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垫状卷柏化学成分研究


苏州大学 硕士学位论文 垫状卷柏化学成分研究 姓名:张红伟 申请学位级别:硕士 专业:药物化学 指导教师:孙晓飞;田景奎 20080501

垫状卷柏的化学成份研究

摘要

摘要
垫状卷柏(&锄咖P砌删如扬嘲(h00k et骶v)Ma】(iIn.)为卷柏科卷柏属植物,
在我国分布广泛。《中国药典》(2005版)收载品种为卷柏,民间常作为药用的卷柏 属植物有20多个。现代药理学研究表明卷柏属植物不仅具有传统的消炎、解毒作 用,而且具有抗炎、抗菌、抗病毒、增强免疫、抗肿瘤、降血糖、解痉等作用。 为进一步研究垫状卷柏的药效物质基础,本课题对垫状卷柏的化学成分进行 了较为系统的研究,垫状卷柏经70%乙醇提取后,浓缩得土黄色混悬液,离心后分 为沉淀和溶液。沉淀部分经反复硅胶柱层析得到化合物I。溶液部分用Dlol型大孔 树脂吸附后,分别用水,30%乙醇,70%乙醇,95%乙醇梯度洗脱,并浓缩成干膏, 30%乙醇洗脱部分经反复硅胶柱层析,SephadcX LH.20凝胶柱层析,制备液相等 手段分离得化合物II,III,Ⅳ和V。70%乙醇部分经反复硅胶柱层析,Sephadex 凝胶柱层析得化合物VI和VII。采用UV

I&1H-NMR,13C-NMR,2D撇等多种波

LH.20

谱学方法鉴定结构分别为伊谷甾醇(I),腺苷(II),卷柏苷A(III),丁香脂素

_4,4‘.D-双毋D.葡萄糖苷(Ⅳ)、咖啡酸(V),穗花杉双黄酮(VI)、芹菜素(VII)。
其中化合物II、III、Ⅳ、V为首次从垫状卷柏中分离得到。 穗花杉双黄酮为垫状卷柏的主要活性成分之一,其含量的高低可以作为评价 垫状卷柏内在质量的参考指标,可利用反相高效液相色谱法测定垫状卷柏中穗花 杉双黄酮的含量,此方法灵敏、简便、准确。色谱条件:色谱柱:elite.ODS(250×4.6

mm,5pm);流动相:甲醇.0.05mo儿磷酸二氢钠溶液系统(梯度洗脱,0.20111in, 50%.70%);柱温:40℃;流速:1.5m蜘池;检测波长:330 nm。结果表明,
在O.2.3.0¨g范围内线性关系较好,相关系数FO.9999,平均回收率为98.28%,RSD 为1.93%。本论文对山东、辽宁、湖北、河北、吉林五个产地的垫状卷柏分别进行 了考察,以期对垫状卷柏质量标准的建立提供参考。

关键词:垫状卷柏;化学成份;含量测定 作 者:张红伟

指导教师:孙晓飞(苏州大学) 田景奎(浙江大学)

Studies

on

the Chemical Constituents
et

of.5k蛔切l!刀扫

p比如切口纫(hook

Grev)Maxim.

Abstract

&魄却P砌p材如加口勉(h00k et
is、7l,idely spread in China.n’s adopted int0 C11inese

GhV)Ma)【im,讹ch is t硼itional mne∞herb,


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ph黝acopeia(2005),觚d

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in&妞姚妇

genus a托used嬲Inedicille.PhannaCological in、,estigation shows t11at they possess

complex

Plx黝aColo西cal actions such嬲anti-innammatoDr,anti-bacterial,anti-vims,
and
so

inm删ty-stimllla_ting,孤ti蛐or,锄lalgesi岛h弹。酉ycemic e妊-eCt,Sp勰molysis
0n.

1b

eXplo陀也e

medical

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resill,

by

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and V11 were
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V were obtailled丘Dm也e

conce撇d sol砸on

EtOH,

re-silica gel CC,S印hadeX LH-20 CC锄d preparative瑚PLC.VI nlc

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LH-20 CC.On也e b勰is of spec缸oscopic Value and were

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(I),

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(Ⅳ),ca彘ic acid(V),锄entoflavone(VI),apigeIlill(VII).Among
compoundsⅡ,m,Ⅳ,V
time.
In addition,铤nl'ntoflavone is its main chemical conStituent,its content
can arc

of theIll' me first

0btained舶m&妞讹?7口p“如加口船MaXiIn.for

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II

兰型堕竺坐!里垒!璺i堕旦∞stitIlents of&^曙妇砌p“^砌口m(h∞k et
l:心-HPLC w弱∞nsitive,sinlple,eXact
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aIIlentonavone.111 order supply也e reference for me study of KEY

WOImS:&蛔量加P砌p甜~拥嘲Ma)【im;chemical

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苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明

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本人郑重声明:所提交的学位论文是本人在导师的指导下,独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文‘ 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。

研究生签名:.缢垒圣:日期:趣路:驻.垒旦
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研究生签名:埤日
导师签名:

垫状卷柏的化学成份研究

序言





中医药文化是中华民族的精髓,博大精深,为中华民族的繁荣昌盛做出了不 可磨灭的贡献。中医药理论讲究辩证施治,从整体考虑机体的状态,虽然这种理 论有其独特的系统性和科学性,但无法用现代的科学理论加以解释,这严重影响 了中医药的发展,因此如何应用现代的科学技术研究中医药,实现中医药的现代 化,成为人们普遍关注的焦点。另一方面,随着社会的发展,人类疾病谱发生了 明显的转变,传统的细菌感染性疾病、寄生虫疾病得到了较好的控制,而癌症、 心血管疾病、艾滋病、糖尿病构成了现代社会威胁人类健康的主要疾病。在对这 些疾病的治疗过程中,合成药物一方面由于新的先导化合物的发现越来越困难, 另一方面由于毒副作用较大,使其应用受到限制,而天然药物在治疗这些疾病的 独特疗效,引起了人们的广泛关注,给中医药的发展带来前所未有的机遇。 中药是中医药的重要组成部分,中药现代化是中医药现代化的关键,但中药 及其复方成分复杂,质量又随产地、采收季节、加工贮藏方法、制剂工艺等因素 不同而不同,造成其作用物质基础和作用机理不明确,疗效不稳定。因此加深对 中药药效物质基础的研究,建立中药稳定可靠的质量标准体系成为中药现代化的 重中之中。本论文的工作就是基于上述背景,采用化学方法,对中药垫状卷柏进 行了系统化学成分研究,并用HPLC法对其主成份含量进行测定。

垫状卷柏(&缸咖e砌p材如办搬细(hook

et

G∞v)Ma虹m.)为蕨类卷柏科

(&诹f根e妇ce口e)卷柏属(&垤妇妇)植物垫状卷柏的全草。现代药理及临床研
究表明卷柏属植物不仅具有传统的消炎、解毒作用,而且具有抗菌、抗病毒、增 强免疫、抗肿瘤、镇痛、降血糖、解痉等作用。目前对其化学成分研究较少,为 探讨垫状卷柏的药效物质基础,对其进行了系统的化学成分研究,并对其主成份 进行了含量测定,加深了对垫状卷柏的认识,为其临床规范用药和进一步的开发 利用奠定了基础。

垫状卷柏的化学成份研究

第一章概述

第一章概述
摘要:对国内外近几十年来有关卷柏属植物的化学成分、药理研究进展进行 综述,以利于本属植物的进一步研究和开发利用。 关键词:卷柏属;化学成分;药理作用 垫状卷柏

(.踞坳P砌∞口P)卷柏属(&锄P砌)植物垫状卷柏的全草。垫状卷柏及其同属
植物分布广泛,品种繁多,全世界约有700多种,我国约产50余种,各地均有分布。

(.髭矗枷P砌p“M玎a幻(hook

et

Grev)Ma】(illl.)

为蕨类卷柏科

除《中国药典》(2005版)n】收录卷柏外,民间入药用的尚有垫状卷柏(&蛔咖e砌 p咖施砌)、蔓生卷柏(&d咖麟f乃册西.)、江南卷柏(&研DP玩门面咖胁P,D绝)、 充州卷柏(&f胛D舰凇.(SW.)Spr.)、深绿卷柏(。娶面e如rfefnff胁e阳踉)、薄叶卷柏

(&如Z死聊胁h)及翠云草(&绷拥嘲(DeSv-)Sp血g)等20多个品种。现代药理及
临床研究表明卷柏属植物不仅具有传统的消炎、解毒作用【2】,而且具有抗菌【31、抗 病毒【4】、增强免疫嘲、抗肿瘤【6】、镇静镇痛【7一、降血糖【9】、解痉‘1川等作用。民间有 用其治疗癌症或降血压,因其含有较丰富的具细胞毒作用的双黄酮类化合物,故 卷柏属植物越来越受到人们的关注,引起了国内外研究者极大的兴趣,对其进行 了相关研究,进一步的深入研究仍在展开。为利于其进一步的研究和开发利用, 现将近几十年来国内外对卷柏属植物在化学成分、药理及临床等方面的研究概况 作以总结。 1.1化学成分研究 卷柏属植物多含有双黄酮类化合物【11】,其次是生物碱、苯丙素、有机酸类, 尚有甾体、氨基酸、海藻糖等有机成分,另外尚有一些无机成分。 1.1.1黄酮类化合物


自1971年0kigawa等人从.£而堋鲫妇c加口中分离出amemonavone(1)等五种
黄酮类化合物以来【121,中外研究者共从卷柏属植物中分离出26个黄酮类化合物。 除芹菜素【12】(印igenin,25)为单黄酮外,其他均为双黄酮类化合物。从卷柏属植 物中分离得到的双黄酮类化合物,主要由两分子芹菜素或其甲醚衍生物聚合而成, 也有芹菜素和2,3.双氢芹菜素聚合的,结构复杂,连接方式较多,主要有C.C和 C.O-C两种连接方式。根据其连接方式的不同可以把它们分为三类:1)3?,8”.双芹



垫状卷柏的化学成份研究

第一章概述

菜素型,即锄entonavone型(I);2)3’,6”.双芹菜素型,即robuStanavone型(Ⅱ);
3)4’.O.6".双苯醚型,即llinol【inavone型(III),另外还有3,4…连接,如delic胡avone

(26)【13】。其中化合物2”,3”面.hydrorobuSt-

胡avone-7,4‘一dimcmyl?劬er(1 6),2”,3”-dillydr0I.0bustanavone7,4’,7"一
trimethyl-enler(1 7),2,3一dihydrorobustanavone-7,4’,7¨一曲nemyl-etller(1 8),2”,3¨

埘hydroiso-c聊tome血(23),2,3一dillydroisoc呷tom酣n(24)均为芹菜素和在2,3
或2¨,3”位被二氢取代的二氢芹菜素以不同的方式连接起来。

确~呐

1 2 8I..

II



图1.1

黄酮类化合物的母核结构

表1.1:卷柏属植物中双黄酮化合物概况


母 核
amentoflavone 7,7”.di.O.
I I

Rl

R2

R3



来源(首次)

3。,



H H



H H

s,tnm‘旷iscin口

Me

Me

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双 芹 菜
素 型
5 6 7 8 4 3

methyl锄en:tinaVone
7,4’,7”,4川-tetra.O- I

Me

Me

Me

Me

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4’,7¨-di?O—
I H

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Me



&wf,Z沈刀Dw筇

metllylam朗tiflaVone
sotetSuflavone I

Me Me


H H





s.tQm6Iriscin口

heveanavone bilobetill giItkegetin


I I

Me
H H

Me
H H

s.1eptdo计啪l口
s.willdenoWii

Me Me

Me

s.moelle硼0吩i



垫状卷柏的化学成份研究 9 10 11 12

第一章概述 I I II H H H H

kayanavone podocaIpusnaVoneA

Me
H H H

Me
H H

Me Me

s.moellendo啦i

s.moelle溅啦i
s.1epidophylln

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II

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双 芹 菜 素 型
15 14 13

4‘.O.

II



Me



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robustanavone7,4’. 击-mettlyl?enler robustaflavone
II H II

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16 II

2”,3”?di-hydrorobustan-

Me

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2”,3”-dihydrorobust-

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2,3一dihydrorobustaflavone-

II

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7,4’,7¨七.吼e廿lyl一劬er
4’. O. 19 20

c巧ptomeriIlB isoc珂ptomerin 11inol【inavone

III III III IⅡ III

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Me
H H H H

H H H

s.tclmcIriscin口 &细7”a,良fcf玎口
S.tamclriscina

6’t-

21
22 23

双 苯 醚 型

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2¨,3”-

Me Me

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&wf,Z如丹Dwff

dihydI研socryptomerin
24

2,3-dihydroisoc明印meriIl

III

Me





S.denccImln



垫状卷柏的化学成份研究

第一章概述

1.1.2生物碱类化合物 卷柏属植物的生源研究认为其中会含有生物碱类成分,林瑞超等人从

&如e比比加打中分出7个生物碱,分别为:hann黜(1),hordelline(2),

hordeIline一0-L—rhj瑚nop粥moside(3),N-m锄lt彤吼ine-0-甜L—rh{uIlnop”anoside
(4),hordenine一0-【(6”一D-仃a船-c血锄oyl)一3。一D一夕一D—glucopyr锄syl-a—L
?Rhamnop),r

Anosidc(5),N-meulylty姗jne-D-【(6”?D-仃ans-ciJlnamoyl)一3’一D

毋D-西ucop弘mosyl一仅-L-rh锄nopFanoside(6),hordellinc—D?【6”一D一蛔璐

4hy出0Xy.ci衄锄oyl).3’.D毋D.glucopyr觚osyl.a.L.rbamnopy啪oside(7)【14'15,161。
1.1.3苯丙素类化合物 1994年,林瑞超等人【1 6'17】从&面P如比切打中分出三个苯丙酮类化合物和五个

木脂素类化合物,分别为:3一hydroxy一1一(3一II砒oxy.4?Hydroxyphenyl)propan.1一。鹏 (1),3-h)怕Xy-l一(3,5-dimemoxy-4一hydroxyphenyl)一propan-1-0ne(2),3一hydroxyl-

di-1,3-(3,5-dim劬。碍4-hydr0删】即y】H舯pan争l-o∞(3),Lirioresin0埝(4),
LirioresinolB(5),(+)-谢kg昀mol(6),(+)一∞r眦heloside(7),(+)-nlat瑚【iresi∞l
(8),它们均属于木脂内酯类化合物。 戴忠【18】等从中华卷柏里分到松脂醇二葡萄糖苷;陈德钊等在江南卷柏醇提物的 氯仿部位得到异茴芹素【191,郑晓珂等从卷柏中分得(7S,8R).7,8.二氢.7.(4.羟基.3, 5-二甲氧基苯基)-8一羟甲基一【1,-(7’一羟基)乙基一5,-甲氧基]苯骈呋喃-4-D伊D一葡糖苷 (卷柏苷C)【20】。 1.1.4有机酸类化合物 台湾学者LIN LC等从&沈加“幻胁中得到三个咖啡奎宁酸类化合物,即3,5. 二.口咖啡奎宁酸、3,4.二.D.咖啡奎宁酸、4,5.二.D-咖啡奎宁酸等【21】;我国学者

陈德钊田】等利用结晶法从&聊DP舭矿f(江南卷柏)醇提物氯仿萃取液中得到棕
榈酸和硬脂酸;陈萍等分别从深绿卷柏中得到了莽草酸、大叶菜酸及硬脂酸等幽】; 到阿魏酸、咖啡酸、香荚兰酸、丁香酸。 1.1.5其他成分

郑兴等【24】从垫状卷柏中得到了对羟基苯甲酸。毕跃峰等【25】从卷柏水提物中分离得

陈萍【231等用气质联用法测定了深绿卷柏中一些脂肪链类成分,有十四烷酸乙 酯、十五烷酸乙醋、十六烷酸乙酯、十六烷酸甲酯、十六烷酸异丙脂、7,10,14. 三甲基十五烷酮.2,9.十八碳烯酸(Z)乙酯、15.甲基.十六烷酸甲酯等,并用面积归

垫状卷柏的化学成份研究

第一章概述

一法测得了它们各自的含量。其他尚含有:葸醌类成分如大黄酚、大黄素甲醚、 大黄素口6】;甾体如谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、胆甾醇;氨基酸;海藻糖;微量 元素等。 1.2药理活性研究 1.2.1细胞毒作用 迄今为止,对卷柏的化学成分研究较多的是双黄酮类化台物,并进行了一些 活性筛选,认为卷柏属植物中一些双黄酮具有细胞毒活性,这可能是其抗癌作用

的物质基础。从&w泓拓刀Dw打中分得4’,7”.di—D-meⅡ1y1锄entinavone、isoC瑚pt0 -me血和7”.D.metllylrobustaflavone对人癌细胞有显著的细胞毒作用【2刀。江
南卷柏中分离得到的银杏双黄酮(Gilll【ege雠)能抑制人卵巢腺癌的生长,并
有剂量依赖性【28】; 从薄叶卷柏中得到的2”,3”.dihydrorobustanavo舱7,4?.dim酬晦1 7,4’一diIll制时l

创her、robustanavone

etller,均能强烈抑制酬i及Galu.1癌细胞生

长。从卷柏中得到的锄entoflavone具有细胞毒作用,可以直接杀伤癌细胞,抑
制其生长,并影响抑癌基因P53的表达,使细胞周期停止在G期【29】,并可在PL研.1 过表达NIH3T3纤维原细胞中作为PL研.1以及磷肌醇的抑制剂【30】,从而达到抗
癌的目的。 1.2.2抗肿瘤作用 卷柏为近年来发现的有效抗肿瘤药物之一。一般对化学抗癌药或放射性治疗 敏感的肿瘤均有效,其中又以对体积较小的肿瘤疗效较好,与化疗或放疗联合应 用能发挥协同作用,使疗程缩短,肿瘤缩小,而对正常组织无影响【31捌。国内外学 者在其药理实验、临床观察及机理探讨方面进行了一定的研究。采用卷柏水提物 及其各个萃取部位对小鼠肉瘤S180,肝癌H22模型腹腔注射给药,对两种瘤株均有 不同程度的抑制作用,其中水萃取部位作用最强,且存在着剂量依赖性,给药剂 量9.69/kg,对小鼠肉瘤S180模型瘤重抑制率为75.1%,对肝癌H22模型瘤重抑制率 为62.4%,并且抗瘤活性与瘤株有一定关系【331。其作用机理探讨目前认为主要是 其中所含的双黄酮成分如阿曼托双黄酮等的细胞毒作用,可以直接杀伤瘤细胞抑 制其生长。另外还可以通过影响抑癌基因P53的表达,使细胞周期阻止在Gl期, 从而起到防癌治癌的作用瞰】。 1.2.3抗突变作用 研究了包括深绿卷柏在内的36种抗癌中草药水提物,发现深绿卷柏能抑制由



垫状卷柏的化学成份研究

第一章概述

苯并吡喃诱导的畸变,而对苦酮酸诱导的畸变作用不明显【351。 1.2.4抗菌作用

卷柏(&棚口,沁加口)烟熏法对感冒杆菌、奈氏菌有抑制作用,时间越长效果
越好,民间也有用此法预防感冒及流行性感冒【36】。 用卷柏及其炮制品卷柏炭进行抑菌实验,结果仅对绿脓杆菌有抑制作用【371。

心6licl【i,Z.研究了双黄酮的抗真菌活性,证明锄emDnaV∞具有抗真菌活性。 而在目前研究过的卷柏属植物中几乎所有的种都含有锄entona、,11e,可知卷柏属
植物应具有抗真菌活性【3羽。 1.2.5抗病毒作用
Lin

Yllll-meei等人【4】研究了一些双黄酮的抗病毒活性,证明robustaflAvonc有强

烈的抗流感病毒A,B活性。EC50分别为2.O鹇/以和O.2pg/ml,SI值分别为1 6和454。 Amentonavoe也对流感病毒A,B有明显的抑制活性。AmntI)nav0鹏和

robllS切妇avoe对HSV-l和HSV.2也有一定的抑制作用,锄entonaVone EC50为

17.9pg/ml(HSV一1)和48.Opg枷(HSV一2),SI值为>5.6(HSV一1),>2.1mSV.2);
robus切navone

EC50为8.6弘咖l(HSV一1)和8.5}lg,ml(HSV一2),SI值>11.6

(HSV—1)和>11.8(HSV一2)。

1.2.6抗氧化作用 徐智‘3明等研究发现穗花杉双黄酮和垫状卷柏双黄酮能清除DPPH自由基,能 显著抑制LPC所致内皮细胞LDH的泄漏,抑制LPC所致细胞活性的降低。黄 酮类化合物属天然多酚类抗氧化剂,具有抗脂质过氧化和清除自由基的作用。 潘苏华等【401发现,异银杏双黄酮能使缺氧大鼠血浆及红细胞内超氧阴离子含 量显著降低,且能升高血清SOD, 1.2.7抗炎作用 银杏双黄酮具有很强的抗炎作用,其效果较泼尼松龙更佳【411。Ⅺm HK等【42】 学者在对穗花杉双黄酮抗炎机制研究后指出穗花杉双黄酮是一种新型抑制磷脂酶 A2环氧化酶的抗炎药。 1.2.8免疫调节作用 张晓莉等人【431采用四项免疫学指标观察了卷柏复方对小鼠免疫功能的影响.实 验表明:卷柏复方具有明显促进小鼠Ma的吞噬功能.Ma不但参与机体的非特异 性免疫,而且在机体的特异性免疫方面也起着重要作用。实验结果进一步显示卷 作用强度大于阿司匹林。

垫状卷柏的化学成份研究

第一章概述

柏复方可能通过增进Mg,TH和B细胞之间的相互作用而增强机体的体液免疫功 能。T淋巴细胞转化率的提高表明:卷柏复方具有增强机体细胞免疫功能的作用。活 化的T淋巴细胞是机体抗病毒,抗肿瘤的主要成员,同时它们又能分泌多种细胞因 子如:IL.2,IFN.r等参与机体的免疫调节。 1.2.9降血糖作用 国内研究者首先发现由卷柏、木贼组成的复方镇痛灵注射剂具有降血糖作用, 能降低四氧嘧啶引起的大鼠高血糖。作用机制研究认为其能通过升高血清胰岛素 浓度、降低血清过氧化脂质含量、改善血流变异常等作用来降低血糖,特别是其 能明显修复胰岛素p细胞这一作用为治疗糖尿病开辟了一条新思路【44,45舶】。李方连 等研究了单味卷柏水煎剂对由四氧嘧啶引起的老龄鼠高血糖的药理作用,观察到 了近乎相同的结果,而认为卷柏单用也有降血糖的作用【47】,近来又发现单剂卷柏 对胰岛素抵抗性有明显的改善作用【48】,并发现其对链脲佐菌素(STZ)诱发的糖 尿病大鼠具有显著的降血糖、升高胰岛素浓度、降低丙二醛(MDA)含量的作用, 而对正常大鼠无明显影响【49】。 1.2.10降血压作用 由卷柏,木贼组成的复方的动物实验显示其有降血压作用【501。麻醉开胸犬静 脉注射该复方注射液1.29/l【g,动脉收缩压、舒张压、平均动脉压、左心室收缩压 及左心室压力变化最大速率均下降,提示卷柏复方注射液是通过负性肌力的作用 使血压下降的。法国学者们将从深绿卷柏中分得的大麦芽碱苷(hordenille)及其衍 生物、合成物经老鼠灌胃给药.发现它们均具有降血压作用,从而证明传统中医药 在心血管方面的作用【5l】。 1.2.11止血作用 卷柏历来被用作活血止血药。国内研究者对此进行了一些探讨。认为卷柏止 血机制在于它能缩短凝血时间,对凝血酶原有着一定的影响,但未见其影响到血 管收缩作用【52,531。而彭智聪等用毛细玻管法和玻片法进行凝血时间测定,探讨了 生卷柏及卷柏炒炭后是否具有止血作用及作用机理,发现生卷柏没有止血作用, 炒炭后能使凝血时间缩短,具有止血作用【541。 1.2.12其他作用 Chalcra、懈nly

BK等【55】研究了自&,c泓e砌,.印鲫护括吵忱i的叶子中分离得

到的穗花杉双黄酮对离体豚鼠回肠具有解痉作用。从SZ讽叩幻妇中分得一个3.羟

垫状卷柏的化学成份研究

第一章概述

甲基.5.甲氧基.2,4.二羟基.四氢吠喃,并发现它对老鼠子宫收缩反应有轻微的抑制 作用,并存在着剂量依赖性,而对回肠和十二指肠的平滑肌的收缩反应无作用【561。 陈美琳等【57】发现卷柏与木贼组方制成的注射剂对动物有明显的镇痛、镇静作用。 意大利学者曾用银杏、卷柏等植物的粗提物治疗复杂性肥胖症,发现它们能有效 地降低脂肪沉积的堆积【581。 1.3结语与展望 综观卷柏属植物药用历史及现代研究进展,可见过去它虽然不是常用药,但 随着对其认识的不断深入,和社会疾病谱的变化发展(特别是心血管疾病与癌症的 肆疟),有希望从此类天然药物中开发出高效、低毒、稳定的新药来攻克它们,而 该属植物利用的日趋广泛,药理及临床研究的成果均显示了卷柏属植物的潜力, 国内外学者分别从不同角度在其化学成份、药理作用及临床方面作了较为深入的 研究,甚至从分子水平探讨了其作用机理。卷柏属植物的化学成分和药理活性研 究对垫状卷柏的研究具有重要的参考意义和指导价值。但同时我们也应看到,目 前对垫状卷柏及其同属植物的研究并未完善,化学成份研究有待深入;不同产地 卷柏属植物各种成分差异较大,不利于其进一步开发利用;所作的药理实验、活 性筛选等大部分用的是粗提物,所以有必要在现有研究的基础上,继续开展更深 入系统的研究工作。



垫状卷柏的化学成份研究

第二章垫状卷柏的化学成份研究

第二章
2.1实验部分 2.1.1仪器、材料与试剂

垫状卷柏的化学成份研究

柱层析所用硅胶(粒径范围80.200目)和硅胶薄层板G GF254均为青岛海洋 化工厂产品;柱层析填充剂所用Chromato黟aph Silica
Gel C 1

8(20-50¨m)为FUJI

SIL,YS认CHEMICAL L1D。公司产品;Sephadex LH.20(瑞士Phannacia BiotIeCh公
司)。

X-4数字显示显微熔点测定仪(温度未校正):越7:f虹AR

330刚R红外分光

光度计;B九|ker DPX-400核磁共振仪(TMS内标);质谱用W.atIers ZQ 4000型

质谱仪和W.atI琊2695液相色谱连用仪;W砾淞Del帅制备型高效液相色谱
仪,
YMC.Pack ODS.A制备型液相色谱柱;
Aglient 1 1 00分析型液相色谱仪,伊

利特hypersil ODS分析液相色谱柱;SHZ—D(III)循环水式真空泵(巩义英峪予 华仪器厂);旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司产品),。 显色剂:(1)10%H2S04一EtOH;(2)3%ALCl3;(3)10%磷钼酸:(4)UV254和

UV365下看荧光。展开系统:Pe们l:Et0Ac;(2)CHCl3:CH30H;(4)CH30H:
H20。

化学试剂均为分析纯,由国药集团化学试剂有限公司提供;高效液相所用试 剂为色谱纯,由J&K CHEMICAL L1D.提供。 垫状卷柏购于华东医药股份有限公司药材参茸分公司,产地为浙江,批号

050822,经浙江大学生物仪器学院教授田景奎鉴定为垫状卷柏&概珈P妇
p“MMr口M戥im的干燥全草。 2.1.2提取分离 取垫状卷柏

(&删如栩嘲M觚妇.)干燥全草12.5kg,70%乙醇加热回流三

次,减压回收溶剂,浓缩至1:1(19药材/m1)得土黄色混悬液,4000疏【lill 离心得沉淀和溶液。沉淀部分(5009)做硅胶柱层析,石油醚一乙酸乙酯梯度 洗脱(10:0;9:1;8:2;7:3;6:4;5:5),40一53组分(8.59)再做硅胶柱层 析,氯仿.甲醇(10:0;9:l;8:2;7:3;6:4;5:5)梯度洗脱,组分9.11得到 化合物I(3.09)。溶液部分过Dlol型大孔树脂,分别用水,30%乙醇,

lO

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第二章垫状卷柏的化学成份研究

70%乙醇,95%乙醇梯度洗脱,每个梯度洗脱3.5个柱体积,分别浓缩成干膏, 30%乙醇洗脱部分(1309)做硅胶柱层析,氯仿.甲醇(10:0;9:1;8:2;7:3; 6:4;5:5)梯度洗脱,组分48.54再经SephadeX LH.20凝胶柱层析,甲醇洗脱, 合并15.16馏分得到化合物II(30mg),组分55.66做反相硅胶柱层析甲醇.水 (30:70,35:65,40:60,50:50,60:40)梯度洗脱,制备液相,甲醇.水(28: 72,40:60,60:40),10.16馏分得到化合物III(30mg),组分67.76再经硅 胶柱层析,氯仿.甲醇(10:0;9:1;8:2;7:3;6:4;5:5)梯度洗脱,合并55.66 馏分得到白色鳞片状结晶化合物Ⅳ(300mg),组分77-97经Sephadex LH-20凝胶 柱层析,甲醇洗脱,馏分9分离得到化合物V(80mg)。70%乙醇部分(809)经 聚酰胺柱层析,氯仿.甲醇(10:0:9:1;8:2;7:3;6:4;5:5)梯度洗脱,组 分115.142经硅胶柱层析,氯仿.甲醇(10:O:9:1;8:2;7:3;6.4;5:5)梯 度洗脱,合并3.36馏分,经Sephadex LH.20凝胶柱层析,甲醇洗脱,得化合物 VI(3.69),组分70.89经反复Sephadex LH一20凝胶柱层析,甲醇洗脱,得化合 物VⅡ(40mg)。 2.1.3提取分离示意图(图2.1)

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第二章垫状卷柏的化学成份研究

垫状卷柏药材(12.5kg)

◆ 70%乙醇加热回流3次

药液 I

浓缩至l:l(19药材/IIll)

纛。
梯度洗脱


PE:EtOAc





30% 乙醇部分 回收溶剂


70%乙醇部分

I浸膏(8.59)
silicaCC






I回收溶剂

梯度洗脱

浸仪‘一’ 1309)

浸膏(809)
I聚酰胺cc I cHcl3:cH30H

分得 ‘状结晶 7I(3.09)

silicaCC CHCl3:CH30H

l梯度洗脱


Fr.115.142
silicaCC CHCl3:CH3


梯度洗脱

梯度洗脱





h4i。勰虢h5降06i-『::
Fr.15,16得Fr.10.16得到白

I苫蔷淼 M‰…k白I蒿I誓

化合物III(10mg)

风7心
I苫 l装





3—36 过 凝 胶
o n n

Fr.7l

到r藏淼g)r脱l藿







l铡,c。吼一鬣磊篓誓白

化合.物
(300mg’

IV

化菩物H
(30m∥

1 分 上 疤

l益

洗 ,脱

}黄色无定
:VI(3.69)

Fr.9分得淡黄

…一..1
结晶
(40mg)

结晶化合物V
(80mg)



12

垫状卷柏的化学成份研究

第二章垫状卷柏的化学成份研究

2.2结构鉴定

采用UV,IR,1H懈,13C-NMR,2D-NMR等多种波谱学方法鉴定结构分别
为伊谷甾醇(I)(伊sitoSter01)、腺苷(Ⅱ)(adenosine)、卷柏苷A(HI)

(t锄撕scinoside A),丁香脂素-4,4’?D.双毋D-葡萄糖苷(Ⅳ)(s如ngaresin01.4,

4t-D-bis移D—glucoside)、咖啡酸(V)(c捻ic acid)、穗花杉双黄酮
次从垫状卷柏中分离得到。

(VI)

(ameⅡtoflavone)、芹菜素(VII)(印ige幽)。其中化合物Ⅱ,III,IV、V为首

HOH2

HO

化合物I
OH

化合物II

MeO
R=
,~

HO

固叫

化合物IⅡ

化合物Ⅳ

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第二章垫状卷柏的化学成份研究

OH

COOH H

化合物V


化合物VII

OH

化合物vI 图2.2化合物结构 2.2.1化合物I的结构鉴定 白色针晶(CHCl3),mp 138~140℃,与文献报道【24】一致;该化合物与伊谷甾醇 对照品混合后熔点不变;薄层层析显示该化合物与伊谷甾醇对照品Rf值一致.鉴定 化合物I为伊谷甾醇。 2.2.2化合物II的结构鉴定

HOH2


F培2—3 1k s觚ctI鹏of compouIldⅡ 白色粉末,易溶于水,甲醇,难溶于丙酮。在6 8.36和占8.15处各有一个单 氢单峰,处于较低场,推测可能是氮杂环上的不饱和氢产生的信号,13C-NMR谱 显示有五个不饱和碳信号,表明有可能是腺嘌呤或者鸟嘌呤,但13C-NMR谱中未 出现羰基峰,而1H二NMR谱中占7.28处有一双质子单峰,且HMBC表明此峰与
14

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第二章垫状卷柏的化学成份研究

C.5相关性较强,确定归属为6位NH2二质子,因嘌呤环的吸电子共轭效应而移 向低场。1H-NMR谱中,在占5.96处有一单氢双峰,,=6.1 Hz,在6 3.5.4.7之间 有五个氢,且13C二NMR谱中,在6 88.1,86.O,73.5,70.7、61.7处还有五个碳峰, 显示存在核糖,而且由糖上一位上的碳信号(C.1’)为占88.1判断此糖苷键为 C-N键,HMQC显示H.1’与C.8和C.4相关较强,表明确为C-N糖苷键,且连接 9位N上,确定该化合物为核糖氮苷类化合物,HMQC帮助确定H.2和H-8化学 位移,核糖上H.5’上两个氢化学位移不同,推测可能因嘌呤环对其去屏蔽效应不 同而产生,经与文献【59】中报道腺苷的数据比较,两者数据基本一致,故确定化合 物II的结构为腺苷。
1'able

2-1‘H舢(400
NO. 2 4 5 6 8 1’ 2’ 3’ 4’

MHz)趾d¨C-NMR(100 MHz)Spec臼m Data
II in

ofcompound

I)MSo.d6 13C-NMR
152.2 149.O 119.4 156.1

1H.NMR

8.15(1H,s)

8.36(1H,s) 5.96(1H,d,,=6.1 Hz) 4.63(1H,dd,-厂=11.2,5.7 Hz) 4.19(1H,d,,=3.0 Hz)

140.0 88.1 73.5 70.7 86.0

4.02(1H,m)

HO

Fig.2-4

HMBC

of compoulld II

15

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第二章垫状卷柏的化学成份研究

2.2.3化合物III的结构鉴定



MeO lP
HO

Fi92-4’Ihe

snucture of conlpoundⅡI

白色无定形粉末,nlp 241~243℃,可溶于水,甲醇,三氯化铁.铁氰化钾显 蓝色,表明该化合物分子中可能含有酚羟基。HC.NMR谱中,
占105.9,76.3,78.2, 占

71.2,78.4,62.8出现一组碳信号峰,表明该化合物很有可能为糖苷类化合物,

105.9为糖端基碳。1H-NMR谱的芳香区出现两个单质子宽单峰和一个单质子单 峰,结合13C-1心很谱研究,认为此化合物含有两个苯环,其中一个为对称取代, 另一个为非对称取代。1H-NMR谱中占4.60处有一典型的单质子四重峰(,=7.4 Hz),表明其很有可能与一个甲基相连,而且由化学位移可知其应还与一杂原子 相连,而在J 1.41(3H,d,-,=6.4


Hz)表明,确有一甲基存在。在1H姗谱中,


3.67有一个九质子单峰,表明其为A环和B环上的甲氧基信号峰。13C.N凇谱


中,

67.4表明其可能为与杂原子相连的仲碳或者叔碳,

43.0,39.9为链烃的

碳。根据C.1向低场位移推测其可能通过氧原子与葡萄糖相连。与正常伊D葡萄 糖的氢6相比,此化合物中葡萄糖中1.3,5位的化学位移均向高场移动,分别 出现在3.42(1H,m),
3.09(1H,t,J=2.8 Hz),

2.63(1H,m)处,推测可能是受

B环不同程度的负屏蔽效应所致,特别是西c.H—l,受到较强的屏蔽作用,向高场位 移1~2ppm。经与文献【60】中报道卷柏苷A(T2lm撕scinoside A)的数据比较,两 者数据基本一致,故确定化合物III的结构为卷柏苷A,2和1’两个手性碳的绝对 构型有待进一步研究。

16

垫状卷柏的化学成份研究

第二章垫状卷柏的化学成份研究

Table 2.2

1H撇(400

MHz)觚d

13C撇(100

MHz)Spectral

Data ofcoInpound

III(ill CD30D)

2.2.4化合物Ⅳ的结构鉴定





F培2-5 ne

s缸ucture of

compoundⅣ

白色鳞片状结晶,mp 270~272℃,1H-NMR谱中,J4.65(2H,d,,=2.6 Hz), 艿3.09(2H,m),6 4.19(2H,dd,‘厂=8.8,7.O Hz)和J 3.82(2H,dd,,=9.O,7.2

17

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第二章垫状卷柏的化学成份研究

Hz),根据13C.NMR和HMQC谱发现其所对应的碳分别为6 85.O,53.6,71.3,根 据各个碳上连的氢数目推测分别为叔碳、叔碳和仲碳,提示化合物分子中可能含 有取代型双四氢呋喃环结构,且取代基的取代位置具有对称性。 1H-NMR谱中,

芳香区出现一双氢单峰6 6.64,在艿3.74处有一个很高的甲氧基单峰信号峰,结 合13C.NMR推测在双四氢呋喃环上的取代基可能为两个甲氧基对称取代的苯,双 四氢呋喃环上氢化学位移及氢数目表明苯环连接在紧邻氧原子的碳原子上。根据 空间位阻推测甲氧基应连于苯环的3,5位, 也证明了这一点。乃C.NMR谱中,


HMBC中C-7与H-2和H-6的较强相关

102.7,74.1,76.5,69.9,77.2,60.9出现一组碳


信号峰,表明该化合物很有可能为糖苷类化合物,

102.7为糖端基碳,糖连接到

苯环的对位。以上数据与文献16lJ报道一致,故鉴定为丁香脂素.4,4’-D.双毋D.葡萄

糖苷(s灿garesin01-4,4’-Dbis毋D-glucoside)。
Table.2.3 1H.NMR(400 MHz)髓d 13C-NMR(100

M】陇)SpeC仃al Data ofcompound
13C-NMR
133.8 104.3 152.6 137.1 152.6

盟【垫望坠墨Q:堂
No.

1H二NMR

6.“(1H,s)

6.64(1H,s) 4.65(1H,d,,=2.6 Hz) 3.09(m) H-仅3.82(1H,dd,J=9.O,7.2 Hz) H节4.19(1H,dd,J=8.8,7.O Hz)
1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 8’ 9’ 1”,1"’ 2”,2”’ 3”,3”’ 4",4"’ 5",5"’

104.3 85 53.6 71.3 133.8

6.64(1H,s)

104.3 152.6 137.1 152.6

6.64(1H,s) 4.65(1H,d,,=2.6 Hz)

104.3 85

3.09(m)
H—a

53.6
71.3 102.7 74.1

3.82(1H,dd,,=9.O,7.2 Hz)

H书4.19(1H,dd,-厂=8.8,7.O Hz)
4.89(2H,m)

3.20(2H,m) 3.20(2H,m)
3。14(2H,m) 3.03(2H,m) H-a 3.40(2H,m)

76.5 69.9
77.2

6",6"’

H够3.60(2H,m)

60.9

兰:Qg些

!:Z垒(!圣望:璺)
18

三鱼:垒

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第二章垫状卷柏的化学成份研究



Fig.2?6 P硼五al

HMBC

of co枷【poulldⅣ

2.2.5化合物V的结构鉴定


COOH H

Flg.2。7’Ihe structure of comp01111d V

淡黄色结晶(甲醇),nlp

121.1,115.1,114.6一组峰,提示化合物结构中很有可能存在苯环,且其中两个碳 上连有杂原子
(6

223~225℃。13C籼谱, 148.1,万145.5),且1H啪谱中6
7.40(1H,d,,=15.5 Hz),


6 148.1,145.5,125.7,

9.30(2H)表明存在两

个酚羟基,J 7.05(1H,d,/=1.6
d,,=8.1

Hz),占6.90(1H,dd,,=8.2,1.5比),万6.75(1 H'
占6.17(1H,d,,=15.9

另一个氢相间。1H姗谱中6
Hz)表明存在反式烯烃结构,
Table2-4

Hz),

表明确实存在苯环,由耦合常数可知三个氢分布为两个相邻,与

12.20(1H)表明存在一个酸质子,以上数

据与文献【62】报道的咖啡酸基本一致,故鉴定为咖啡酸(c胡Feic acid)。

1H撇(400

MHz)觚d

13C_N腿(100 MHz)Spec仃al Data ofcompoulld

V(i11 DMSO—d6)

19

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第二章垫状卷柏的化学成份研究

2.2.6化合物VI的结构鉴定


OH

胺TLC,ALCl3.EtOH显色为鲜黄色,1H邶谱中仅在芳香区有12个氢,13C-NMR
谱中,6 184.1(C.4),6 184.6(C4,’)为两个羰基碳,表明该化合物为双黄酮类化

橙黄色无定形粉末(甲醇),mp 284~286℃,HCl-Mg粉反应为阳性,聚酰

合物。1H-N凇谱中艿6.17(1H,d,J=2.0 Hz),6 6.38(1H,d,J=2.0 Hz)表明其
中一个单黄酮上6,8位未被取代,很可能为5,7.二羟基黄酮,6 6.58(2H,s)这个尖 锐单峰应为H-3,H.3”,而13C埘MR谱中6 103.7表明C.3,C.3"上的氢未被取代。

1H删R谱中6 7.92(1H,d,/=2.3 Hz),7.10(1H,d,J=8.6 Hz),7.86(1H,dd,,
=6.3,2.3 8.6

Hz)形成一个ABX系统,

占7.92(1H,d,,=2.3 Hz),占7.10(1H,d,,=

Hz)为两个间位耦合氢,根据黄酮类化合物的规律,推测4’位连羟基,3’位连

另一单黄酮。13C-N胀谱可知,与单黄酮相比,6 C.8”移向低场,化学位移值高
于6 C.6”,表明C.8”确实连有其他基团,因此推断两个单黄酮确实以3’-8”连接,

文献数据也支持这一点。1H蝴谱中J
8.8

7.50(1H,d,J=8.8 Hz),6 6.72(1H,d,,=

Hz),根据耦合常数及氢的数目推测此信号峰为苯环上对位取代时形成的

ABA,B,系统,以上数据与文献【63】报道的穗花杉双黄酮一致,故鉴定为穗花杉双黄

酮(锄entonavone)。

垫状卷柏的化学成份研究

第二章垫状卷柏的化学成份研究

Table2-5

1H-NMR(400枷№)and

13C撇(100 MHz)spec砌Data
M甜姗ol-d4)

ofcompound

VI(i11

2 3 4 5 6 7 8

166.5

6.58(1H,s)

103.7 184.1 166.2

6.17(1H,d,I,=2.O Hz) 6.38(1H,d,,=2.O Hz)

100.5 166.5 95.5 159.7 105.6 123.5


10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 2" 3" 4" 5" 6" 7” 8" 9" 10" 1”’ 2”’ 3"’ 4w 5… 6"’

7.92(1H,d,,=2.3 Hz)

129.2 117.7 161.3

7.10(1H,d,,=8.6 Hz) 7.86(1H,dd,J=6.3,2.3 Hz) 6.58(1H,s)

121.9 133.1 166.5 103.7 184.6 163.5

6.36(1H,s)

100.4 166.4 104.3 156.8 105.7 123.5

7.50(1H,d,,=8.8 Hz) 6.72(1H,d,/=8.8 Hz) 6.72(1H,d,,=8.8 Hz)

129.6 117.2

162.8
117.2

7.50(1H,d,,=8.8 Hz)

129.6

2.2.7化合物vII的结构鉴定
H OH

F培2-9 1k s咖cturc

of compound VⅡ

2l

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第二章垫状卷柏的化学成份研究

黄色针状结晶(MeOH),mp 345~347℃。HCI-Mg粉反应为阳性,聚酰胺 TLC,ALCl3.EtOH显色为鲜黄色,1H.NMR谱中仅在芳香区有7个氢,13C.NMR 谱中,6 181.7为羰基信号峰,另外还有14个芳香碳,提示该化合物为黄酮类化

合物,1H撇谱中66.19(1H,d,J=8.0

Hz),6 6.47(1H,s)表明其中一个单黄

酮上6,8位未被取代,很可能为5,7.二羟基黄酮,6 6.77(1H,s)这个尖锐单峰应 为H.3,而13C-NMR谱中6 103.7表明3位上氢未被杂原子取代。1H-NMR谱中占
7.93(1H,d,,=8.7 Hz),6.94(1H,d,J=8.6 Hz),根据耦合常数及氢的数目推测此

信号峰为苯环上对位取代时形成的AA’BB’系统,以上数据与文献f24】报道的芹菜素 基本一致,故鉴定为芹菜素(apigellin)。
1'able2-6

1H猢(400

MHz)觚d

ljC啪(100

MHz)Spe曲m D比I

ofconlpound

VII(illCD30D)

No. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’

1H.NMR

”C.NMR
163.7 102.8 181.7

6.77(1H,s)
12.95(1H,s) 6.19(1H,s)

157.3 98.8 164.2

6.47(1H,d,J=8.O Hz)

94.O 161.4 103.6 121.1

2’
3’ 4’ 5’ 6’

7.93(1H,d,户8.7 Hz)
6.94(1H,d,,=8.6 Hz)

128.4 115.9 161.1

6.94(1H,d,,=8.6 Hz) 7.93(1 H,d,/=8.7 Hz 2

115.9 128.4

垫状卷柏的化学成份研究

第三章垫状卷柏中穗花杉双黄酮的含量测定

第三章
垫状卷柏

垫状卷柏中穗花杉双黄酮的含量测定 (&矗蚋e妇p“如打缎触(hook et Grev)Ma)【im.)
具有活血通经之

功效,用于经闭痛经、跌打损伤,炒炭后可化瘀止血。我们在对其进行的系统化 学成分研究中,发现穗花杉双黄酮为其主要成分,相对含量较高。文献报道,穗

花杉双黄酮具有细胞毒活性和抗肿瘤作用【29】,抗病毒【411,抗判叫,抗氧化【651等作
用。鉴于穗花杉双黄酮为垫状卷柏的主要活性成分之一,其含量的高低可以作为 评价垫状卷柏内在质量的参考指标,通过结果发现利用反相高效液相色谱法测定 垫状卷柏中穗花杉双黄酮含量的方法比较可行。色谱条件,色谱柱:elite.ODS
(250x4.6

n蚰,5pm);流动相:甲醇.0.05mo儿磷酸二氢钠溶液系统(梯度洗脱,

0.20miIl,50%.70%);柱温:40℃:流速:1.5ml/商n;检测波长:330 nm。结果
表明,在0.2.3.O¨g范围内线性关系较好,相关系数r=0.9999,平均回收率为98.28 %,RSD为1.93%。本法灵敏、简便、准确。在此基础上本文对山东、辽宁、湖北、 河北、吉林五个产地的垫状卷柏分别进行了考察,以期对垫状卷柏质量标准的建 立能够提供参考。 3.1仪器与试剂 3.1.1仪器
Aglient

1100分析型液相色谱仪;A西ient 1100型紫外检测器;Aglient



100色

谱工作站。 3.1.2试剂与样品

甲醇为色谱纯,水为重蒸馏水。对照品穗花杉双黄酮由垫状卷柏中分得,肿LC
法测定其纯度为99.458%。样品1:山东产,批号:20070322;样品2:辽宁产,批号: 070109;样品3:湖北产,批号:050202001;样品4:河北产,批号:20070708;样 品5:吉林产,批号:06012018。五种样品经浙江大学生物仪器学院教授田景奎鉴定

为垫状卷柏&蛔g切P砌p咖加幻Ma)【iln。
3.2方法与结果 3.2.1对照品的制备 垫状卷柏(.娶p“如拥口幻Ma)【illl.)干燥全草12.5蝇,70%乙醇加热回流三次,减 压回收溶剂,浓缩至1:1(19药材InL。1),得土黄色混悬液,4000 r.mind离心,得沉

垫状卷柏的化学成份研究

第三章垫状卷柏中穗花杉双黄酮的含量测定

淀和上清液。溶液部分过Dlol型大孔树脂,分别用水,30%乙醇,70%乙醇,95% 乙醇梯度洗脱,每个梯度洗脱3.5个柱体积,分别浓缩成干膏,70%乙醇洗脱部分 (80 g)经聚酰胺柱层析,氯仿-甲醇(10:0~5:5)梯度洗脱,共得186个流份; 第115.142流份经硅胶柱层析,氯仿.甲醇(10:0~5:5)梯度洗脱,再经SephadeX LH.20凝胶柱层析,甲醇洗脱即得。经HPLC法测定其纯度为99.458%。其理化 性质及波谱数据如下:橙黄色无定形粉末(甲醇),mp 284~286℃,HCl-Mg反

应为阳性。1H蝴(CD30D,400
d,,=8.8

MHz)6 7.92(1H,d,,=2.3Hz,H-2’),7.86(1H,

m,H-6’),7.50(2H,d,,=8.8 Hz,H一2”,'6"’),7.10(1H,d,,=8.6Hz,H-5’),6.72(2H, Hz,H-3"’,5"’),6.58(2H,s,H一3,3"),6.38(1H,d,J=2.0Hz,H-8),6.36
184.6

(1H,s,H一6”),6.17(1H,d,,=2.O Hz,H一6)。”C-NMR(CD30D,100 MHz)6

(C-4”),184.1(C.4),166.5(C-2,7),166.4(C?2"),166.2(C-7"),163.5(C一5), 162.8(C4”’),161.3(C-4’),159.7(C一9),156.8(C-9"),133.1(C一6’),129.6 (C-2"’,6”’),129.2(C一2’),123.5(C一1’,1"’),121.9(C-5’),117.7(C一3’),117.2 (C一3"’,5"’),105.7(C-10”),105.6(C-10),104.3(C一8”),103.7(C一3,3”),100.5

(C.6),100.4(C.6’’),95.5(C.8)。各种数据综合解析并与文献嘲对照一致,确定
其结构为穗花杉双黄酮(图谱见第二章垫状卷柏化学成分的结构鉴定项VI的结构 鉴定)。

3.2.2色谱条件:色谱柱:el沁.ODS(250×4.6姗,5pm);流动相:甲醇.0.05
mol/L磷酸二氢钠溶液系统(梯度洗脱,0.20miIl,50%.70%);柱温:40℃:

流速:1.5IIll/珈liIl;检测波长:330啪。理论塔板数按穗花杉双黄酮峰计算大于10000
(10474)。

3.2.3对照品溶液的制备 精密称取穗花杉双黄酮对照品1.0000mg于5m1容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至 刻度,配成0.2000mg/ml的对照品溶液。 3.2.4供试品溶液的制备 将上述5种卷柏药材样品粉碎,过50目筛,精密称取约1.ooOg,置索氏提取器 中,加氯仿801n1回流脱脂至无色,过滤,残渣挥净氯仿后加入甲醇80m1, 加

热回流提取至溶液无色,过滤,提取液蒸干,残渣加甲醇使溶解并定容至50ml, 摇匀,即得。 3.2.5线性关系考察

垫状卷柏的化学成份研究

第三章垫状卷柏中穗花杉双黄酮的含量测定

精密吸取穗花杉双黄酮对照品溶液(O.2000mg/m1)1、3、6、9、12、15pl 依次进样,按上述色谱条件测定,记录色谱图,以峰面积(Ⅵ对进样量Gp进行线性 回归分析,得线性回归方程:Y-532.79X-4.5114(r=0.9999)。结果表明,在0.2—3.O“g 范围内,穗花杉双黄酮峰面积与进样量有良好的线性关系。 3.2.6精密度试验 精密吸取上述对照品溶液4“1,重复进样6次,测定峰面积,结果见表3.1。RSD 为1.31%。 表3.1精密度考察结果
Tab.3.1 l沁sultS of P他cision hⅣeStigation

2041.6 2063.8 2060.3 2012 2005.8

2063.70

1.31%

3.2.7性试验 按上述色谱条件,取样品l供试液10“l,分别于0、4、8及16h测定,结果见表3.2, 表明在测定条件下,于16h内测定结果稳定。 表3-2稳定性考察结果
T.ab.3—2 R-esults of

Stabil时Investigation

O 4 8 16

6468。6

罢鬈;
6698.5

6533.88

1.63%

3.2.8重现性试验 取样品1的干燥粉末5份,各1.00009,按上述方法处理,测定穗花杉双黄酮的 含量,结果见表3.3。

垫状卷柏的化学成份研究

第三章垫状卷柏中穗花杉双黄酮的含量测定

表3.3重现性的考察结果

№一。2

4 5

一 一一Ⅲ麟Ⅲ至|Ⅲ
Tab.3.4
6.32 6.35 6-33 6.40

Tab.3—3 ResultS ofreproducibilit)r

Investigation∞ntent mg‘g?1)



3.2.9加样回收率试验 取已知含量的卷柏样品6份,各约0.59,精密称定,分别加入穗花杉双黄酮 6.35mg,按“3.2.4供试品溶液的制备”方法制得供试品溶液,按上述色谱条件测定, 计算回收率,结果平均回收率为98.28%,RSD为1.93%。 表3.4加样回收率考察结果

Re刚ts of Recove口Rate hⅣeStigation

l 2 3

6.35 6.35

12.87 12.31 12.14 12.5l

101.58

96.93
97.56 98.12

6.35 6.35 6.35

98.28

1.93




6.37

12.37

97.23

3.2.10样品含量测定 分别精密吸取对照品溶液4pl与供试品溶液各10pl,供试品溶液各进样三 针,按上述色谱条件测定峰面积,‘外标法计算各样品中穗花杉双黄酮的含量,结 果见表3.5。

对照品.HPLC图谱

垫状卷柏的化学成份研究
●-,

第三章垫状卷柏中穗花杉双黄酮的含量测定

●硒?

m? m‘ m? №?
t丛? 一H? 缸:
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样品1.HPLC测定图谱
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样品2.HPLC测定图谱
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样品3.m,LC测定图谱
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J二一。一J L一
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一,L


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矗 壶 _

样品4.册LC测定图谱
27

垫状卷柏的化学成份研究

第三章垫状卷柏中穗花杉双黄酮的含量测定

样品5.m,LC测定图谱
图3.1对照品及各样品的HPLC测定图谱 表3.5不同采集地垫状卷柏中穗花杉双黄酮含量测定(%,n=3)

Tab.3—5锄entonavone co疵nt

iIl&恸P肋p“~f船细MaXim.of

Dim髓nt Places(%,n=3)

3.3结论与讨论 3.3.1垫状卷柏药材含有大量的叶绿素,为了避免其对C18的损伤,我们比较 了石油醚、氯仿和乙醚的脱脂效果,结果表明氯仿在脱脂和保留主成份最为理想。

选用甲醇:O.05mo儿.磷酸二氢钠溶液系统(梯度洗脱,O.20miIl,50%.70%)
的流动相,足以将穗花杉双黄酮与其它成分分开,洗脱系统的微酸性使穗花杉双 黄酮在测定中处于游离状态,分离效果较好。 3.3.2垫状卷柏中穗花杉双黄酮含量丰富,实验中所考察的五个样品,山东的 样品含量最高,其次为吉林、湖北和辽宁,含量最低的是河北,最大含量差距大 于六倍,表明不同产地的同一品种中穗花杉双黄酮含量差异较大。

垫状卷柏的化学成份研究

结论与讨论

结论与讨论
1.垫状卷柏药材含大量叶绿素,有效成分含量较低,给分离带来了一定难度, 目前已知文献【24淄’67】报道共从中分离得到8个化合物。本实验从中分得7个化合物, 其中4个化合物首次从该植物中分得。 2.在分离卷柏苷A的过程中,由于其含量很低,用普通硅胶柱除去色素杂质 后,用反相中压色谱柱分离后,又用高压液相制备才得到纯品,卷柏苷A含有两 个手性碳,但因其量太少、纯度不高而未进行绝对构型鉴定,这有待用物理化学 方法进行进一步的研究。 3.2005版中华人民共和国药典收录品种为卷柏,该属植物日趋广泛的药理 及临床研究显示了垫状卷柏潜在的开发价值。同一品种,由于产地不同质量有较 大差异,对垫状卷柏的后续开发带来一系列困难。我们在系统的化学成分研究基 础上,对其含量差异进行了初步探讨,用RP.HPLC法测定了垫状卷柏中穗花杉双 黄酮的含量,取得了较为满意的结果,该方法灵敏、稳定、重现性好,样品预处 理简单,为垫状卷柏质量标准的建立提供了一定的参考价值。

垫状卷柏的化学成份研究

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垫状卷柏的化学成份研究

攻读学位期间发表的论文

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4(6)(已录用)

垫状卷柏的化学成份研究

附录


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垫状卷柏的化学成份研究

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36

垫状卷柏的化学成份研究

附录

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垫状卷柏的化学成份研究

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垫状卷柏的化学成份研究

附录

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垫状卷柏的化学成份研究

附录

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垫状卷柏的化学成份研究



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垫状卷柏的化学成份研究

附录

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42

垫状卷柏的化学成份研究

附录

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垫状卷柏的化学成份研究

附录









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垫状卷柏的化学成份研究

附录

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垫状卷柏的化学成份研究

附录

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垫状卷柏的化学成份研究

附录

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47

垫状卷柏的化学成份研究

附录

48

垫状卷柏中穗花杉双黄酮的含量测定

附录

49

垫状卷柏中穗花杉双黄酮的含量测定

致谢





本论文完成之际,首先由衷感谢我的导师孙晓飞教授和浙江大学田景奎教授,

是两位导师的谆谆教导让我不仅学到了丰富的实验技能,也学会了为人处世的道
理。两位导师治学严谨,在我硕士的各个阶段给了我明智、中肯的指导,使得我 的论文顺利完成;感谢王淑萍老师、许琼明老师、刘艳丽老师、朱永明老师、敖 桂珍老师对我的大力支持;感谢李胜银、高小宁、李泳秀,魏丹丹、汪俊在论文 写作,定稿时的热心帮助。 感谢浙江大学生仪学院张琳老师,梁波老师(我的硕士论文主要在浙江大学 完成,其中一部分在上海中创医药科技有限公司完成)。课题组是一个比较完善 的基础及新药研发平台,田景奎老师精力充沛,学识渊博,治学严谨,注重产学

研结合,在研究思路,研究方法上给我很多指导;张琳老师处事干练,务实高效,
在硕士课题,实验过程,论文写作过程中对我悉心指导;梁波老师则在实验细节, 论文方面给我很大帮助。感谢我的同学杨悉,唐丹,孙治国,张青,陈波,刘红 梅,刘洪辉,罗镭,李增亮,田富饶,孙铭遥,谷希达在实验及生活上的相互鼓 励,交流及支持. 感谢上海中创医药科技有限公司的刘江云老师,刘老师深入简出,治学严谨,

在实验思路,细节方面对我悉心指导;感谢我的同学李胜银对我在实验,生活上
的照顾;感谢中创公司李兴尚,薛建国,周美娟,沈丽琴,李墅,司徒金荣在提 取分离,分析,试剂方面给予我的帮助。 感谢中国科学院上海有机化学研究所核磁组史丽萍老师在光谱测定时的辛勤 工作。 感谢药学院的领导对我课题的支持,帮助。 最后,感谢我的家人给我的无私关怀,坚定支持。

垫状卷柏化学成分研究
作者: 学位授予单位: 张红伟 苏州大学

本文读者也读过(10条) 1. 郑玉胜 中药卷柏化学成分和质量标准研究[学位论文]2007 2. 张红伟.张琳.孙晓飞.田景奎.杨世林 垫状卷柏化学成分研究[期刊论文]-亚太传统医药2008,4(6) 3. 谭桂山.陈立章.徐康平.郑其昌.徐智.黄朝辉.束俭辉.邓涛 垫状卷柏的化学成分研究[期刊论文]-有机化学 2004,24(9) 4. 徐智 垫状卷柏化学成分与药理活性研究[学位论文]2004 5. 赵艳平 圆枝卷柏的化学成分研究[学位论文]2010 6. 郑晓珂.毕跃峰.冯卫生.史社坡.王继峰.牛建昭 卷柏化学成分研究[期刊论文]-药学学报2004,39(4) 7. 刘锐.刘建峰.徐康平.邹辉.宋立莹.党瑞丽.邹振兴.李光.谭桂山.LIU Rui.LIU Jian-feng.XU Kang-ping.ZOU Hui.SONG Li-ying.DANG Rui-Li.ZOU Zhen-xing.LI Guang.TAN Gui-shan 卷柏化学成分研究[期刊论文]-中南药学 2011,09(8) 8. 毕跃峰.郑晓珂.冯卫生.史社坡 卷柏中化学成分的分离与结构鉴定[期刊论文]-药学学报2004,39(1) 9. 谭桂山 垫状卷柏化学成分及Selaginellin抗衰老作用与机制研究[学位论文]2007 10. 陈练.杜江 卷柏属植物化学成分研究进展[会议论文]-2006

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