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蛋白质工程的现状发展及展望


蛋白质工程的现状发展及展望

摘要: 蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。 介绍了蛋白质工程的 几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词: 蛋白质工程;定点诱变; 定向进化

20 世纪 70 年代以来, 对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域, 通过对蛋白 质分子进行突变, 得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高 的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性 进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1.理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术, 通过在已知 DNA 序列中取代、插入或 缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。 运用该技术已有不 少成功改造蛋白质的例子。Markus Roth 通过同源性比对和定点突变技术, 对 EcoR DNA 甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了 22 倍。定点突变还 主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白 (ACP)的主要作用是 在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键, Caho 通过定点突变研究, 发现将五个氨 基酸残基置换之后的酶, 由 6- 16 : 0- ACP 脱氢酶变成 9- 18 : 0- ACP 脱氢酶。 Van den Burg 利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从 Bacillus stear other mophilus 分离出来的嗜热菌蛋白酶突变, 得到的突变体稳定性提高了 8 倍, 100 在变性剂存在的情况下还能发挥作用,但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋 白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构, 从而造成很大的影 响, 所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术, 用于改造蛋白质分子。[1] 2.非理性进化 非理性蛋白质进化, 又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然 进化过程, 利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性, 结合高通量筛选技 术, 使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理 想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质, 而是人为地制 造进化条件, 在体外对酶的编码基因进行改造, 定向筛选, 获得具有预期特征的 改良酶, 在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足, 具有很大的实际应用价值。 一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。 绿色荧光蛋白由于

本身独特的发光性质,被应用到细胞生物学当中, 作为体内原位跟踪蛋白质的一 个极其有效的工具。Dis cosoma 红色荧光蛋白(Ds Red)在荧光共振能量转移技术 (fluorescen ceresonance energy transfer)中可以和绿色荧光蛋白一起作用,作为研究 两种蛋白质相互作用的有效工具,但是野生型的 Ds Red 由于显色速率较慢,而且 稳定性较差,Brooke Bevis 建立随机突变文库,在 103-105 个转化子中筛选到了大 大提高显色效率的突变体, 使显色效率提高了 10-15 倍。[2] 易错 PCR 是利用 DNA 聚合酶不具有 3’ – 5’校对功能的性质, 在 PCR 扩增待 进化酶基因的反应中, 使用低保真度的聚合酶, 改变四种 dNTP 的比例,加入锰离 子并增加镁离子的浓度, 使 DNA 聚合酶以较低的比率向目的基因中随机引入突 变, 并构建突变库。Moore 等对鼠伤寒沙门菌 Salmonella typhmiurium 产生的门 冬氨酰二肽酶(aspart yldipeptidase)进行改良, 经两次易错 PCR 引入随机突变, 并 结合 DNA 改组和正向选择筛选, 得到的 pepEm3074 突变株, 其酶活力比野生菌 提高 47 倍。 DNA 改组( DNA shuffling)技术克服了随机突变的随机性较大的限制,能够直 接将多条基因的有利突变直接重组到一起, 它的原理是使用 DNase I 酶切或超声 波断裂多条具有一定同源关系的蛋白编码基因, 这些小片段随机出现部分片段 的重叠, 产生的片段在不加引物的情况下进行几轮 PCR,通过随机的自身引导或 在组装 PCR 过程中重新组装成全长的基因, 由于存在不同的模板, 使得到的全 长基因具有不同谱系之间的重组, 再进行最后一轮 PCR,加入全长引物, 扩增得 到改造过的全长基因。 利用 DNA 改组已成功进化了编码内酰胺酶、 葡萄糖苷酶、 脂肪酶、绿色荧光蛋白、烷基转移酶、苯甲基脂酶基因以及编码砷酸盐和阿特拉 津降解酶的整个操纵子。[3] 在 DNA 改组技术的基础上又发展出外显子改组 (exon shuffling)和家族改 组(family shuffling)。外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动, 而使 DNA 改组不受任何限制, 发生在整个基因片段上, 更适用于真核生物,并可获得 各种大小的随机文库。交错延伸重组 (stagger edextensi on process , StEP)是一种 简化的 DNA shuffling 方法,是在 PCR 反应中, 将含不同点突变的模板混合, 随 之进行多轮变性、 短暂复性及延伸反应, 在每一轮中, 那些部分延伸的片段可以 随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸,由于模板转换而实现不同模板间的 重组, 如此重复直至获得全长基因片段。RPR 法 (Random-Prmiing Recombi nation DNA Shuffling)是以单链 DNA 为模板, 配合一套随机序列引物, 先产生大

量互补于模板不同位点的短 DNA 片段, 由于碱基的错配和错误引发, 这些短 DNA 片段中也会有少量的点突变,在随后的 PCR 反应中, 它们互为引物进行合成, 伴随组合, 再组装成完整的基因长度。过渡模板随机嵌合(random chmiera genesis on transient templates, ACHITT)技术是改进的基因改组技术, 不包括热循环、 链转 移或交错延伸反应, 而是将随机切割的基因片段杂交到一个临时 DNA 模板上进 行排序、修剪、空隙填补和连接, 其中的悬垂切割步骤可使短片段得以重组,提高 重组的频率和密度。 发酵过程常常由于微生物对温度、pH、溶液的影响而导致产量低, 微生物的 自身调控系统十分复杂和精细, 致使单个基因的突变很难对其产生某种产物的 能力造成影响,因此, 对微生物的进化要在整个基因组的水平上进行才能起到有 效的作用, 于是出现了一种叫全基因组改组(Whole-Genome Shuffling)的技术, 它 结合了 DNA shuffling 和传统的育种技术的优点, 传统的育种技术耗时较长,经常 由于亲本的相容性不好而影响育种效果, 而且实验过程完全可以用随机突变和 筛选文库来完成, Zhang 等从能产泰乐菌素的 Streptomyces fradiae 的改造过程中 证明了这种方法可以快速改善泰乐菌素的产量,Ranjan Patnaik 比较了传统育种方 法和基因组改组技术之后, 发现乳酸菌 Lact obacillus 能在 pH4.0 的条件下产出比 野生菌株多三倍的乳酸,而传统育种方法明显没有基因组改组取得的效果好。 体外异源杂交和体内修复,这种方法首先在体外进行异源杂交 DNA 双链, 转化细菌, 在胞内完成修复, 同时产生出一种新的以亲本 DNA 为模板的杂交 DNA 文库,这是对 DNA Shuffling 等已存在的基因重组方法的补充, 特别适用于 大片段 DNA 和整个操作子的重组, 但是这种方法需要亲本基因具有极高的同源 性,而且每次重组只能进行两个亲本,这也在一定程度上限制了它的应用。[4] -[5] 通过同源重组或随机突变产生的蛋白突变体一定程度上都是依照模板蛋白 进 行 的 , 它 们 与 模 板 蛋 白 的 相 似 程 度 较 大 , 而 非 同 源 重 组 (Nonhomologous Recombination )能够产生完全不同于模板的新的蛋白质, 新的蛋白可能在自然界 中并不存在, 为研究进化蛋白提供了潜在的可能性,很多种方法可以进行非同源 重组, 如杂交酶递增切断技术( Incre mental truncati on for the creation of hybrid enzymes ,I TCHY)可以产生由基因氨基端和羧基端杂交形成的嵌合体基因库。该 法首先用核酸外切酶代替 DNase I 分别消化两种基因建立 ITCHY 库(I TLs) , 对 靶序列末端基因完全删除, 并通过降低切断温度、改变消化缓冲液浓度和加入酶 抑制剂等方法改变外切酶在 37℃消化过快的问题。最后将两种 I TLs 混合后进

行 DNA 改组建立 SCRATC HY 库(shuffled I TC HY libraries)。[5]这项技术降低了 家族改组对同源性的要求, 使家族 DNA 改组的概念和应用得到了进一步深化和 延伸, 并在其他领域得到有效的运用。Griswold 等将序列同源性仅 54.3%、且对 底物的专一性不同的人类和大白鼠类 GST 酶进行家族改组,利用 I TCHY 技术对 两者的同源编码基因进行融合重组, 获得的重组表达蛋白 SCR23 活性是人类 GST 酶的 300 倍, 时突变体酶还获得了催化谷胱甘肽和利尿酸结合的合成酶活 性。[6]- [7] 3. 展望 蛋白质工程作为分子生物学水平上对蛋白质结构和功能进行改造的手段已 经受到越来越多的研究人员的关注, 并且其应用广泛, 目前已经在蛋白质药物、 工业酶制剂、农业生物技术、生物代谢途径等等研究领域取得了很大进步。在分 子生物学手段日益发展的今天, 新的蛋白质工程手段逐渐面世, 对于蛋白质分子 改造起到了极其重要的作用, 通过这种手段提高蛋白质的特性如热稳定性、耐酸 性、耐碱性等仍然是目前的重要研究方向。[8]
3.1 医用蛋白质工程

利用生物细胞因子进行人类疾病治疗的独到作用已越来越被人们重视, 基 因工程技术诞生后首先就被用于人生长激素释放抑制因子、 胰岛素等医用蛋白 质产品开发,大大降低了用于治疗的成本。 利用大肠杆菌进行真核生物蛋白质表 达会遇到生物活性低等问题, 解决这些问题的出路一是研究开发新的表达系统, 如酵母、 哺乳动物细胞等,这方面已取得很大的成效。 另一方面就需要借助蛋 白质工程, 如利用分子设计和定点突变技术获得胰岛素突变体的工作国内外都 取得了相当多的成果, 此外, 干扰素、 尿激酶等蛋白质工程也都取得进展, 即将 得到长效、 速效、 稳定、 作用更广的蛋白质药物。医用蛋白质的市场广大, 待 开发的产品也非常之多。此外, 利用蛋白质工程技术进行分子设计, 通过肽模拟 物(peptidomimetics)构象筛选药物等方面研究更加丰富了蛋白质工程的内容。[9] 3.2 工业用酶的蛋白质工程 以酶的固定化技术为核心的酶工程是本世纪继生物发酵工程后又一次创造 出巨大工业应用价值的现代生物工程技术, 蛋白质工程在这一领域应用可以说 前景最看好。 通过酶的结构或局部构象调整、 改造, 可大大提高酶的耐高温、 抗 氧化能力, 增加酶的稳定性和适用 pH 范围, 从而获得性质更稳定、 作用效率更 高的酶用于食品、化工、制革、洗涤等工业生产中, 这方面已取得了许多成功的

先例, 如食品工业中用于制备高果糖浆的葡萄糖异构酶, 用于干酷生产的凝乳酶, 用于洗涤工业的枯草杆菌蛋白酶等蛋白质工程产品都将开发使用。[10] 3.3 病毒疫苗的蛋白质工程 疫苗在病毒等病原引起的人及畜禽传染性疾病的预防中起着不可替代的作用, 从制备疫苗的途径来说已有几代产品, 目前如乙肝等基因工程疫苗已开始得到 应用。 通过抗原移植、 构建各种颗粒体、 活载体及多价疫苗的研究已经成为 生物技术领域的研究热点, 但也遇到一些问题, 主要是移植抗原三级结构没有完 全恢复天然状态, 因而使得抗原性不够理想。 蛋白质工程技术将在今后的疫苗 改造中发挥重要的作用, 不但可使抗原性得到最大的提高, 还可使重组疫苗抗病 作用更加广泛。 近年来越来越多的病毒精细结构的阐明正在为开展蛋白质工程 奠定基础。 3.4 抗体的蛋白质工程 抗体不仅在哺乳动物机体中担负着重要的体液免疫功能, 还在医学、 生物 学免疫诊断中被广泛地应用。 本世纪证明了抗体是一类免疫球蛋白, 并相继阐 明了抗体产生及其多样性的细胞和分子机制, 使免疫学研究成为生命科学前沿 领域。 同时抗体的制备技术也经历着一次又一次革命, 由血清抗体到杂交瘤单 克隆抗体, 再到基因工程抗体库技术, 可谓日新月异。单克隆抗体给人类疾病的 药物导向治疗带来了曙光, 但应用上遇到鼠抗体对人具有免疫原作用的问题, 蛋 白质工程已成功用于解决这个问题。 通过结构分析表明, 抗体可变区内具有 6 个互补决定区(CDR )起与抗原结合作用, 其它区域做为支架(FR )维持构象, 通 过 CDR 移植已构建了 30 多种改型的人源化鼠抗, 并通过序列分析比较和计算 机模拟进行分子设计, 对 FR 区特定碱基进行替换, 保证了改型后抗体亲和力不 下降, 这种抗体有人称之为第二代基因工程抗体, 亦即蛋白质工程抗体。可以相 信, 蛋白工程在未来改造抗体中还将发挥更大作用, 目前有人研究通过抗体的多 样性从抗体库中筛选具有酶活性的分子, 从而得到抗体酶。[11] 3.5 分子生物学基础研究及其它 以上提到的只是蛋白质工程应用上的几个具有代表性的领域, 实际上它的 作用远非如此。 随着蛋白质工程研究对象的扩大和技术的成熟, 其应用领域也 将不断拓宽, 除用于直接生产蛋白质产品外, 也将通过操作生物体内蛋白质而获 得特定的生物性状。 有人根据植物叶绿体中 1,5 二磷酸核酮糖羧化酶、 加氧 酶双重活性, 提出通过蛋白质工程途径提高其还原能力、 降低氧化能力从而提

高光合效率的设想, 目前进行了大量探索工作, 一旦成功必将给农业生产带来巨 大的效益。

参考文献 [1] Roth, M and A Jeltsch , Changing t he target base specificity of the EcoRV DNA methyltrans ferase by rational de novo protein - design 2001: 3137- 3144 [2] Cahoon , E B , et al  , Redesign of soluble fatty acid desaturases from plants for altered substrate specificity and double bond position 1997: 4872- 4877 [3] Van den Burg , Betal , Engineering an enzyme to resistboiling 1998: 2056- 2060 [4] 孙毅. 蛋白质工程的研究进展及前景展望[J]. 科技情报开发与经济, 2006,(09) . [5] 唐建国,茹炳根,徐长法,胡美浩,朱圣庚. 蛋白质工程的研究[J]. 北京大学学报(自然科学 版), 1998,(Z1) . [6] 李强,施碧红,罗晓蕾,左祖祯,邢佩佩,刘璐. 蛋白质工程的主要研究方法和进展[J]. 安徽农 学通报(上半月刊), 2009,(05) . [7] 林瑞凤,舒正玉,薛龙吟,江欢,黄建忠. 微生物脂肪酶蛋白质工程[J]. 中国生物工程杂志, 2009,(09) . [8] 王娇. 基因工程技术的现状和前景发展[J]. 河南化工, 2010,(04) . [9] 殷震, 等.免疫原移植与病毒载体疫苗 .生物工程进展,1993114 (2) :23 ~ 26 [10] 刘喜富, 等.基因工程抗体研究进展 . 生物工程进展,1994114 (1) :54 ~ 58 [11] 李雄彪, 等.与粮农相关的植物蛋白质工程 .生物工程进展,1993114 (3) :1~ 5


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