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实时定量PCR实验故障排除


实时定量 PCR 实验故障排除 扩增曲线

原始数据

Spectra:各波长的原始信号

没有标准曲线

没有标准曲线

没有扩增曲线

原始数据只有 1 个循环 Spectra

只有 1 个循环的数据原因: 1.收集数据的步骤只有一个循环,只收集了一个数据点 2.电脑为了节省电源而休眠,通讯中断,1 个循环后的数据丢失

原因 1:PCR 参数设置错误

原因 2:硬盘休眠

从原始数据找原因 从第 1-第 9 个循环,ROX 的信号升高并逐渐下降。 在所设定的 4-13 基线范围内,ROX 信号值是变化的,而 FAM 的信号值基本上是固定的,经过 FAM/ROX 的校正后,比值自然不相等,所以基线不是水平的直线,而有下滑部分。 ROX 的信号变化与所用试剂的质量有关。 应该取 10-20 为合理的基线范围。

解决方法 修改基线范围为 10-20,重新分析。

重新分析的结果 基线范围取 10-20,重新分析后的图谱。 第 1-9 循环的信号为负数,由于试剂质量引起。

增曲线分成两段扩增曲线断裂

原因:基线的终点大于 CT 值,

通常是因为模板 DNA 浓度偏高,CT 值< 15,而基线仍然取 3-15,

其中包含部分扩增信号,导致标准偏差偏大,阈值过高

解决方法:减小基线终点,至 CT 值前 4 个循环,重新分析数据

样品浓度跨度太大

直线扩增曲线 原因:探针部分降解

V 形扩增曲线

V 形扩增曲线

V 形扩增曲线

扩增微弱或者信号很弱

ROX 信号不稳定

扩增曲线不光滑

原因:信号太弱

解决方法 ?使用高质量的探针 ?补救方法: 1.7000 的 SDS 软件升级到 v1.1

2.关闭 ROX 校正,重新分析数据

关闭 ROX 校正的效果

ROX 帮助故障诊断(1) 现象:重复性很差

正常的原始数据

原因:盖子未盖紧,溶液蒸发

排除蒸发的数据后

ROX 帮助故障诊断(2) 现象:山坡形扩增曲线

原始数据显示有蒸发

引物二聚体 SYBR Green I?化学,Dissociation curve 试验 ?推荐措施:提高引物设计质量, 避免形成引物二聚体 ?补救措施:优化引物浓度和退火温度 ?也许:专设 80 度步骤收集信号?


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