配平就放入离心机和非对称放置离心管。
3、从离心机内拿出离心管时切勿震荡,不要倾倒离心管倒上清,以免红细胞流出。清洗红细胞时用移液器缓缓抽打,防止红细胞破裂。
改进:3%血红细胞悬液浓度较低,加入水溶液中溶血较快看不到明显的溶血过程,建议是否把红细胞悬液浓度加大一点。
八、建议课时安排
本实验可以跟红细胞凝集反应实验在同一课时一起做
九、回答问题
1、溶液的渗透压主要与哪些因素有关?对简单盐溶液如何粗略计算出其渗透压?
答:渗透压与溶液的浓度和温度有关。Π=icR或Π=n/VRT,Π是溶液的渗透压(kpa),i是等渗系数,V是溶液体积(ml3),n是溶剂物质的量,R是摩尔气体常数。通过公式可以计算盐溶液渗透压。
2、红细胞的细胞膜可以选择透过哪些物质?
答:细胞膜是脂质双分子层,其上镶嵌有蛋白(包括糖蛋白,载体蛋白等)。活细胞电性还有膜内正外负的特性。首先,分子量小,脂溶性,非极性的分子会随意穿梭细胞膜,如氧气分子,氮气分子,二氧化碳分子,乙醇分子,甘油;其次,像水分子这样很小的不带电的分子也可以从两个脂质分子中间穿过,而带电的分子即使很小也不好过活细胞的膜(死的就和水分子一样好过了);最后,像葡萄糖,蔗糖,氨基酸这样的大分子是依靠载体蛋白来介导的(这多数要有ATP提供能量的帮助,而活细胞才能提供ATP),所以在单独的细胞膜,它们几乎不能通过。
3、为什么铵盐的等渗溶液能发生完全溶血而钠盐的不行?
答:(待定)
4、物质跨膜(细胞膜)运输有哪些方式?请比较它们的异同点。
答:大分子或者颗粒运输方式有胞吞和胞吐;小分子物质和离子运输有三种:自由扩散,协助扩散和主动运输。
蛋白质和某些其它的大的物质被质膜吞入并带入细胞内(以脂囊泡形式)。受体介导的胞吞开始是大分子与细胞的质膜上的受体蛋白结合,然后膜凹陷,形成一个含有要输入的大分子的脂囊泡,也称为内吞囊泡,出现在细胞内。出现在胞内的囊泡与胞内体融合,然后再与溶酶体融合,胞吞的物质被降解。胞吐除了转运方向相反外,其过程类似于胞吞。在胞吐中,确定要从细胞分泌出的蛋白质被包裹在囊泡内,然后与质膜融合,最后将囊泡内的包容物释放到细胞外介质中。
胞吞 胞吐
相同点 都以形成囊泡形式包住大分子或者颗粒通过细胞膜
不同点 形成的囊包从细胞外进入细胞内 通过形成囊包的方式把细胞分泌物质输送到细胞外

自由扩撒 协助扩撒 主动运输
相同点 都是小分子物质和离子通过细胞膜
不同点 不需要载体和能量,物质从高浓度向低浓度运输 需要载体,从高浓度向低浓度运输 从低浓度向高浓度运输,需要载体和能量
5、选择透过性膜与半透膜有何区别?
答:半透膜是指一些物质可以透过,另一些物质不能透过的多孔性薄膜。例如:玻璃纸,花生种皮,猪肠衣,鸡卵的卵壳膜,离体的膀胱膜,蚕豆种皮,鱼鳔,青蛙皮,火棉胶等。根据半透膜是否具有生命现象可分为生物膜和非生物膜。选择性透过膜是具有活性的生物膜,它对物质的通过既具有半透膜的物理性质,还具有主动的选择性,如细胞膜。因此,具有选择透过性的膜必然具有半透性,而具有半透性的膜不一定具有选择性透过,活性的生物膜才具有选择透过性。
6、实验中清洗红细胞时为什么要用生理盐水?
答:生理盐水与红细胞不发生溶血,而且氯化钠溶液中的氯离子对实验的没有存在大影响。




















重点:细胞骨架(考试内容),细胞核染色,蛋白质、氨基酸、脲酶的染色测定。计数板的计数方法。
讲解内容:细胞染色和细胞质染色,压片方法;
酵母计数:使用显微镜观察,并对于微生物的计数方面;要讲到使用血球计数板的注意事项:不能用硬物刷洗,可以用无水乙醇冲洗,加速水分蒸发,另外洗完后要镜检。
植物组织的染色:木质部?
蛋白质、脲酶、氨基酸含量测定(考察测定方面的知识);
糖、单糖、多糖、脂、双缩脲等;
测定:滴定法,微生物测定:稀释涂布法,酵母计数等
使用移液管和滴定管。
提到:统计学的方法

pr
测定法比较:
定氮法比较繁复,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白。
紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后样品仍能回收利用。缺点是准确度较差,干扰物质多,用标准曲线法测定蛋白质含量时,对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。
Lowry法是较早发展的一种灵敏的检测方法,最低灵敏度为5微克,通常测定范围20-250微克。优点是灵敏度高,缺点是费时较长,要精确控制操作时间,标准曲线不是严格的直线形式,且专一性差,干扰物质较多。
Bradford法是灵敏度更高的一种方法,优点有:灵敏度高,比lowry法高4倍左右,最低检测达1-5微克;测定快速、简便,染色稳定;干扰物质少。确点是用于不同蛋白质测定时有较大的偏差;仍有干扰,如SDS、去污剂、Triton x100等;标准曲线有轻微的非线性。
原理:
定氮法:蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。
双缩脲:将两分子尿素分子加热脱去一分子氨而形成的就是双缩脲 NH2-CO-NH-CO-NH2
双缩脲在碱性溶液中与CU2+结合形成紫红色络合物,这样的呈色反应,称之为双缩脲反应
因为蛋白质含有大量彼此相连的肽键(-CO-NH-),也可以在碱性条件下与CU2+进行双缩脲反应,
生成紫红色的络合物。且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10—120g/L这个范围内有良好的
线性关系。
Folin-酚试剂法(Lowry法):此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是:?在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。?Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。
BCA法:其原理与Lowery法蛋白定量相似,即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物,在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比,BCA蛋白测定方法灵敏度高,操作简单,试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳,并且受干扰物质影响小。与Bradford法(考马斯亮蓝)相比,BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
紫外吸收法:蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。
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实验一 口腔上皮细胞中的细胞器观察
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一、实验原理:
线粒体中存在细胞色素氧化酶系统,它可使染料(如詹纳斯绿)始终处于氧化状态,而呈现出颜色(蓝绿色)。在周围的细胞质中的染料则被还原为无色。因此十分便于观察。在细胞生物学中染料詹纳斯绿常用于显示细胞中线粒体的分布和运动。
一定浓度的中性红,对细胞进行活体染色,可以显示细胞内液泡系。对于口腔上皮细胞,可以显示出高尔基体;对于植物细胞,可以显示出细胞内的液泡。
二、实验目的:
1. 学习临时装片的做法;
2. 观察细胞中的线粒体和液泡系。
三、实验用具:
载玻片,盖玻片,牙签,微量可调移液器,显微镜。
四、试剂配制:
Ringer溶液:在100mL蒸馏水中分别溶解 0.85g NaCl,0.25g KCl和0.03g CaCl2。
1/5000詹纳斯绿B(Janus Green B):将0.1g詹纳斯绿B,溶于10ml蒸馏水,配成原液。用时(现用现取)取原液1ml加入49ml Ringer溶液,即成1/5000染液,装入棕色试剂瓶中备用。
1/3000中性红染液:取0.1g中性红溶于10ml Ringer溶液中,稍加热(30~40摄氏度)使溶解,用滤纸过滤,用时(现用现取)取原液1ml加入29ml Ringer溶液,即成1/3000中性红溶液,溶液装入棕色试剂瓶。
五、实验前准备:
主要仪器:
计时器(25个/班,1个/组)恒温培养箱(5个/班,共用)微量移液器(25套/班,1套/组)显微镜(12个/班,共用)
辅助仪器:
载、盖玻片(100个/班,4个/组)镊子(50个/班,2个/组)
耗材:
牙签(100个/班,4个/组)黄、蓝吸头(各25盒/班,1盒/组)
材料:
洋葱(25个/班,1个/组)
试剂:
1/5000詹纳斯绿B(12.5ml /班,500μl /组) 1/3000中性红(12.5ml /班,500μl /组)
备注:
1/5000詹纳斯绿B(50ml):取0.01g詹纳斯绿B,溶于50ml Ringer溶液,装入棕色试剂瓶中备用。
中性红染液(30ml):取0.01g中性红溶于30ml Ringer溶液,装入棕色试剂瓶中备用。
Ringer溶液(100ml):在100mL蒸馏水中分别溶解0.85g NaCl,0.25g KCl和0.03g CaCl2。
五、实验步骤:
线粒体染色:
1. 取2滴1/5000詹纳斯绿B染液滴在洁净载玻片中央;
2. 用牙签刮取口腔上皮细胞涂抹在染液中;
3. 放在恒温培养箱(37℃)染色10-15min。此时,不可使染液干燥,必要时可再加1滴染液;
4. 盖上盖玻片,在普通光学显微镜下观察。
5. 取洋葱内表皮放入詹纳斯绿B染液中,染色10-15min, 盖上盖玻片进行镜检。
高尔基体染色:
1. 做口腔上皮细胞涂片,滴上中性红染液,染5-10min;
2. 普通光学显微镜下观察;
3. 用镊子撕取洋葱根尖放入中性红染液中,染色5-10min, 盖上盖玻片进行镜检(用镊子轻轻地下压盖玻片,使根尖压扁,利于观察) 。
六、实验结果与分析:
线粒体染色:
在口腔上皮细胞和洋葱内皮细胞的细胞质中,可以看到被染成蓝绿色颗粒状的线粒体。如图1、图2所示:

图1. 口腔上皮细胞经詹纳斯绿B染色(放大倍数:400×)

图2. 洋葱内表皮经詹纳斯绿B染色(放大倍数: 400×)
高尔基体染色:
口腔上皮细胞中高尔基体被染成红色。洋葱根尖细胞质中的液泡被染成玫瑰红色。

图3. 口腔上皮细胞经中性红染色

图4. 洋葱内表皮经中性红染色
七、注意事项及改进:
1. 线粒体染色时,可用恒温培养箱取代恒温水浴锅金属板作为恒温装置;
2. 在做线粒体染色时,除了使用口腔上皮细胞进行染色外,还可进行洋葱内表皮细胞染色,效果明显。
八、建议课时安排:
建议用1个课时。
九、问题提问:
1. 詹纳斯绿B和中性红染色的原理是什么,对细胞有什么要求?
答:线粒体中存在细胞色素氧化酶系统,它可使詹纳斯绿始终处于氧化状态,而呈现出蓝绿色。周围细胞质中的染料则被还原为无色。中性红是弱碱性染料,被活细胞吸收后集中在细胞内的液泡系内,植物细胞中的液泡被染成红色,动物细胞中的高尔基体的液泡部分被染成红色。这两中染色都要求细胞为活细胞。
2. 你认为所观察的线粒体的直径有多大?在光学显微镜下,放大多少倍才可看到?
答:2.5μm左右,在光学显微镜下放大400倍才能看到。
3. 何谓口腔上皮细胞?
答:口腔上皮细胞是口腔内组成上皮组织的细胞。
4. 洋葱内表皮细胞有叶绿体吗?
答:洋葱内表皮没有叶绿体,洋葱是植物的茎,高等植物中,只有进行光合作用的叶肉细胞才有叶绿体。
5. 如用蚕豆表皮细胞观察,它有叶绿体吗?
答:蚕豆表皮细胞也没有叶绿体,因为蚕豆表皮细胞是一层细胞膜。
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实验二 细胞中核酸染色和两类核酸定位
一、实验原理:
细胞中,DNA主要分布在细胞核内;RNA主要分布在细胞质中,碱性染料甲基绿和派洛宁对酸性的核酸均有亲和力,但是这两种染料对DNA和RNA却有很强的选择性:DNA可以被甲基绿染成绿色,RNA却被派洛宁染成红色。
二、实验目的:
观察细胞中的DNA、RNA的分布
三、实验用具:
载玻片,盖玻片,牙签,微量可调移液器,显微镜。
四、试剂配制:
甲基绿-派洛宁混合染料:称取甲基绿0.1g,吡咯红0.0835g,乙酸钠0.39g,加入蒸馏水90ml, 再加入乙酸192μL,混匀后定容至100ml。
卡诺氏固定液::取无水乙醇60ml, 再加入冰乙酸20ml。
95%酒精:量取95ml酒精,加入5ml蒸馏水。
70%酒精:量取70ml酒精,加入30ml蒸馏水。
五、实验前准备:
主要仪器:
普通光学显微镜(12个/班,共用)计时器(25个/班,1个/组)微量移液器(25套/班,1套/组)
辅助仪器:
载、盖玻片(各50个/班,2个/组)镊子(各50个/班,2个/组)
耗材:
黄、蓝吸头(各25盒/班,1盒/组)
材料:
洋葱(25个/班,1个/组)
试剂:
甲基绿-派洛宁混合染料(12.5 ml /班,500μl /组)卡诺氏固定液(250mL/班,10ml/组) 95%酒精(250ml /班,10ml /组) 70%酒精(250ml /班,10ml /组)
备注:
甲基绿-派洛宁混合染料(100ml):称取甲基绿0.1g,吡咯红0.0835g,乙酸钠0.39g,加入蒸馏水90ml, 再加入乙酸192μL,混匀后定容至100ml。
卡诺氏固定液(320ml):取无水乙醇240ml, 再加入冰乙酸80ml。
95%酒精(300ml):量取285ml酒精,加入15ml蒸馏水。
70%酒精(300ml):量取210ml酒精,加入90ml蒸馏水。
六、实验步骤:
1. 取洋葱内表皮细胞,放入卡诺氏固定液固定15min。然后再放入95%酒精10min,接着再转入70%酒精10min ?;
2. 将洋葱内表皮放在洁净的载玻片上,滴上1~2滴甲基绿-派洛宁混合染料,染色5-10min,用蒸馏水冲去多余染液,盖上盖玻片,用吸水纸吸去多余染液;
3. 在普通光学显微镜下观察。
七、实验结果与分析:
从实验结果可以看出,洋葱内表皮细胞经甲基绿哌洛宁(吡咯红)染液染色后,细胞核被染成蓝绿色,细胞质部位呈粉红色,如图1所示

图1. 400×洋葱内表皮经甲基绿哌洛宁染液染色
八、注意事项及改进:
1. 洋葱内表皮细胞进行经吡咯红甲基绿染色,实验效果好,建议用洋葱内表皮细胞代替洋葱根尖细胞;
2. 卡诺固定15min便能达到较好的实验效果,建议固定细胞时时间为15min;
3. 甲基绿吡咯红染色5-10min就能达到很好的染色效果,建议将染色时间从20-30min改为5-10min。
九、建议课时安排:
建议用1个课时
十、问题提问:
1. 甲基绿哌洛宁染色的原理是什么?
答:甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色(但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色),即RNA对派洛宁亲和力大,被染成红色,而DNA对甲基绿亲和力大,被染成绿色。
2. 卡诺试剂固定的原理是什么?
答:卡诺固定液能够迅速穿透细胞,溶解脂肪及类脂体,使蛋白质变性凝固,维持细胞的稳定性,达到优良染色效果。
3. DNA仅存在于细胞核中,这句话对吗?为什么?
答:不对,DNA除存在于细胞核内,在叶绿体和线粒体中也存在。
4. RNA仅存在于细胞质中,这句话对吗?为什么?
答:不对,RNA除存在于细胞质内,在细胞核、叶绿体和线粒体中也存在。
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实验三 植物细胞骨架观察
一、实验原理
细胞骨架(cytoskeleton)是真核细胞中由纤维蛋白所组成的网状结构,对细胞形态的维持,细胞的生长、运动、分裂、分化,物质运输,能量转换、信息传递,基因表达等起到重要的作用。广义的细胞骨架包括细胞质骨架、细胞膜骨架、细胞核骨架、细胞外基质四类,而狭义的细胞骨架指的就是细胞质骨架。根据其组成成分和形态结构,细胞质骨架可分为微管(microtube)、微丝(microfilament)和中间纤维(intermediate filament)。目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、酶标和组织化学等。
微丝是球形肌动蛋白单体(G-actin)构成的纤维(F-actin)结构,单根微丝直径7nm,在光学显微镜下看不到该细胞骨架的结构。常用的观察微丝的方法主要有两种:罗丹明标记的鬼笔环肽染色法和考马斯亮蓝R-250染色法。
鬼笔环肽是一种从毒蕈中提取的双环杆肽,分子量小,容易进入细胞,能与微丝强烈结合,结合在微丝的亚单位之间,具稳定微丝和促进微丝聚合的作用。由于鬼笔环肽分子量很小,即使加上荧光标记,也能很容易的进入细胞。又由于它只与F-actin(F肌动蛋白; 纤维状肌动蛋白)结合而不与G-actin(G-肌动蛋白,球状肌动蛋白)结合,所以,用荧光标记的鬼笔环肽对细胞进行染色,可以很清晰地看到微丝(是双股肌动蛋白丝以螺旋的形式组成的纤维)的图象,微丝呈明亮的橘红色。
考马斯亮蓝是一种蛋白质染料,主要有R-250和G-250两种类型。考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基(Arg)或芳香族氨基酸残基结合,使蛋白变蓝。由于反应时颜色的深浅与蛋白的含量相关,所以可依此进行蛋白浓度的测定。考马斯亮蓝主要用于对蛋白含量的测定和对蛋白进行染色观察,在蛋白的定量分析、蛋白的电泳和细胞骨架观察中有非常重要的应用。由于考马斯亮蓝R-250并非微丝专一性的染料,所以,在用它对微丝进行染色观察前,应首先用去垢剂抽提掉胞质中的除骨架以外的其他蛋白,以便清晰地显示细胞质中微丝的结构。
本实验观察的是植物细胞中由微丝平行排列形成的微丝束,在动物细胞中称为“应力纤维”。非肌细胞中的微丝是动态结构,单体和纤维在一定的条件下可相互转化。本实验中M-缓冲液提供的离子条件可使纤维稳定。在Mg2+、高浓度K+、Na+诱导的条件下, F-actin趋于稳定,而在含ATP、Ca2+和低K+、Na+的条件下,F-actin趋于解聚。EDTA(乙二胺四乙酸二钠)可螯合大部分金属离子;EGTA(乙二醇双醚四乙酸)可专一性螯合Ca2+,因此加入EGTA来降低Ca2+的浓度,维持微丝的稳定性。
为了更好地观察微丝束的结构,采用了戊二醛对细胞进行固定。戊二醛是一种双交联剂,渗透快,交联能力强,对蛋白质的固定效果好,且不破坏细胞骨架的结构。
去垢剂为一端亲水一端疏水的小分子,可将膜脂包围在内部,从而形成水溶性的分子,导致细胞膜系统的崩解,是分离与研究膜蛋白的常用试剂,可分为离子型去垢剂和非离子型去垢剂两类。常用的离子型去垢剂有十二烷基磺酸钠SDS,能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水键,使蛋白多肽链展开,SDS则以其烃链与蛋白分子侧链结合。SDS作用剧烈,能引起蛋白的变性。TritonX-100(曲拉通X-100,液体)又名聚乙二醇辛基苯醚,是一种非离子型去垢剂,作用温和,是研究细胞骨架蛋白的重要的工具药物。当用适当浓度的TritonX-100处理植物细胞后,可使细胞质膜中和细胞质中的蛋白质(能使95%以上的可溶性蛋白被抽提)和全部脂质被溶解抽提,而细胞骨架系统的蛋白质却保存完好,经考马斯亮蓝R-250染色,在光学显微镜下可观察到由微丝组成的微丝束为网状结构。
二、实验目的
掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理和方法,观察光学显微镜下植物细胞骨架的网状结构。
三、实验材料
洋葱鳞片(叶)。
四、实验试剂配制
1. 0.2%考马斯亮蓝R250染色液:称考马斯亮蓝R250 1g,溶于250mL无水乙醇中,加冰醋酸35mL,再加蒸馏水至500mL。
2. 磷酸缓冲液(PH6.8):6.8mmol/L磷酸缓冲液,调至PH6.8。
3. M缓冲液(PH7.2):50mmol/L咪唑、50mmol/L氯化钾、0.5mmol/L氯化镁、1mmol/L乙醇双乙胺醚、0.1mmol/L乙二胺四乙酸、1mmol/L巯基乙醇,调至PH7.2。
4. 1%Trion X-100:用M缓冲液配制。
5. 3%戊二醛:用M缓冲液配制。
五、实验前的准备
主要仪器:普通显微镜(25台/班,1台/组)。
辅助仪器:镊子(25把/班,1把/组);50mL三角瓶(25个/班,1个/组);载玻片、盖玻片(各50片/班,各2片/组)。
耗材:擦镜纸、吸水纸(各25包/班,各1包/组)。
材料:洋葱鳞片(叶)(25头/班,1头/组)
药品试剂:0.2%考马斯亮蓝R250染色液(500mL/班,20mL/组);磷酸缓冲液PH6.8(2000mL/班,80mL/组);M缓冲液PH7.2(1500mL/班,60mL/组);1%TrionX-100(500mL/班,20mL/组);3%戊二醛(500mL/班,20mL/组)。
备注:0.2%考马斯亮蓝R250染色液:称考马斯亮蓝R250 1g,溶于250mL无水乙醇中,加冰醋酸35mL,再加蒸馏水至500mL;磷酸缓冲液(PH6.8):6.8mmol/L磷酸缓冲液,调至PH6.8;M缓冲液(PH7.2):50mmol/L咪唑、50mmol/L氯化钾、0.5mmol/L氯化镁、1mmol/L乙醇双乙胺醚、0.1mmol/L乙二胺四乙酸、1mmol/L巯基乙醇,调至PH7.2;1%Trion X-100:用M缓冲液配制;3%戊二醛:用M缓冲液配制。
六、实验步骤
1. 用镊子撕取洋葱鳞叶内侧的表皮若干片(约1cm2大小若干片),置于50mL烧杯中,加入pH6.8磷酸缓冲液(5mL左右),使其下沉(10min左右)。
2. 吸去磷酸缓冲液,用1%Trion X-100(5mL左右)处理20min。
3. 吸去Trion X-100,用M缓冲液(5mL左右)洗3次,每次5min。
4. 用3%戊二醛(5mL左右)固定30min。
5. 磷酸缓冲液(PH6.8)(5mL左右)洗3次,每次5min。
6. 0.2%考马斯亮蓝R250(5mL左右)染色10min。
7. 蒸馏水洗2次,然后将样品置于载玻片上,加盖玻片,在普通光学显微镜下观察。
七、结果
在细胞中可以观察到染成兰色的呈网状的细胞骨架(如下图所示)。

图1 洋葱内表皮细胞骨架
八、注意事项
1. 对材料处理过程中,要不定时的轻轻摇动烧杯。
2. 样品要展平置于载玻片上,然后进行观察。
九、回答问题
1.描绘所观察到的植物细胞的骨架图
答:略。
2.什么是细胞骨架?它有何主要功能?
答:细胞骨架(cytoskeleton)是真核细胞中由纤维蛋白所组成的网状结构,对细胞形态的维持,细胞的生长、运动、分裂、分化,物质运输,能量转换、信息传递,基因表达等起到重要的作用。
3.说明实验中使用的TritonX-100、戊二醛、考马斯亮蓝R-250的作用。
答:(1)TritonX-100又名聚乙二醇辛基苯醚,是一种非离子型去垢剂,作用温和,是研究细胞骨架蛋白的重要的工具药物。当用适当浓度的TritonX-100处理植物细胞后,可使细胞质膜中和细胞质中的蛋白质(能使95%以上的可溶性蛋白被抽提)和全部脂质被溶解抽提,而细胞骨架系统的蛋白质却保存完好;(2)戊二醛是一种双交联剂,渗透快,交联能力强,对蛋白质的固定效果好,且不破坏细胞骨架的结构;(3)考马斯亮蓝是一种蛋白质染料,主要有R-250和G-250两种类型。考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基(Arg)或芳香族氨基酸残基结合,使蛋白变蓝。
十、建议课时安排
该实验全部完成的时间为120min左右,建议课时安排3个。
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实验五 蛋白质含量测定
一、实验原理
蛋白质含量测定有许多方法,考马斯亮蓝(G-250)比色测定是最灵敏的方法之一。考马斯亮蓝可与蛋白质通过氢键结合生成复合物,结合符合比尔定律。结合前颜料为棕红色,结合后为蓝色,最大吸收由465nm转变成595nm。通过测定595nm处最大光吸收的增加,可知结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个快速的过程,两分钟内即可完成,并可稳定1小时,测定范围在10~100ug/ml蛋白质之间为线性范围,去污剂有颜色干扰,可影响比色结果。
本试验是利用考马斯亮蓝与不同量蛋白质的标准曲线来目测未知蛋白质溶液的蛋白质含量,并计算未知溶液的蛋白质含量。
二、实验目的
了解考马斯亮蓝测定蛋白质含量的原理及方法。
三、实验材料与仪器
1、实验器材:试管、移液器、吸头
四、试剂配制
1. 标准蛋白质母液的配制:称取牛血清白蛋白50mg,定容于50ml容量瓶中,制成1000ug/ml的标准蛋白质母液,放置于4℃保存。(已配制)
2. 标准蛋白质溶液的配制:吸取4ml标准蛋白质母液,加入16ml蒸馏水,混匀。配制成200ug/ml标准蛋白质溶液。(己配制)
3. 考马斯亮蓝(G-250)试剂的配制:称取60mg考马斯亮蓝G-250,加入100ml 3%(W/V)高氯酸(市售产品百分浓度为70%)溶液中,此溶液在常温下可放置一个月。(已配制)
4. 3%高氯酸溶液:吸取4.3ml市售高氯酸,加入95.7ml蒸馏水,混匀。即为3%高氯酸溶液。(己配制)
五、实验前准备
辅助仪器:试管(425支/班,15支/组),移液器(25套/班,1套/组)
耗材:吸头-5000uL(500个/班,20个/组)
药品试剂:考马斯亮蓝450ml/班,18ml/组;标准蛋白液290ml/班,11.6ml/组
六、实验方法及步骤
1. 标准曲线
取7支试管,编号,用制成的标准蛋白质溶液,按下表所给的量依次加入。
管号
类别 1 2 3 4 5 6 7
标准蛋白质溶液(ml) 0 0.2 0.6 1.2 2.2 3.2 4.2
蒸馏水(ml) 5 4.8 4.4 3.8 2.8 1.8 0.8
蛋白质含量(ug/ml) 0 8 24 48 88 128 168
另取7支干试管,编号,分别吸取上述溶液1ml加入试管中,再向其中分别加入1ml蒸馏水,2ml考马斯亮蓝试剂,摇匀。
2. 未知样品蛋白质含量的测定
取未知样品蛋白质溶液0.2ml,加入1.8ml蒸馏水,再加入2ml考马斯亮蓝试剂,摇匀。在放有白瓷板的背景下,与标准曲线蛋白质溶液比较,以溶液的颜色确定未知样品蛋白质含量的范围。如未知样品颜色在两个标准蛋白质溶液之间,可取两个标准蛋白质溶液蛋白质含量的平均值,作为未知样品的蛋白质含量;如与标准蛋白质溶液中的一个相当,则以这一标准蛋白质溶液的蛋白质含量作为未知样品溶液的蛋白质含量。
3. 去污剂对测定的影响
取2支干净的试管,分别向两支试管加入未知样品蛋白质溶液0.2ml,然后再向两试管中加入1.75ml蒸馏水,混匀。向一支试管中加入50ul的去污剂A溶液,向另一支试管加入50ul的去污剂B溶液,将两支试管分别混匀。分别向两支试管中加入2ml的考马斯亮蓝试剂,混匀后以测定的未知样品蛋白质溶液为空白,观察颜色的变化。
七、实验结果与分析

1号为空白,2-7号为标准蛋白液,8号为样品,样品浓度在4号-5号之间,取其平均值,为34ug/ml。
八、注意事项及改进
1.标准蛋白质溶液梯度显色时,要从低浓度到高浓度,否则影响实验效果。
2.实验进行后要在一个小时内记录结果,1个小时后,结合物会出现凝集,影响观察。
九、问题与讨论
1.为什么要做去污剂干扰的实验?
答:因为实验室里经常会用到去污剂,为了避免因此影响到实验效果,进行这个实验。
2.蛋白质含量测定有几种方法?各是什么原理?
答:凯氏定氮法,双缩脲法,紫外吸收法,Folin-酚试剂法(Lowry法),考马斯亮蓝法,BCA法。
3.人吃蛋白时,变性蛋白易消化,还是非变性蛋白易消化?
答:变性蛋白更易消化。
4.你知道自然界在人食用的植物、动物和微生物中,含有较丰富蛋白酶含量的有什么?都在它们的什么部位?
答:
5.在什么植物什么部位含有较多的蛋白酶抑制剂?为什么会含有这样多?
答:
十、建议课时安排
实验完成需要45min,建议1个课时。
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实验六 脲酶测定
一、实验原理
有些生物化学反应中指示反应完成,经常使用直观的指示剂指示,如氧化还原指示剂和酸碱指示剂。氧化还原指示剂是氧化状态下和还原状态下各有不同颜色;酸碱指示剂是指示生物化学反应前后溶液的酸碱度变化,不同酸碱度各有不同颜色。
这里进行一次酶促反应试验,人的血液中和尿液中都含有尿素,尿素的含量变化是许多病变的重要指标。尿酶可作用于尿素,它的反应如下:
(NH2)2C=O + H2O 尿 酶 2NH3 + CO2
尿酶可以定量测定尿素含量,尿酶通常可从大豆粉中提取,本试验用大豆粉和玉米粉提取尿酶,通过上述反应观察两种植物种子中尿酶的含量。在与底物尿素的作用反应中,分别加入三种指示剂A、B、C,但在制备指示剂的过程中忘记了瓶号,只知道三种是中性红、百里香酚兰和亚甲兰,其中有酸碱指示剂和氧化还原指示剂。
二、实验目的
1、 确定两种植物种子中谁含大量的脲酶;
2、分出谁是氧化还原指示剂,谁是酸碱指示剂。
三、实验器材及试剂
1、仪器设备
电子天平,4只100ml三角瓶,14支试管,试管架,2个三角漏斗,50ml量筒,玻璃棒,移液器及吸头,脱脂棉
2、试剂
30%乙醇溶液,2%尿素溶液,指示剂A,B,C(中性红,亚甲蓝,百里香酚蓝)
3、材料
大豆粉,玉米粉
四、实验准备
仪器设备:电子天平(每五组一个,共5个/班),4只100ml三角瓶(共需要100个/班),14支试管(共需要350支/班),试管架(25个/班),2个三角漏斗(共需要50个/班),50ml量筒(25个/班),玻璃棒(25根/班),移液器及吸头(蓝,黄吸头各一盒,每种各25盒/班),脱脂棉(若干每组,尽量多一些)
试剂:30%乙醇溶液(80ml/组,共2L/班),2%尿素溶液(12ml/组,共300ml/班),指示剂A,B,C(中性红,亚甲蓝,百里香酚蓝)(各需2滴或3滴,适合即可)
材料:大豆粉,玉米粉(每组各2g,一共需要各50g/班)
备注:
30%乙醇溶液:去30ml无水乙醇荣誉70ml水中。或者取31.58ml 95%乙醇溶于68.42ml水中。
2%尿素溶液:称取2g尿素(脲),加水定容到100ml。
中性红指示剂:称取0.5g中性红,加水溶解成100ml。(变色范围:pH6.8~8.0红→黄,pH=7.4左右时为橙色)
1%亚甲蓝溶液:称取1g亚甲蓝定容于100ml乙醇。或者加入79ml 95%乙醇然后定容至100ml。(氧化环境为蓝色,还原环境为无色)
百里香酚蓝:称取0.1g溶于0.05mol/L的NaOH溶液中,再加水稀释至200ml。(变色范围:pH1.2~2.8,红→黄;pH8.0~9.6,黄→蓝)
五、实验方法及步骤
1、用1/100电子天平称取大豆粉和玉米粉各2克分别放入两个100ml的三角瓶中,用量筒量取40ml 30%的乙醇溶液,搅拌或震荡悬浮,放置10分钟,提取脲酶。
2、将三角玻璃漏斗放在另一组(2个)清洁的三角瓶上,再将少许脱脂棉轻压放到漏斗内,分别将上述提取悬液倒入三角玻璃漏斗中用脱脂棉过滤。弃沉淀,回收滤液,滤液即脲酶提取液。滤液不一定清澈透明,不影响测定。
3、取2组试管每组7支,标号,依表1加入各种试剂。在试剂加入后混匀,静置10分钟观察颜色变化,并将颜色变化写入表1。
大豆粉 玉米粉
管号 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
尿素溶液(ml) 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0
水(ml) 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1
指示剂A(滴) 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1
指示剂B(滴) 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0
指示剂C(滴) 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0
酶液(ml) 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1
未反应时颜色 红 黄 蓝 红 黄 蓝 红 红 黄 蓝 红 黄 蓝 红
反应后颜色 红 黄 蓝 橙 紫蓝 蓝 红 红 黄 蓝 红 黄 蓝 红
六、实验结果与分析
图1 脲酶与尿素反应指示剂变化图像(上排加大豆提取液,下排加玉米提取液)
如图1实验指示剂变色结果证明:加玉米提取液的指示剂不变色,没有发生生化反应,说明玉米中不含脲酶;加大豆提取液的指示剂发生颜色变化,说明大豆中可以提取出脲酶,即大豆中含脲酶比玉米多;指示剂A是中性红,指示剂B是百里香酚蓝,指示剂C是亚甲蓝。
七、注意事项
1、过滤时尽量倒上清,不要将玉米粉或大豆粉的残渣倒入漏斗中,以免影响过滤的速度。
2、实验过后不宜过放置长时间再观察现象,以免溶液与空气中的氧气发生氧化反应引起颜色变化。
八、建议课时安排
建议试验时间1小时
九、回答问题
1、大豆粉和玉米粉中谁含有最多的脲酶?
A.大豆粉 B.玉米粉
2、脲酶对尿素的作用是否是氧化还原反应?
A.是 B.否
3、三种指示剂中哪种是酸碱指示剂?
A.中性红 B.百里香酚兰 C.亚甲兰
4、在生化反应中反应前后有酸碱变化时,酸碱指示剂有无电子的得失?
A.有 B.无
5、在生化反应中,如反应前后有氧化还原的变化,这一指示剂有无电子的得失?
A.有 B.无
6、在光合作用的希尔反应中,照光的叶绿体可使2,6一二氯酚靛酚退色,这一氧化还原指示剂在退色后是被氧化,还是被还原?
A.氧化 B.还原
注:希尔反应(Hill reaction)是指在光照条件下,绿色植物的叶绿体裂解水,释放氧气并还原电子受体的反应。2,6一二氯酚靛酚是一种蓝色染料,接受电子和H+离子后被还原成为无色。
7、如果一个酶促反应,其产物是碱性物质,这里有三种酸碱指示剂,它们的变色pH范围如下,你选择哪种物质为指示剂?
A.间甲酚紫 pH 1.2-2.8 B.甲基橙 pH 3.1-4.4
C.酚红 pH 6.4-8.2
8、在生化反应的指示中,酸碱指示剂是否参与这一生化反应?
A.参与 B.不参与
注:酸碱指示剂的指示原理是一个电离平衡关系
9、在生化反应的指示中,氧化还原指示剂是否参与这一生化反应?
A.参与 B.不参与
注:氧化还原指示剂的作用原理是指示剂本身发生了氧化还原反应变成了其他颜 色的物质。
10、在希尔的光合作用中,照光叶绿体的反应中使用的是2,6一二氯酚靛酚,但自然界的光合作用中,谁取代这一角色?
A.ADP B.NAD+ C. NADP+ D. NADPH+H+
注:光合作用反映的有关化学方程式
  H20→H+ O2(水的光解)
  NADP+ + 2e- + H+ → NADPH(递氢)
  ADP+Pi→ATP (递能)
  CO2+C5化合物→C3化合物(二氧化碳的固定)
  C3化合物→(CH2O)+ C5化合物(有机物的生成或称为C3的还原)
  ATP→ADP+Pi(耗能)
从反应式可以看出,ADP是低能作用,在光合作用的反应中只有NADP+有得到2个电子被还原,而NADPH+H+离子则在暗反应里面充当还原剂的作用
11、过滤时为什么用脱脂棉而不用滤纸?
答:脱脂棉过滤的速度快,用滤纸过滤的速度比较慢,而且大豆粉和玉米粉容易堵住滤纸的小孔,过影响过滤,本实验只是要验证溶液中有没有脲酶,不一定用清澈的溶液,粗提液即可。

..................
实验七 酱油中的氨基酸含量测定
一、实验原理
酱油是千家万户最常用的调味品,它是由提取食用豆油后的豆粕或豆饼经米曲霉发酵而成,优质酱油为赤褐色、鲜艳、透明、无沉淀。米曲霉可分泌到胞外许多水解酶,如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶,以及一些氧化酶等,使酱油产生特有的色、香、味,它的色是由于一些糖(如五碳糖)和氨基酸(如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸)的一些基团与氨基置换或氧化反应,产生的一些类黑色素。香气主要成分是4-乙基愈创木酚和4-羟基-2乙基-5甲基呋喃酮等。此外,还有醇、醛、酯和有机酸成分产生的。它的味主要是氨基酸,特别是谷氨酸,其次是缬氨酸、天冬氨酸等,如每100ml日本万家酱油含有1270mg谷氨酸,我国的一级酱油含500mg谷氨酸,三级酱油含260mg谷氨酸。
本实验用聚酰胺薄层层析,在乙酸溶液中展层,再用茚三酮显色,以标准谷氨酸为对照,观察不同酱油中的氨基酸的含量变化,在一定程度上它反应了酱油的质量。聚酰胺薄板是由聚合是氨基己酸[H2N(CH2)5COOH],俗称尼龙6,或聚合的己二胺[H2N(CH2)6NH2]和己二酸[HOOC(CH2)4COOH],俗称尼龙66,用甲酸溶解,均匀涂在胶片片基上而成。样品在乙酸溶液中展层,由于不同分子极性不同,分配层析速度和位置不同而分开。展层后,谷氨酸的位置靠近前沿。可看到不同品质酱油中谷氨酸含量不同,学生可自取家中酱油,相互比较产品的质量。
二、实验目的
了解茚三酮测定氨基酸含量的原理及方法。
三、实验材料与仪器
1、实验材料:燕京酱油,李锦记老抽,海天老抽,加加老抽,美味鲜酱油。
2、实验器材:烧杯、培养皿、聚酰胺薄膜、移液器、吸头、一次性手套
四、试剂配制
(1)茚三酮溶液:取100mg茚三酮,用10ml乙二醇甲醚溶解,溶液在暗处保存。
(2.)标准谷氨酸钠溶液:取10mg谷氨酸钠溶至1ml水中。
(3.)展层剂:水:冰乙酸(V/V)=20 : 0.3
(4)酱油:按1:30稀释
五、实验前准备
主要仪器:喷壶25个/班,1个/组;吹风机25个/班,1个/组
辅助仪器:烧杯25个/班,1个/组;培养皿25个/班,1个/组
耗材:聚酰胺薄膜25张(8*8cm)/班,1张/组;吸头-10ul 125个/班,5个/组;一次性手套25双/班,1双/组
药品试剂:展层剂4200ml/班,168ml/组;茚三铜溶液250ml/班,10ml/组;标准谷氨酸溶液5ml/班,0.2ml/组
六、实验方法及步骤
1. 取1张8×8cm的聚酰胺薄膜,在不光滑的面上,在距一边1cm的位置上,相隔1.5cm用玻璃毛细管(或用10ul移液器枪头)取不同种的酱油及标准氨基酸分别点样,点样直径不超过1.5mm。等第一次点样风干后,再点第二次,共点样两次。
2. 在烧杯中加入展层剂。展层剂乙酸溶液高度不超过0.8cm。将点样的聚酰胺薄膜放在烧杯中展层。展层时,烧杯上盖上培养皿,使展层剂不易扩散至室内空气中,且在容器内形成溶剂的饱和蒸气压。当展层剂前沿接近薄膜边缘时取出,用热风吹干。
3. 将茚三酮溶液喷至薄膜上(或将少量茚三酮溶液倒入小培养皿中,展层后的薄膜速浸速取),再用热风吹干。观察蓝紫色斑点,即为酱油中不同种的游离氨基酸。
七、实验结果与分析

1.1号为谷氨酸钠标准溶液,2-7号为酱油样品。照片中出现蓝紫色斑点处即为谷氨酸聚集处。
2.由图片可以看出,样品中4号颜色最深,其中所含的谷氨酸钠也应是最多,其他含量由多至少依次是7,5,3,2,6。
八、注意事项及改进
1.点样时的面积一定不可太大,因此可以定量点样,每次取4微升点样,可以避免出现这种情况。
2.展层时要密闭展层容器,以免展层剂挥发影响实验效果。
3.要等到展层液接近薄膜边缘时再取出。
4.聚酰胺薄膜浸入茚三酮溶液的时间要短,否则氨基酸会溶在茚三酮溶液中无法显色。
5.吹干时,要垂直吹干,否则会出现氨基酸飘移的现象。
6.茚三酮有毒,实验中要注意不要直接接触皮肤。
7.为了避免手直接碰触聚酰胺薄膜而影响试验结果,在试验过程中要戴一次性手套。
8。点样量大时有‘拖尾’现象;点样量小又会层析物质颜色太淡。因此,可在试验中选择合适的点样量。
九、问题与讨论
1.在生物化学中各种层析基于哪三种原理,它们是:
A.分配层析 B. 吸附层析
C.交换层析 D. 逆流层析
E.电子层析 F. 柱层析
答:A、B、C
2.亲和层析在原理上应属于哪一类层析?
A.专一的离子交换层析 B.专一的吸附层析
C.专一的分配层析 D.与载体吸附
E.与配基吸附 F.与臂吸附
答:B、E
3. 用于蛋白质凝胶电泳后,多用考马斯兰染色,在用有机溶剂脱色后,有色的有机溶剂溶液若从新用于脱色,需将染料从有机溶剂中去除,用下述什么柱过滤可将染料吸附?
A.硅藻土 B.活性炭
C.人造沸石 D.Sephadex G-25
答:B
4.在薄层析中表明某物质从起始点(原点)移动到达的位置有一个测定值叫比移值(Rf值).Rf值定义为:
A.展层后某物质(斑点)所在位置的中心与起始点间的距离/起始点与溶剂前沿间的距离
B.起始点与溶剂前沿间的距离/展层后某物质(斑点)所在位置的中心与起始点间的距离
C.斑点中心与溶剂前沿的距离/起始点与溶剂前沿的距离
D.起始点与溶剂前沿的距离/斑点中心与溶剂前沿的距离
答:A
5.影响Rf值的因素有:
A.溶剂的性质 B.溶剂的组分 C.介质的性质
D.介质的厚度 E.层析室溶剂的饱和度
F.样品中杂质的多少 G.展层的距离 H.上样量
I.温度 J.展层剂pH值
答:A—J.
十、建议课时安排
实验完成需要35min,建议1个课时。

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