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第13届国际生物奥林匹克竞赛2002实验试题2


第 13 届国际生物奥林匹克竞赛 ( 2002) 实验试题 ( 2)
刘恩山 程  红 吴光耀
( 续 2003 年第 38 卷第 4 期第 60 页)
( 北京师范大学生命科学学院 北京 100875) ( 北京大学生命科学学院 北京 100871)    ( 北京大学生命科学学院 北京 100871)   

实验 Ⅲ
   分子生物学 实验考试时间是 60 min ,40 分 试题 : 质粒 pX DNA 片段的琼脂糖凝胶电泳分离和 pX 质粒限制性内切酶酶切图谱分析 。 实验室老师严格依下述的实验室安全规则和准确 的操作给予你 5 分 。 A— 在实验时戴手套 B— 在使用电源和正确使用紫外分析灯前向老师 说明 C— 正确使用移液器 D— 在凝胶的样品槽中全量装好样品 E— 没有损坏凝胶 注意 :3~4 位学生使用 1 个电源 ,2 位学生使用 1 个紫外分析灯 !    在实验时请戴手套 !    实验室老师依次提供电源 !    技术说明 原理 电泳是分离带有电荷 、 有一定分子量和一定大小的 分子的一种广泛分析方法 。通常不相同电荷的分子在 凝胶介质上依分子量和分子大小被电泳分离 ,凝胶介质 制备时必须溶于缓冲液中 。 质粒 DNA 图谱 质粒是环状外染色体双链 DNA 分子 , 它在许多细 菌中被发现 。限制性内切酶是核酸酶 ,在一定位置上可 切断 DNA ,这位置上有 4~6 个特异的核苷酸 ( 碱基 ) 对 (碱基对 ,bp ) 序列 , 例如 Hae Ⅲ的限制性内切酶可切开 双链 DNA 的 GGCC 序列 ,但 EcoRI 限制性内切酶可切开 双链 DNA 的 G AATTC 序列 。 质粒 DNA 图谱可定位每种环状质粒的限制性内切 酶酶切的位置 。为了这一目的 ,我们需用测定不同内切 酶酶切质粒产生的 DNA 片段的长度 。质粒分子可用一 种或多种限制性内切酶进行酶切 , 被切开的 DNA 可在 电泳凝胶上迁移出致密的带 ,这个条带可用特异染料染 色而被看到 。在电泳凝胶中迁移的距离 ( 从起始点到 DNA 片段前沿的厘米数 ,cm) 与 DNA 片段长度 ( 碱基对 bp ) 的对数成负相关 。最通常用于电泳的凝胶介质之一 是琼脂糖 。琼脂糖凝胶的孔径大小正好分离分子质量

超过 100 000 的分子 。 装置 琼脂糖凝胶电泳的电泳槽 图 1  (4) 装有两个电极的槽 ; ( 5 ) 是阴极 ; ( 6 ) 是阳 极 ; (7) 在电泳之前凝胶用缓冲溶液覆盖 ; ( 1 ) 含有混合 DNA 分子的样品被放在样品槽中 , 样品槽是在制备凝 胶时用梳子制成 ; (2) 是凝胶 ; ( 3 ) 是凝胶的支持架 ; ( 8 ) 在连接电源进行电泳之前用盖子盖上 。

图1  用于凝胶电泳的电泳槽

可调液体体积的移液器用于移液 。

图2  可调体积的移液器

移液器的使用 1. (3) 用于调节移液器的量 , ( 2 ) 控制体积的监视 器 ,放在适当的体积上 ! 在这一实验中 , 你需要调到 5 μ 和 10 μ 两种体积 。在监视器上两种体积的正确位置 l l 如图 3 所示 。

图 3   μ 和 10 μ 在监视器上的正确位置 5 l l

2. 将黄色移液器头 [ 图 2 , (1) ] 放在移液器上 。    没有移液器头不能移液 ! 3. 压移液器上面的按钮 [ 图 2 ( 4) ] 轻轻地放在第 1 停止位置上 ,并放移液器头于液体 ( 样品) 中 [ 图 4 ,A ] 。 4. 慢慢释放按钮抽取样品 ( 图 4B) 。 5. 将含有液体的移液器头放到要放的地方 ( 其他收 集液体的地方或凝胶的样品槽 ) ,且压移液器上面的按 钮直到移液器中收集的液体全部放出 ( 图 4. C) 。

2003 年第 38 卷第 5 期                   生 物 学 通 报

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图4  移液的步骤

6. 移液器放出液体后 ,放松按钮 ( 图 4D) ,并撤换用

   各加 5μ ×G 到 B + C 和 B + D 内切酶酶切的 2. L2 LB DNA 样品管中 , 混合后各加 10 μ 到凝胶的 NO. 3 和 L NO. 4 中 。 3. 盖上电泳槽盖 ,举手告之老师 ! 不要加电源 ,这由实验室老师完成 ! 电泳 20 min ,注意时间 ,否则会丢失 DNA 片段 ! 在 — 52 —

过的移液器头 ,将移液器头放到废物桶中 ,如右图所示 。    每种溶液或样品必须用新的 移液器头 !    在开始转移 DNA 样品之前你 可以试用一次 ,用 1 个移液器头在 电泳槽中移一次缓冲液 。 试剂和材料 1. 已经准备了 0. 8 %琼脂糖凝胶 ,制备了 0. 5 ×TAE 缓冲液 。 2. 电泳装置放满了 0. 5 ×TAE 缓冲液 ( 20 mM Tris2 乙酸缓冲液 ,内含 0. 5 mM EDTA ,pH = 8. 0) 。 3. 2xG 凝胶加样缓冲液 ,在体积分数 10 %的甘油 LB 中含有质量分数 0. 05 %溴酚兰 。 4. 标准 DNA ( ST DNA) 已与加样缓冲液混合 ( 下面 2 有更详细的说明) 。 5. B + C 和 B + D 各 5 μ ,分别用 B + C 和 B + D 限 L 制性内切酶切的质粒 pX DNA ( 详细的解释见 Q2) 。 将 DNA 样品放到荧光染料 Vistra Green 中成有荧光 的 DNA ,染料是 1∶ 000 被稀释的 。这用于所有被酶切 10 的质粒 pX DNA ,质粒 pX DNA 的长度是 4 360 bp 。 实验 ( 第 1 部分) 上样 的凝胶板上的样品槽中 ,如图 5 所示 。
1. 将标准 DNA ( ST DNA) 各 10μ 放到 No. 2 和 No. 5 2 L
图5

这段时间内回答下述问题 。    问题 ( 第 1 部分 ,在电泳时回答) Q1   已知电泳缓冲液是 pH8. 0 ,DNA 从阴极迁移到 阳极 。 在答卷上回答 Q1 的问题 ,DNA 分子带什么电荷 ? A. 负电荷    中性 B. C. 正电荷    不可测出 D. 哪种下述成分是 DNA 电荷的主要决定者 ? E. 嘌呤          嘧啶 F. G. 脱氧核糖        磷酸集团 H. I. DNA 链之间的氢键   J . 都不是 Q2   DNA 片段的计算 ( 1) 凝胶电泳图表明标准 DNA 和质粒 pX 被 4 种内 切酶 A 、 、 、 酶切分离的片段 ( 图 6) 。 B C D (2) 质粒 pX 的大小是 4 360bp ,每种限制性内切酶 酶切 pX DNA 只有 1 个位点 。 (3) 酶 A 的酶切位置在质粒的酶切图谱的起始点 。 (4) 酶 A 和酶 B 一起将 DNA 切成两个片段 , 短的 一段是 380 bp 。   ( 5 ) 标 准 DNA 带 中 ( 图 6 第 1 泳 道 ) 长 度 分 别 为 3 000 bp ,2 000 bp ,1 500 bp ,1 200 bp ,1 031 bp ,900 bp ,800 bp ,700 bp ,600 bp ,500 bp ,400 bp ,300 bp ,300 bp ,200 bp , 100 bp 。500 bp 的带较宽但不太清楚 。 在 500 bp 以下更短的 DNA 片段显色很弱或看不 见。    判断 Q2A  在标准 DNA 中 ( 图 6 ) 用 罗 马 字 母 标 出 的 DNA 的碱基对 ( bp ) 是多少 ? 在表 Q2A 中回答这一问 题。

图6  质粒 pX 酶切片段的电泳分离结果    在凝胶的泳道数标在上面   2标准 DNA 片段   2用 1 2    酶切的 pX   2标准的 DNA 片段 5    + C 酶切的 pX   2用 A + D 酶切的2pX   2用 C + D A 3 4

Q2 B   在图 6 中用罗马字母标注了标准 DNA 的迁 移距离 ( cm) ,对应已确定的 DNA 片段的长度 ( bp ) ,对照

生                   物 学 通 报 2003 年第 38 卷第 5 期

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Q2B 回答 Q2A 作图计算 。 在 X 轴 上 ( 从 加 样 槽 到 区 带 前 沿 的 距 离) , Y 轴 [DNA 的长度 ( bp ) ] 。 Q2C   用作图决定 2 ,3 ,4 泳道正中 DNA 片段的大 小 ( bp ) ,在答卷纸上将答案写在表 Q2C 中 ( 许可的误差 在标准值 ± %) 。 10 Q2D   在样品 A + C 中 ( 泳道 2 , 图 6 ) , 在与上样缓 冲液混合后 DNA 浓度是 150 ng/μ 。用 10 μ 上样 。 L L 在凝胶上 , 上样的 DNA 是多少 ( ng) ? 在答卷纸表 Q2D 的空 1 中回答 。 在第 2 泳道 [ 图 6 (A + C) ] 的每一个带的 DNA 的量 是多少 ( ng) ? ( 假如所有上样 DNA 都分布在两条带中 )

在质粒图谱 ( 图 7) 中 C 和 D 酶切可能的酶切位点 ,可使 用 Q2C 的结果 ! 实验 ( 第 2 部分) 电泳开始后 20 min ,老师将给你切断电源 ! 注意提 醒实验教师时间 ! 此后 : 1. 将凝胶和凝胶支持架一起放在托盘上 ,再将它放 在紫外灯下 ,指出有多少带 。 2. 放好紫外灯的屏敝保护 。 3. 将凝胶放在紫外光下 。 4. 关闭保护屏开启紫外光 。    没有屏蔽保护时不要开紫外灯 !    在紫外光下不要去除保护屏 ! 5. 观察 DNA 带的影像 ,画出带的位置图并回答 Q3 。 在你的图中 DNA 带要精确对应标准 DNA 的位置 。 6. 关闭紫外灯取出凝胶及凝胶支持架 。 7. 用纸巾清洁你的手 ,并回答问题 。 问题 ( 第 2 部分 ,依凝胶中分离的片段回答问题) Q4A   确定酶切 DNA 片段的序列长度 ( bp ) , 用标 准 DNA 的带比较样品带的位置 。在答卷纸上回答 。在 Q4A 表中 ,空 3 和空 4 分别对应泳道 3 和 4 ( 许可误差 ± 20 %) 。 Q4 B   用图 6 的凝胶图和你自己凝胶的资料在质 粒的图谱中确定酶 C 和酶 D 酶切的位置 ( 答卷的 Q4B) (BH)    填在图上的空中 。

在表 Q2D 的第 2 空中回答长 DNA 片段的量 , 在 Q2D 的 第 3 空中回答最短的 DNA 片段的量 ( ng) , 均在答卷纸 上回答 ,许可误差为 ± % 。 10

图7

在等待凝胶电泳时 ,如果还有时间你可以开始考虑

浅议 “气孔能够通气的演示实验”
姚宝骏
( 九江市教研室 江西九江 332000)

   在一次听课中我注意到 ,学生们在做初一新教材教 师用书 ( 第 104 页) 所介绍的 “气孔能够通气的演示” 实 验时 ,在所有的实验中都只是在叶片的几处有气泡冒出 ( 少则只有一处或没有 , 一般 3 ~ 5 处 ) 。为什么气体仅 从几处冒出 ? 叶片上气孔众多 ,在 1 个放大 100 倍的菠 菜叶片背面的视野里大约有 200 个气孔 ,正如教师用书 中所列数据 1 片叶子背面的气孔数多达上万个 ,密密的 分布在叶的下表面 。如果气体是从气孔冒出 ,则只几处 冒出气体这一现象纯属偶然 ,与气孔的通气没有必然的 关系 。稍加仔细观察 ,发现叶片上迅速冒泡的地方是叶 片的破损处 。那么 ,对于一些看似完整的叶片 , 又是怎 ) 么一回事呢 ? 我通过双目解剖镜 (100 × 作了进一步的 观察 。发现这些叶片的冒泡处都有细微的破损 ,肉眼很 难发现 。同时 ,这些破损虽然细微 ,但均远大于气孔的直 径 。另按书上所说 ,如果将叶片撕掉一部分 ,则进行实验 时 ,气泡多是从叶脉断口处冒出 ,而不是从气孔冒出 。

还有 ,书上介绍所用的材料是开始发蔫的菠菜叶 。 从理论上说 ,如果形态学上已经表现出萎蔫 , 则生理上 的缺水早已发生 ,那么气孔应关闭 。通过显微镜观察也 证实了这一点 ( 并且用已出现萎蔫现象的叶片进行实 验 ,没有吹出气泡) ,因此 ,用出现萎蔫的叶片进行实验 出现气泡应与气孔无关 。之所以能从菠菜的叶片吹出 气泡 ,是与其特殊的结构分不开的 。1) 菠菜叶柄和叶脉 是空心的 ,气体主要是从此处到达叶片 ;2 ) 叶肉细胞间 隙相对较大 ,便于气体通行 。 综上所述 ,做本实验时 , 实际上气体并不是从气孔 冒出 ,而是从叶片的破损处冒出 。这个演示将会给学生 造成一个错误的认识 ,以为气体真是从气孔冒出 , 且叶 片只几处有气孔 。因此 ,我认为本实验不宜用来说明气 孔的通气问题 。不知我的观察是否正确 ,还请各位同仁 指正 。 (BF)    — 53 —

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