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第八讲 生物制品(已)


第七讲 生物制品
一、 生物制品的基本概念
指用微生物(包括细菌、噬菌体、立克次 体、病毒等)、微生物代谢产物、动物毒素、 人或动物的血液或组织等经直接加工或用现代 生物技术方法制成,作为预防、治疗、诊断特

定传染病或其他有关疾病的免疫制剂。

二、生物制品的分类(根据所用材料)

1、菌苗: 由

有关细菌、螺旋体制成。

2、噬菌体: 由特定宿主菌的噬菌体制成。
3、疫苗: 由有关立克次体、病毒制成。P272

立克次体(Rickettsia)
? 是一类严格细胞内寄生的原核细胞型微生物, 在形态结构、化学组成及代谢方式等方面均 与细菌类似:具有细胞壁;以二分裂方式繁 殖;含有RNA和DNA两种核酸;由于酶系不完 整需在活细胞内寄生;对多种抗生素敏感等。 ? 对人类致病的立克次体科包括立克次体属、 柯克斯体属和罗沙利马体属等三个属。

减毒疫苗:经减毒处理的病毒或细菌
灭活疫苗:经化学处理的病原体

第 一 代

疫 苗 种 类

亚基疫苗:用病原体的某一部分经克隆而成 活体重组疫苗(纯化疫苗) 核酸疫苗:DNA疫苗和RNA疫苗

第 二 代

第三代

4、抗血清与抗毒素 :经特定抗原免疫动物后,

采血、分离血浆或血清制成。

抗血清:抗细菌和病毒的制品
抗毒血清:抗蛇毒和其它毒液的制品

抗毒素:抗微生物毒素的制品

5、类毒素:由有关细菌产生的外毒素 白喉类毒素 破伤风类毒素 肉毒类类毒素 葡萄球菌类毒素

白 膜

白喉杆菌

肉毒杆菌是一种生长在缺氧环境

下的细菌,在罐头食品及密封腌渍
食物中具有极强的生存能力,其分 泌毒素是目前毒性最强的毒素之一。 人们食入和吸收这种毒素后,神经 系统将遭到破坏,出现头晕、呼吸 困难和肌肉乏力等症状,能使肌肉 暂时麻痹 。

肉毒杆菌

医学界原先将该毒素用于治疗面
部痉挛和其他肌肉运动紊乱症,用 它来麻痹肌肉神经,以此达到停止 肌肉痉挛的目的。可在治疗过程中, 医生们发现它在消除皱纹方面有着 异乎寻常的功能,其效果远远超过 其他任何一种化妆品或整容术 。

肉毒杆菌素在医学美容上,广泛的应用于下面各种问题:

1 、除去皱纹 2、改变眉型 3、瘦脸 4、瘦腿 5、止汗 6、颜面抽搐

注射肉毒 杆菌素的 费用大约 是一次 3000元左 右。

6、混合制剂:由两种以上菌苗或疫苗或类毒素混合制成。

联合细菌 联合病毒 细菌和类毒素混合制剂

百白破三联疫苗(DPT)
? 百日咳杆菌引起的急性呼吸道传染病。 表现为阵发性痉挛性咳嗽、鸡鸣样吸气 吼声为特征。病程可长达2~3月,故名 百日咳。百日咳俗称鸡咳、鸬鹚咳。 ?

麻风腮三联疫苗(MMR)
? 麻疹:由麻疹病毒引起,以发热、上呼吸道炎症、眼 结膜炎等而以皮肤出现红色斑丘疹和颊粘膜上有麻疹 粘膜斑及疹退后遗留色素沉着伴糠麸样脱屑为特征。

风疹(rubella,German measles)又称“风痧”,痧子等 。是 儿童常见的一种呼吸道感染。由于风疹的疹子来得快,去 得也快,如一阵风似的,“风疹”也因此得名。风疹病毒 在体外生活力很弱,传染性与麻疹一样强。一般通过咳嗽、 谈话或喷嚏等传播。

7、血液制品 :由人或动物的血液分离提取制成。

冻干人血浆:正常人血浆 ,冻干健康人血浆

白蛋白:维持胶体渗透压
球蛋白:球蛋白正常值为20-30 g/L。 纤维蛋白原:具有凝血功能的蛋白质 超免疫球蛋白类

预防类制品

根据用途分

治疗类制品

诊断类制品

三、生物制品的免疫学基础
推动现代生命科学前进的三架马车 分子生物学(Molecular Biology) 免疫学(Immunology) 细胞生物学(Cell Biology)

(一)基本概念:
1、免疫:系指机体对感染有抵抗能力,而不患疾病 或传染病。 组织和器官 细胞

活性分子

淋巴组织 骨髓 (1)免疫系统 中枢淋巴器官 胸腺

淋巴器官
淋巴结 外周淋巴器官 脾 扁桃体

(2)免疫细胞
粒细胞(中性、嗜酸性、嗜碱性) 单核-巨噬细胞、

髓系祖细胞

巨核细胞
树突状细胞

造血干细胞

红细胞的母细胞 T细胞 淋巴系祖细胞 B细胞

NK细胞
部分树突状细胞

2、免疫类型
(1)先天性(非特异性)免疫:皮肤、粘膜屏 障,细胞分泌抑菌、杀菌物质,吞噬细胞、

NK细胞、补体作用。
(2)获得性( 特异性)免疫 :针对某一特定

抗原物质而起作用,具有特异性。

人工免疫
人为地给机体输入抗原以调动机体的免 疫系统,或直接输入免疫血清,使获得某种特 殊抵抗力,用以预防或治疗某些疾病者,称为 人工免疫 。 有两种人为方式,可使机体获得有效的免 疫力,即自动免疫和被动免疫。

(1)人工自动免疫
是给机体输入抗原物质,使免疫系统因抗

原刺激而发生类似感染时所发生的免疫过程,
从而产生特异性免疫力。

用于人工自动免疫的抗原性制剂,大部分
用病原微生物直接制成称为疫苗;亦可取微生

物毒素去毒而制成,称为类毒素。

(2)人工被动免疫
输入免疫血清(含特异性抗体)使机体

获得一定免疫力,以达到防治某些疾病目的者, 称为人工被动免疫 。 输入特异性抗体后,可立即发挥免疫作用。 但由于免疫力的产生不经自身免疫系统,因此

维持时间常较短暂。

(二)免疫机制

体液免疫
免疫应答

细胞免疫

B细胞

增殖

分化

浆细胞
IgA

抗原

细胞生长因子 分泌抗体

IgM IgG IgD IgE 细胞毒性T细胞 杀死

T 细胞

增殖

分化
记忆细胞

四、 生物制品的一般制备方法
(一)疫苗制造方法 1、毒种的选择和减毒: (1)毒种必须持有特定的抗原性,能使机 体诱发特定的免疫力。 (2)毒种应有典型的形态和感染特定组织 的特性,并在传代过程中,能长期保持其生 物学特性。

(3)毒种易在特定的组织中大量繁殖。 (4)不产生神经毒素或能引起机体损害 的其它毒素。

(5)无原致病力的现象。
(6)不被其他病毒所污染。

2、病毒的繁殖

所有动物病毒,只能在活细胞中繁殖。若需
大量繁殖,首先要寻找能受感染的活细胞。在 通常的情况下,病毒可用下列几种方法繁殖。 (1)动物培养 使之在相应的细胞内繁殖。接种动物的种类、 年龄和接种途径依病毒的种类而异。

将病毒接种动物的鼻腔、腹腔、脑腔或皮下,

(2)鸡胚培养 将病毒接种到7~14日龄鸡胚的尿囊 腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜等处;接种的 部位亦因病毒种类的不同各异。

鸡 胚
? 鸡胚就是鸡的胚胎,是研究动物发育的重 要模型,已被大量用于发育生物学的研究。 对鸡胚的研究可以追溯到古希腊著名的博 物学家亚里士多德,之后被很多生物学家

予以深入的研究。现在对鸡胚发育的过程
已有清楚的了解和认识。鸡胚在疫苗的开

发和研究中有着不可替代的作用。

鸡胚培养实验用器械
? 孵化箱: 是给受精卵提供发育条件的设备,要 求恒温恒湿。市售专用孵化箱可自动进行气体交 换和翻蛋。实验室中,常用普通恒温培养箱或恒 温室代替,要注意保持室内湿度和人工翻蛋。
检卵器: 有市售专用检卵器,在暗室中操作。也可根据条 件向行设计,用木板制成一大小为 35 × 25.5 × 15 厘米的 木盒,上半层为一暗室,上方开一小孔,以便于用眼检视 鸡胚,两侧开大孔以供双手伸入小暗室转动鸡胚蛋和进行 标记。木盒中间有一隔板,其中间部位开一卵形圆孔,木 盒下层安装有 100 瓦灯泡,待检胚蛋置于卵形孔上。开灯 检查,不必在暗室中进行。

? 打孔器: 可用剪刀代替 . ? 卵 架: 孵育用盛放鸡胚蛋的卵盘,有市 售专用者,实验操作中所用卵架可用木 板制成小方盒,上面开一卵形孔。

技术人员正在无菌车间内将活病毒接种到鸡
胚中进行活病毒繁殖 。
禽流感灭活疫苗的生 产是通过将病毒接种 在鸡胚中,经过温室 培养,从鸡胚中吸取 活病毒,再经过灭活 处理之后形成禽流感 灭活疫苗半成品,通 过效价检验之后,经 过乳化工艺即可成为 禽流感灭活疫苗成品 供应市场。

接种鸡胚
? 常用不含有母源抗体的 9~11 日龄的鸡胚将处理过的材料 0.1~0.2 毫升接种于鸡胚尿囊腔内,并继续孵育。每日照蛋

二次,连续 5 日。接种 24 小时以后死亡的鸡胚,放 4 ℃ 冰
箱,气室向上,冷却 4 小时以上。然后无菌收获尿囊液,

并做无菌检查。浑浊的尿囊液应弃去。留下无菌的鸡胚液
放低温冰箱保存以供进一步鉴定。在收获毒液的同时,检 查鸡胚病变。由病毒致死的鸡胚,整个胚体充血,在头、 胸、背、翅、和趾部有小点出血,尤以翅和趾部明显。

技术人员正在无菌车间内对即将接种活病

毒的鸡胚进行消毒。

技术人员在无菌车间内从培养活病毒的鸡

胚内抽取活疫苗。

鸡胚装片
a.当孵化第一天,染色较深的一端为头部,染
色较浅的一端为尾部。血岛、脊索原基、神经

板。体节出现1—3对。
b.48小时鸡胚装片 : 颈曲、背曲,脑已分化为前、中、后脑三部分。 体节已发展到16—23对。视、听囊出现,心脏 开始搏动。胚盘血管已形成并与体内建立了联

系。胚体长度达9—12毫米。

c.72小时鸡胚装片:

脑已清楚地分为五个部分;体节数达33对左右。
前、后肢芽出现,鳃弓具有5对。尿囊出现。 d.96小时鸡胚装片 : 头部显著增大,大脑半球明显。眼发育极快,眼 内色素沉着,眼球明显。鳃弓和鳃囊开始模糊不

清,全部体节约50对左右。心脏发育已近似成体
心脏。胚体已极度弯曲,大脑半球与前肢芽几乎

和尿囊接触。

(3)组织培养
从20世纪50年代开始,组织培养已广泛用于病毒

培养。目前,差不多所有人类和动物的组织都能在
试管中培养。

(4)细胞培养
①原代细胞培养:将动物组织进行一次培养而不再 传代;常用的细胞有猴肾细胞、地鼠肾细胞和鸡胚 细胞等。 ②传代细胞培养:用长期传代的细胞株,常用的有

人胚肺二倍体细胞、非洲绿猴肺细胞等。

3、疫苗的灭活 灭活原则是要以足够高的温度和足够长的 时间破坏疫苗的毒力,而以尽可能的最低温度

和最短时间来尽量减少疫苗免疫力的损失。
不同的疫苗,其灭活的方法不同,有的用

甲醛溶液 ;有的则用酚溶液 ;灭活温度和时间,
需视病毒的生物学性质和热稳定性质而定。

4、疫苗的纯化
疫苗纯化的目的,是去除存在的动物组织, 降低疫苗接种后可能引起的不良反应。用细胞

培养所获得的疫苗,因动物组织量少,一般不
需特殊的纯化,但在细胞培养的过程中,得用 换液的方法除去培养基中的牛血清。

5、冻干 目的是为了提高疫苗的稳定性,利于 在室温下运输。一般地,疫苗在2-8℃下 能保存12个月,在37 ℃下,只能稳定几

天或几小时。为此,用冻干法使之干燥:

冻干法的操作步骤
(1)先将疫苗冷冻至共熔点以下;
共熔点: 水有一个固定的结冰点,而溶液却不一样, 它不是在某个固定的温度时完全凝结成固体,而是 在某一温度时晶体开始析出,随着温度的下降,晶 体量不断增加,直到最后溶液才全部凝结。当冷却 时,开始析出晶体的温度称溶液的冰点,而溶液全 部凝结的温度叫凝固点。因为凝固点就是熔化的开 始点(熔点),对于溶液来说,则是溶质和熔媒 (剂)共同的熔化点,所以叫共熔点。

一般来说,冻干产品的溶液是由主要功能组分(如药用
成分)、多种添加组分(如抗氧化剂、填充剂等)和蒸馏水 混合而成的胶体悬浮液。它与一般溶液不完全相同,具有一 系列的低共熔点温度。对于冻干加工来说,需要确定一个较 高的安全操作温度,使得在该温度以上时,产品中存在未冻

结的液体,而低于该温度时,产品将全部冻结,这个温度就
是冻干产品的共熔点温度。

共熔点温度:它是溶液完全冻结固化的最高 温度。对于溶液来说,冻结固化点就是熔化 开始点,所以也称为共熔点。

(2)在真空下将水分直接由固态升华为气态;

(3)再缓慢升温,避免疫苗融解,直至完全干燥;

(4)冻干的疫苗在真空或充氮后密封保存, 残留水分﹤3%。

(二)菌苗类制品和类毒素的制造方法
菌苗类制品和类毒素的制备,均由细菌 培养开始,但前者是用菌体作为进一步加 工的对象,而后者则对细菌所分泌的外毒 素进行加工。

一般工艺流程

类毒素的制造方法(以白喉类毒素为例)

白喉类毒素是一种用于预防白喉病的自动免疫制
剂,是由产毒力高的白喉棒状杆菌培养,滤液经福尔

马林脱毒后精制(或精制后脱毒)而成,通常是制成
吸附制剂或与其他预防制剂配成混合制剂使用。 1、菌种及培养基 国际上产毒最著名的菌种为第8号菌株(PW8), 我国目前采用PW8 Weissenee亚株 . 2、培养:

3、脱毒:
白喉类毒素经脱毒即成为无毒、但仍保持高度抗原

性的类毒素。
(1)温度:温度越高脱毒越快,且脱毒越完善,但 (2)pH:pH越高脱毒越快,但碱性过强对抗原性有 很大破坏,故PH在7.0±7.5较为适宜。 (3)甲醛浓度:甲醛浓度越高脱毒越快,但甲醛浓 度过高时脱毒后残余甲酸量过高,对抗原性有损害,

超过40℃对抗原性有很大破坏,一般多采用34~39℃。

并会引起注射时的强烈刺痛,0.1-0.3%为宜。

(4)含氮量:毒素含氮量越高脱毒时所需甲醛量 越大,按毒素氨基氮含量加适量甲醛脱毒,既能脱 毒完善,又避免过多的残余甲醛量损坏抗原性。 (5)吸附 :氢氧化铝用量不得超过3mg/ml。 (6)防腐剂 :0.005%~0.01%(g/ml)的硫柳汞(硫
汞柳酸钠、乙汞硫水杨酸钠 C9H9O2HgNaS )。

五、生物制品质量要求
世界卫生组织要求各国生产的制品出须有专门 检定机构负责成品的质量检定,检定部门要有熟练 的高级技术人员,精良的设备条件,以保证检定工 作的质量。未经专门检定部门正式发给检定合格证 的制品,不准出品使用。

安全性检定 检定 效力检定(有效)

毒性试验
安 全 性 检 定 防腐剂试验 热原质试验 安全试验 有关安全性的特殊试验

热原质

毒素

内毒素
细菌代谢 G-细菌细胞壁 中的脂多糖

外毒素

合成的多糖

脂多糖

蛋白质

浓度测定(含菌数或纯化抗原量) 活菌率、或病毒滴度测定

效 力 检 定

动物保护率试验 免疫抗体滴度测定 稳定性试验

(一)理化性质检定
生物制品中的某些有效成分和不利因素,需要通过 物理化学和生物化学的方法才能检查出来,这是保 证制品安全和有效的一个重要方面。
1、物理性状的检查

(1)外观
(2)真空度及溶解速度

(3)装量

2、蛋白质含量测定 ①凯氏定氮法 ②双缩脲法|

③酚试剂法(Lowry氏法) ④紫外吸收法

3、纯度检查及鉴别试验
血液制品、抗毒素和类毒素等制品,需要进行

纯度检查或做鉴别试验,为此,常用区带电泳、免
疫电泳、凝胶层析、超速离心等技术进行分析。

4、分子量或分子大小测定

凝胶层析法、超速离心分析法等。
5、防腐剂含量测定 生物制品在制造过程中,为了脱毒、灭活或 防止杂菌污染,常加入苯酚、甲醛、氯仿、硫柳 汞等试剂作为防腐剂或灭活剂。

(二)安全试验
预防或治疗用的生物制品,在生产过程中须进 行安全性方面的系统检查,排除可能存在的不安全 因素,以保证制品用于人体时不致引起严重反应或 意外问题。 菌毒种或主要原材料的检查 半成品(包括原液)的检查 成品检查

1、外源性污染的检查
(1)野毒检查:检查外来病毒

(2)热原质试验:引起致热反应的物质
(3)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)检查

2、杀菌、灭活和脱毒情况的检查 (1)无菌试验 :选择适合生产菌种 生长的培养基。 (2)活毒检查:小白鼠检查灭活疫苗情况 (3)解毒试验 :检查类毒素等的脱毒情况

3、残余毒力和毒性物质的检查
(1)残余毒力试验
(2)无毒性试验(一般安全试验 ): 用大剂量注射试验 (3)毒性试验: 用一定量剂试验是否存在有害反应 (4)防腐剂试验:小白鼠检查

4、过敏性物质的检查

(1)过敏性试验(变态反应试验)
(2)牛血含量的测定:﹤1ug/mL (3)血型物质的检测

(三)效力试验
生物制品的效力,从实验室检定来讲, 一是指制品中有效成分的含量水平,二是 指制品在机体中建立自动免疫或被动免疫 后所引起的抗感染作用的能力。对于诊断 用品,其效力则表现在诊断试验的特异性 和敏感性 。

1、免疫力试验
将制品对动物进行自动(或被动)免疫后,用活菌、 活毒或毒素攻击;从而判定制品的保护力水平。

2、活菌数和活病毒滴度测定
3、类毒素和抗毒素的单位测定

4、血清学试验
5、其它有关效力的检定和评价

(1)鉴别试验
(2)稳定性试验

(3)人体效果观察

复习思考题
一、名词解释 :

生物药物、工程细胞、工程菌、抗生素、
抗菌谱、生物制药、生物制品、生化药物、

转基因植物、差异毒力、细胞工程制药、
四环类抗生素、基因工程制药、累计产率、

共熔点、类毒素、亚基疫苗

二、简答题 :
1、简述生物药物的特性。

2、试述生物药物的类型。
3、简述制备生物药物的生物原料。 4、简述抗生素的生产工艺 。 5、试述生物药物质量检验的基本程序。 6、药物的ADME中的字母各代表什么意思? 8、简述四环素的提取与精制过程。

7、试述生化制药过程中对生物材料进行预处理的方法 。 9、药物质量的三级标准指哪些?

10、简述β-内酰胺类抗生素的基本结构 。

11、试述青霉素的降解反应过程。
12、简述医疗用抗生素应具备的条件。

13、试述抗生素的作用机制。
14、简述四环类抗生素的常见种类。 15、简述四环类抗生素的化学性质。 16、试述疫苗的制备方法。 17、疫苗有哪些种类? 18、根据所用的材料,生物制品分有哪些类型?


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