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iTRAQ技术问题答疑


iTRAQ 技术问题答疑
1. itraq 的原理是什么?
Itraq 的检测可以做这样的比喻, 蛋白被打成肽段后, 被平均的铺在了一个有 384 个孔的平板上,然后机器会从每个孔中选取浓度在前 5 名的蛋白进行鉴定和比对, 所以,如果假设每个一个样本中有 100 个蛋白,他们的浓度均为 1%,那么得到的结 果就是蛋白的得分低,但是鉴定的蛋白数量会很多,可以达到 90 以上;如果一个样 本中有 100 个蛋白,有 3 个蛋白的含量分别为 30、20、10、其他的 97 钟蛋白为剩 下的 50%,那么这三种蛋白的得分高,但是鉴定出的蛋白数量会比较少,也许只有 50 或者 60 个。因为一些高丰度的蛋白会大量分部在上述的小孔中,抑制了其他蛋 白的检出效果。

2.iTRAQ 技术区别与以往二维电泳技术,具有如下优势:
2.1 灵敏度很高,检测限较低,可检测出低丰度蛋白; 2.2 高通量:同时对 4-8 个样本进行分析,提高实验通量,可同时对多个时间点 或不同处理的蛋白质进行分析; 2.3 分离能力强, 分析范围广, iTRAQ 可以对任何类型的蛋白质进行分离鉴定, 包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白,膜蛋白和不溶性蛋白; 2.3 结果可靠:通过高度敏感性和精确性的串联质谱方法,不需要凝胶,即可获 得相对定性与定量分析结果; 2.5 自动化程度高:液相与质谱连用,自动化操作,分析速度快,分离效果好。 由此可得,iTRAQ 技术比二维电泳技术能发现更多数量和种类的蛋白,但在比较胞浆
蛋白及蛋白量的变化方面,二维电泳技术有一定长处,对 iTRAQ 的实验结果有互补作用。

3. LC/MS 中蛋白处理是定量还是定性?
这是属于定量,需在蛋白定量后,各取相同量(50-100ug)的蛋白(体积不大 于 25ul,少于 25ul 的用专用裂解液补至 25ul)进行还原化和烷基化。

4. LC/MS 对需要检测的蛋白有量的要求吗?
有的,要求蛋白量最低 50ug,浓度最低要为 5ug/uL,否则同位素无法标记。

5. 数据分析中主要看哪些参数?
对于液质联用的数据分析, 一般观察的参数为: Total Ion Score C.I. % (可信度) 和 Tag-80/Tag-0(两样本的比值) 。

6. 众多可信度数值中,主要选择哪些进行研究?
一般来说可信度在 80%以上的均为可信程度非常高的。有些蛋白可信度在 60% 以上的也可以作为参考数据。

7. 可信程度低于 80%的数据有意义吗?
可信程度低于此值的,如果有感兴趣的蛋白可以通过 ELISA、WB、Q-PCR、

液态芯片等技术手段进一步验证,毕竟 LC/MS 是研究蛋白组学的方法之一,如全面 研究还是要综合各种研究方法。

8. 两样本的比值都代表什么?
两样本的比值如果在 0.9-1.1 之间的,可以认为两样本的含量是一样的,即比值 为 1:1;而小于 0.9 或大于 1.1 均可认为两样本之间的比值是有差异的。

9.质谱图中显示的是各种蛋白吗?
不是各种蛋白而是蛋白被打碎后的离子图谱,由于质谱法是电场和磁场将运动 的离子 (带电荷的原子、 分子或分子碎片) 按它们的质荷比分离后进行检测的方法。 测出的是离子的准确质量,由此来确定离子的化合物组成。

10.液质联用是不是可以检测所有蛋白?
原则上讲是这样的,如果单个蛋白在所提供的样本中的含量少于 100ng 可能就 检测不出来了,总体上样量为 50-100ug,一般每次可以检测出来的蛋白数量从几百 到几千都有可能,取决于标本本身的情况。

11.提供的结果除了分析数据外,是不是包括蛋白名称还是蛋白的大致归类?
给出的是蛋白的名称,按照可信度从大到小排列。

12.是否还有每个蛋白的鉴定图谱或者提供蛋白结果分析?
没有每个蛋白的鉴定图谱,图谱是肽段。

13. 蛋白上样量是多少?收集蛋白体积 100ul 吗?应该大于 100ul 还是小于 100ul?
itraq 对蛋白收集体积没有特别要求,只要求浓度至少是 5ug/ul 的蛋白至少 20ul 即可。

14.差异蛋白试验的结果包括哪些呢?存在差异的蛋白种类, 名称, 肽段序列, 分子量,pI 或者有否其他的什么信息,结果是以什么形式进行报考呢?表格 或图片?
差异蛋白试验的结果包括:Protein Name、Species、Accession Number、Protein MW、Protein PI、Total Ion Score、L/N;结果以表格形式提供。

15.对实验的样品有什么要求?浓度,纯度,是否可以有盐,如果是胞内蛋白 需要怎样裂解,或者你们是否可以帮忙处理样品?
若蛋白由您提供给我们,则蛋白浓度要求 5ug/ul,体积要求至少 50ul,总蛋白 量至少 100ug;或者您直接提供组织、细胞或菌体给我们,蛋白由我们来抽提,但 是您要告知我们蛋白是抽提全蛋白还是膜蛋白还是其他特殊蛋白。

16.检测的蛋白是酶,酶分型较多,是否可将每种酶分型都检测出来?

检测 itraq 有一个蛋白库, 这个库是网上最新公布的世界上研究出来的所有蛋白 信息,如果您检测的酶的各种分型此库里都有收录,那么就可以检测出来,如果没 有就检测不出来,这个要看世界上对该种酶研究的程度。

17.是否可以提供蛋白序列?
由于检测出的蛋白数量很多,都是成百上千个,itraq 机器不可能将检测出的每 种蛋白序列都提供给您,这个工作量非常大,而且也不是每一个检测出来的蛋白对 您都有意义,一般可以先提供结果,您选择研究有意义的蛋白名称,我们可以提供 相应蛋白肽段给您。

18. 若使用 itaq 检测 human 血清,需要血清量是多少?
若 itraq 方法检测血清,则检测前需要对血清进行高峰度蛋白去除,收集低丰度 蛋白后进行 itraq 检测,去除高峰度蛋白方法是使用相应提纯柱子,此柱子很昂贵。

19. Itraq 检测是否需要重复以便使结果具有统计学意义?
不需要,Itraq 技术本身的算法,可以认为得到的蛋白之间的比例,并且是可信 度高的实验结果是具有统计学意义的,并且在这个基础上可以进行后续的验证。

20. 目前开展该项业务的公司有很多,能否推荐下哪家公司做的比较好?
目前能开展 itraq 的公司挺多的,个人推荐上海舜百生物做的相对还是不错的。之前 是叫舜田,现在据说服务质量挺好,周期大约 1 个月左右。

21. 如果打算开展该项试验,需要提供什么样的样品形式?
最好是提供抽提好的蛋白,冻成干粉,然后用干冰快递过来。组织蛋白抽提不 能用含二维电泳的变性剂来裂解蛋白。如果组织的话,存放到-80 度冰箱中,然后用 干冰快递过来, 上海本地的, 也可以将组织用冻存管装好, 投入液氮中运过来即可。


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