当前位置:首页 >> 生物学 >>

实时定量PCR实验故障排除


实时定量 PCR 实验故障排除 扩增曲线

原始数据

Spectra:各波长的原始信号

没有标准曲线

没有标准曲线

没有扩增曲线

原始数据只有 1 个循环 Spectra

只有 1 个循环的数据原因: 1.收集数据的步骤只有一个循环,只收集了一个数据点 2.电脑为了节省电源而休眠,通讯中断,1 个循环后的数据丢失

原因 1:PCR 参数设置错误

原因 2:硬盘休眠

从原始数据找原因 从第 1-第 9 个循环,ROX 的信号升高并逐渐下降。 在所设定的 4-13 基线范围内,ROX 信号值是变化的,而 FAM 的信号值基本上是固定的,经过 FAM/ROX 的校正后,比值自然不相等,所以基线不是水平的直线,而有下滑部分。 ROX 的信号变化与所用试剂的质量有关。 应该取 10-20 为合理的基线范围。

解决方法 修改基线范围为 10-20,重新分析。

重新分析的结果 基线范围取 10-20,重新分析后的图谱。 第 1-9 循环的信号为负数,由于试剂质量引起。

增曲线分成两段扩增曲线断裂

原因:基线的终点大于 CT 值,

通常是因为模板 DNA 浓度偏高,CT 值< 15,而基线仍然取 3-15,

其中包含部分扩增信号,导致标准偏差偏大,阈值过高

解决方法:减小基线终点,至 CT 值前 4 个循环,重新分析数据

样品浓度跨度太大

直线扩增曲线 原因:探针部分降解

V 形扩增曲线

V 形扩增曲线

V 形扩增曲线

扩增微弱或者信号很弱

ROX 信号不稳定

扩增曲线不光滑

原因:信号太弱

解决方法 ?使用高质量的探针 ?补救方法: 1.7000 的 SDS 软件升级到 v1.1

2.关闭 ROX 校正,重新分析数据

关闭 ROX 校正的效果

ROX 帮助故障诊断(1) 现象:重复性很差

正常的原始数据

原因:盖子未盖紧,溶液蒸发

排除蒸发的数据后

ROX 帮助故障诊断(2) 现象:山坡形扩增曲线

原始数据显示有蒸发

引物二聚体 SYBR Green I?化学,Dissociation curve 试验 ?推荐措施:提高引物设计质量, 避免形成引物二聚体 ?补救措施:优化引物浓度和退火温度 ?也许:专设 80 度步骤收集信号?


相关文章:
实时定量PCR
实时定量PCR - 实时定量 PCR 用于基因的定量分离 前言:目前许多关于定量 PCR 的实验报道证实了定量 PCR 由一门实验技术向科学研究的大的方向的转变。...
核酸提取PCR荧光定量PCR常见问题解答
核酸提取PCR荧光定量PCR常见问题解答_医学_高等教育_教育专区。核酸提取、PCR、...相对定量的方法各有优缺点, 主要取决于实验的目的和材料的准备。 如果是材料...
分子实验问题和对策二(荧光定量PCR)
分子实验问题和对策二(荧光定量PCR) - 二、荧光定量 PCR 常见问题及解决对策 1. 无 Ct 值(信号)出现 1.1 反应循环数不够: 一般都要在 35 个循环以上,可...
实时荧光定量PCR
实时荧光定量 PCR 一、两个概念 RT-PCR:国际上约定俗成的是指 Reverse ...常规的 PCR-ELISA 法只是定 性实验,若加入内标,作出标准曲线,也可实现定量...
实时定量PCR完全手册
实时荧光定量PCR具体实验步... 4页 1财富值 免疫荧光化学技术g 112页 2财富值如要投诉违规内容,请到百度文库投诉中心;如要提出功能问题或意见建议,请点击此处进行...
荧光定量pcr结果分析
荧光定量pcr结果分析_生物学_自然科学_专业资料。如果有标准曲线,按照标准曲线...也就是说实验组的加样量是对照组的 2 倍。 基因 A: delta CT=20-18=2...
荧光定量PCR步骤【2014-12-24】
荧光定量PCR步骤【2014-12-24】_生物学_自然科学_专业资料。荧光定量 PCR 步骤...4.分装 按实验要求, 可将配制的培养基分装入三角烧瓶内, 分装过程中注意不要...
实时定量PCR技术及其应用
实时定量PCR技术及其应用 - 实时定量 PCR 技术及其应用 实时定量 PCR 技术及其应用 2004 年 5 月 28 日 姓名:肖云刚 学号:12002244128 (宁夏大学生命科学学院...
荧光定量PCR
2. 实时定量 PCR 扩增?? 本试验应用 CFX96TM?Real-Time PCR Detection System 扩増仪 的操作方法。使用 TaKaRa SYBR⑧Premix Ex TaqTMⅡ(TLi RNaseH Plus)...
ABI 7300 Real Time PCR System 实时荧光定量PCR分析系统
ABI 7300 Real Time PCR System 实时荧光定量PCR分析系统_畜牧兽医_农林牧渔_...2.2 关掉电脑,关闭 PCR 仪器的电源开关。 二、程序文件的设置及打开 1、实验...
更多相关标签: