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茶树自交花粉管在活体花柱中的不亲和性观察[1]


茶 叶 科 学 2008,28(6) :429~435 Journal of Tea Science

茶树自交花粉管在活体花柱中的不亲和性观察
王郁,江昌俊 *,张和禹
(安徽农业大学教育部农业部茶叶生物化学与生物技术重点实验室,安徽 合肥,230036)

摘要:采用以苯胺蓝染色的荧光显微技术对茶树无性系品种龙井 43 活体花柱上(中)的自交和异交花粉(管) 生长特性进行观察。结果发现,自交花粉可以在柱头上正常萌发生长;授粉后 24 h 内自交与异交花粉管生长 特性无明显差异,24 h 之后自交花粉管生长速度明显慢于异交,最后在花柱基部停止伸长,且伴随产生花粉管 顶端形态异常,荧光异常明亮等不亲和(受抑制)现象。由此进一步证实茶树自交花粉管生长受抑制的形态学 表现与植物配子体自交不亲和性类型特征相符合。 关键词:茶树;自交不亲和性;花粉管;荧光;自交 中图分类号:S571.1;Q944.56 文献标识码:A 文章编号:1000-369X(2008)06-429-07

Observation on the Self-incompatibility of Pollen Tubes in Self-pollination of Tea Plant in Style in vivo
WANG Yu, JIANG Chang-jun*, ZHANG He-yu
(Key laboratory of Tea Biochemistry & Biotechnology,Ministry of Education & Agriculture,Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)

Abstract: Germination of pollens and growth of pollen tubes were observed in vivo after self- or cross-pollination in the style of clonal tea cultivar Longjing43 using fluorescence microscopy by aniline blue staining. The results showed that pollens in self-pollination germinated normally, and it was the same as that in cross-pollination. There was no significant difference in growth characteristics of pollen tubes between self- and cross-pollination during 24 hours after pollinating,but thereafter the growth speed of pollen tubes in self-pollination was slower than that in cross-pollination and was finally stoped in the style base, and meanwhile there were some incompatibility-phenomenons that the form of pollen tube apex was abnormal and fluoresced more obviously. It was suggested that the inhibited morphological manifestations of pollen tubes in self-pollination accorded with the characteristics of floral gametophytic self-incompatibility. Keywords: tea plant(Camellia sinensis), self-incompatibility, pollen tube, fluorescence, self-pollination

茶树(Camellia sinensis)是异花授粉的 多年生木本植物,在有性生殖过程中存在自交 不亲和性(Self-incompatibility,SI) ,即植物 自花授粉后花粉在花柱 上的萌发或花粉管在 花柱内的生长受到抑制, 不能完成受精产生种
收稿日期:2008-03-27 修订日期:2008-07-07

子。 这种许多显花植物中普遍存在的现象是植 物在长期进化过程中形成的一种促进异交, 保 持遗传变异,避免自交,防止近亲繁殖,从而 能保证物种连续性的一种重要机制 [1] 。关于植 物自交不亲 和性的分子机理近年来 一直是国

基金项目:安徽省教育厅自然科学研究计划重点项目(2004kjl37zd) 作者简介: (1983— ) 女, 王郁 , 硕士研究生, 河南开封人, 主要从事茶树遗传育种与分子生物学的研究。 *通讯作者: jiangcj@ahau.edu.cn

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内外研究的热点之一,在十字花科、茄科、蔷 薇科、玄参科、罂粟科等植物中已取得很大进 展,并在生产领域中获 得了一定的经济效益
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心去雄授粉,作为对照异交使用嘉茗 1 号花 粉。 授粉后分别经不同时间段沿花柱与子房连 接处切下花柱,投入卡诺固定液(无水乙醇: 冰醋酸=3:1) 中固定 2 h 以上, 然后转入 70% 酒精中保存。 1.3 制片观察 参照胡适宜的苯胺蓝染色制片法 [8],但调 整花柱软化时间,经 0.1%苯胺蓝溶液(用 0.1 mol/L K 2HPO3 溶液配制)染色后用解剖针将 花柱纵向剖开,平展开两边外表皮,以 30% 甘油封片,置于落射荧光显微镜(L2001A 型, 上海浦东物理光学仪器厂)下进行观察,每个 处理观察 10 根以上花柱并显微拍摄。

。目前,对茶树自交不亲和性的研究还处于

起步阶段,相关报道也很少。茶树作为一种重 要的经济作物, 在这方面的探索将有利于茶树 种质资源创新、 品种改良、 杂交优势的利用等, 且有望解决一系列育种及生产实践问题, 为茶 叶品质提高和产量增加 等方面提供一定的科 学依据和奠定重要的理论基础 [3~5] 。 近年来研究普遍认为, 自交不亲和现象是 花柱内存在自交不亲和性相关基因(s 基因) 的表达产物,与自交花粉(管)进行识别反应 后,抑制其萌发或生长使受精过程受阻,但不 影响异交花粉(管)的正常发育 [1]。根据这种 花粉自交不亲和表型的 遗传控制方式不同可 以将植物自交不亲和性分为配子体型 (gametophytic SI, GSI)和孢子体型(sporophytic SI,SSI) [1,6]。正确判定茶树的自交不亲和性类 型及地位将有利于其分子机理的深入研究。 苯 胺蓝能 够与花粉 管壁中的 胼胝质 相结 合,在紫外光下呈现明亮黄绿色荧光,可将花 柱中的花粉管有效标记出 [7] 。为首先探明茶树 自交花粉管被抑制的生理现象, 本实验采用苯 胺蓝为荧光指示剂的荧光显微技术, 以异交作 为对照, 从形态学角度观察了自交花粉管在活 体花柱中的生长特性及不亲和 (被抑制) 现象。

2 结果与分析
2.1 茶花花柱的结构特征 茶花花柱一般开裂, 因品种不同花柱的长 度,开裂程度等有差异,以龙井 43 为例,花 柱平均长度为 1.2 cm,柱头三裂,分枝点(花 柱开始分裂处) 在花柱由基部向上约 2/3 处 (图 1) 。茶花柱头为湿性柱头,顶端紧密排列无数 乳突状细胞,能够分泌粘液诱导花粉萌发。与 分裂的三个柱头相对应, 花柱柱腔内有三条单 独的沟状通道(简称花柱道) ,衬在花柱道的 沟 内 壁 引 导 组 织 (由 通 道 细 胞 组 成 )在 分 枝 点 以上的部分无明显胞间隙, 分枝点以下通道细 胞细长且胞间隙明显(图 2) 。 2.2 自交花粉在活体柱头上的萌发情况 授粉后 2 h,自交花粉在柱头上可以正常 萌发长出花粉管(图 3-c) ,并伸长进入柱头上 的乳突细胞组织中,这与异交 2 h 时的花粉萌 发情况相似, 且两者花粉的萌发速率也无明显 差异(图 3-a 和 b) 。这说明在柱头上自交花粉 能正常萌发,生长未受到抑制。 2.3 自交花粉管在活体花柱内受抑制的表现 正常情况下, 茶花花粉落在柱头上吸水萌 发,长出花粉管穿过乳突细胞组织后,沿 A

1 材料与方法
1.1 材料 以 安徽农 业大学茶 树品种园 中无性 系龙 井 43 为试材, 异花授粉父本品种为嘉茗 1 号, 于 2007 年 11 月份采集带蕾健壮枝条, 疏蕾疏 叶, 每根枝条上只留 1~2 个呈乳白色含苞欲放 花蕾;枝条基部剪成斜面清水培养,置于无昆 虫干扰,透气无风的向阳室内。 1.2 授粉处理 枝条采集培养的第二天上午茶花初开, 小

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区引导组织向下伸长, 穿过分枝点后依然在 B 区各自花柱道内的引导 组织中呈极性顶端生 长,互不干扰;直到 C 区花柱最末端,三个 花柱道中的花粉管才有所交汇进入子房。 如图 4 所示,在 24 h 之前自交和异交花 粉管的生长特性无明显差异, 在相同时间内自 交花粉管能够达到与异交花粉管同样的长度, 数量也无明显减少。但在 24 h 左右,自交与

异交花粉管的生长开始产生差异。如表 1 所 示, (1)自交花粉管在 24 h 左右生长速度开 始减慢, 而异交花粉管可以顺利到达花柱最末 端, 说明自交花粉管此时可能受到了来自花柱 引导组织的某种抑制; (2)在约 30 h 以后, 自交花粉管顶端一直处于 C 区下部,不能到 达花柱最末端, 说明花柱对其产生的抑制作用 产生了明显的效果。

表 1 授粉后不同时间段自交与异交花粉管顶端到达的花柱区域(平均值) Table 1 The area where apex of pollen tubes in the self- and cross-pollinated styles arrived in different time quantum (Average)
时间 Time 自交 Self-pollination 异交 Cross-pollination 6h A区 A区 12 h B 区上 B 区上 18 h B 区下 B 区下 24 h C 区上 最末端 30 h C 区下 最末端 36 h C 区下 最末端 42 h C 区下 最末端 48 h C 区下 最末端 54 h C 区下 最末端

在形态学方面, 无论所观察到的正常异交 花粉管还是 24 h 之前的自交花粉管(图 5-a) , 越靠近其顶端,管壁所发荧光越弱,所以花粉 管顶端区域的具体形态几乎不可见(图 5-b) ; 但 24 h 之后随着时间延长,处于 C 区的大量 自交花粉管顶端区域出现荧光异常明亮, 轮廓 可见并且形状不规则(图 5-c~f) ,这与自交花 粉管生长趋缓停止的现象在时间上是同步的, 而异交花柱中没有出现过此类现象。 由 此可以 推断自交 花粉管顶 端的这 种异 常现象应与花柱的不亲和性抑制有关。 因为花 粉管的生长方式为极性顶端生长, 其伸长依赖 于花粉管顶端细胞壁的组成及构建 [9]。未受抑 制而处于旺盛生长状态 下的花粉管顶端高度 富集含细胞壁前体的分泌小泡, 且被最新形成 的壁所包围,还未有胼胝质沉积,因此荧光弱 不易观察。 而受到抑制的自交花粉管生长趋缓 而停止,推测其顶端区 域的代谢已经出现紊 乱,新细胞壁合成减弱,沉积了大量胼胝质, 所以荧光强,甚至顶端形状也发生改变。 值得一提的是, 产生自交花粉管顶端不亲 和现象在时间上是以 24 h 左右为分界线,而 授粉后 24 h 的自交和异交花粉管一般都能伸 长到花柱 C 区。从另一个角度可以解释为,

自交花粉管在 A 区与 B 区生长正常,一旦伸 长到 C 区,就会出现生长缓慢、停止,顶端 区域异常等一系列不亲和现象。 由于花柱内的 引导组织是花粉管伸长必经的通道, 作为花粉 管营养来源与其代谢有着密切关系, 并且自交 不亲和性是花柱与花粉共同作用的结果, 因此 可以推测 C 区应是茶树花柱发生不亲和反应 的关键区域, 这部分通道细胞可能有某些特殊 功能。

3 讨论
本实 验中观察 到的茶树 自交不 亲和现象 表明: 茶树自交花粉生长受抑制的形态学表现 与配子体自交不亲和性类型特征相符合。 这印 证了 Rogers 等人 [10] 的研究结果,并且与杨美 珠等 [11] 发现的茶树自交花粉管受抑制部位在 花柱基部的结论相一致。 然而, 目前已经进行观察的配子体型自交 不亲和性的植物,如沙梨 [12] 、甜樱桃 [13] 、沙 田柚 [14] 等其自交花粉管的受抑制部位均在花 柱中上部。以烟草等为代表,研究较多的配子 体型不亲和机理认为, 不亲和性是由 s 基因编 码 产 生 的 s 等 位 基 因 专 一 性 蛋 白 S-核 酸 酶 (S-Rnase)介导的,这种具有核糖核酸酶活

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性的碱性蛋白在雌蕊识 别和拒绝自身花粉的 过程中起着重要作用 [15~17] 。茶树在形态学上 表现出与这些植物相似的自交不亲和性特征, 但自交花粉管在花柱中 的受抑制部位却与之 不同, 那么不亲和机理是否会相同还有待于以 后的深入研究。 另外, 本实验还观察到并不是所有的花柱 都能将自交花粉管彻底抑制在其基部, 还有一 少部分花柱中的自交花 粉管能够生长到其最 末端并达到子房腔, 至于这些自交花粉管的生 长动态如何还需进一步关注。

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