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王晓东的科研思路追踪 -不错的总结


不错的总结,特转来希望对各位有益! kaige88 http://www.sciencenet.cn/m/user_content.aspx?id=44663 ================================================================ = 第一位美国科学院华裔院士-王晓东的科研思路追踪【转载】 成功的道路不同,但是成功者的经历给人启示,值得深思。 本文系转载,特此声明!(… 来源:BBS 未名空间站 (Sat Dec 23 02:57:02 2006) 无疑,王晓东已经成为中国生物学研究实力的象征。转贴者读硕士时曾经有幸现场聆听晓东博士的讲课。我 想告诉大家的是,晓东博士的博士经历非常非常的一般,他的成功完全来自于他博士后所取得的成绩。我想 这也是为什么原作者一开始就从晓东博士的博士后经历开始讲起的原因吧!今天看到一篇帖子,觉得对所有 的研究生的弄清楚怎样做研究是非常有用的。 启示: 由于王晓东的研究逻辑清晰,方法简单明了,在按时间顺序阅读文献的过程中,通过预测文献的内容以及当 年王晓东即将开展的工作,我得到了象看推理小说一样的乐趣。而预测之外的许多工作都让我茅塞顿开,受 益匪浅。正是这些乐趣与受益支撑我花很多时间和努力看完文献并写下此文。 这种受益是全面的:不同 assay 的微小差别决定了纯化得到的蛋白的不同;体外重建的清晰性给我留下了很 深的印象;我发现有几篇文章的内容和质量都远远超出所发表杂志的要求,而国内实验室肯定会牺牲竞争需 要的时间往高分杂志投,或者将文章拆成几篇;文章文字的简洁;通过突变分辨是自剪切还是其它蛋白的剪 切;体外实验应该取得体内实验的支持;为了确证最好用不同的细胞株不同的调亡刺激重复实验;对于王晓 东为何在高度竞争的领域能一直处于领先,我有了自己的一些猜测;对于调亡的研究,我有了自己的一些想 法…… 正文 本文是我在博士阶段写的基础综述。这篇综述花了我相当长的时间,我看了王晓东实验室所有的文章,甚至 将他讲课的故事和他 E-mail 给我的 essay 都揉了进来,思路是理清楚了,语言却还是晦涩的,有些甚至是卖 弄的和夸张的。本来想着有时间再整理润色一下,然而交差之后一年过去了,这篇文章却仍然躺在电脑的某 个角落。我相信对王晓东感兴趣的人很多,却少有人真正去研究他的文献,理解他的工作思路。尽管文字晦 涩,相信感兴趣的人还是能从这篇综述中获得某些信息。物该尽其用,把它贴出来,权当献给 Biology 板的圣 诞礼物吧。 凋亡的线粒体途径-王晓东的科研思路追踪 关键词:调亡、程序性死亡、线粒体、caspase、王晓东 摘要:凋亡的线粒体途径是生物学界阐明得最为明确的信号通路之一,是发展最为迅速的领域之一。在此领 域中贡献最大的当属华人科学家王晓东。他利用经典的生化技术无可辩驳地发现并梳理了这一通路。本文通 过系统研究王晓东的论文,试图追踪王晓东的科研思路,并以此为主,再现这一领域激动人心的发现历程。

故事外的故事 四年前,我在走进教室的时候碰到了风尘仆仆的王晓东。王穿着灰色调的衣裤,背着一个很土的绿包,身体 不是很挺拔,脸宽大且棱角分明,要不是走路的时候有一些坚定,很容易被别人当作进城的打工汉。他从最 简单的开始讲起,科研需要三板斧,要是能掌握两板也不错……渐渐地教室的气氛有点反常,好像大家都在屏 息一样:他在讲他和学生刘雪松进行纯化蛋白比赛的故事……及至他用漂亮的数据图将结果展现给我们的时 候,我们才象听了一次武侠传奇一样如梦方醒。王循序渐进、清晰明了、讲故事般的授课方式给我留下了很 深的印象。为了加深这种印象,两年之后我又和师弟师妹们一起再次听了他的课。而当时我刚好有纯化一个 未知因子的打算,于是我浏览了他的实验室主页。在我粗粗翻阅了他发表的文献之后,我惊奇地发现他的重 要发现基本上都是用“建立体外检测体系-跟踪纯化活性”的模式进行的。我对这一模式的有效性产生了很大 的兴趣。当我在博士三年级被要求写综述的时候,我决定研究他的论文,把这一模式彻底搞清楚。 从博士后研究开始-技术训练与选题的由来 1991-1995 年,王晓东在美国德克萨斯大学西南医学中心进行博士后训练,师从诺贝尔奖获得者 Joseph L. Goldstein 和 Michael S. Brown 教授,从事胆固醇调节基因的表达调控的研究。1993 年,王和他的同事利用 gel shift assay 跟踪纯化,从 Hela 细胞核中分离出了与低密度脂蛋白 promotor 的调控序列相结合的蛋白 SR EBPs1,2。这是王最早操练“体外 assay 跟踪纯化进程”的方法,王正是利用这种方法随后在凋亡领域做出了一 系列令人炫目的实验。SREBPs 是膜定位蛋白,它的膜结合域被蛋白酶切除后,才能进入核内,调控低密度脂 蛋白的表达。基于 SREBPs 被细胞裂解液中的蛋白酶活性切为两个片断的现象,王晓东建立了体外 assay,跟 踪活性,通过不同性质的一系列纯化柱,部分(partially)纯化到了这个蛋白。对蛋白的两个片断序列分析表 明它与后来统一命名的 Caspase 3 (cysteine-containing aspartate-spicific protease)同源 3。 而之后的实验表 明 Caspase 3 本身在细胞凋亡中也能够剪切 SREBPs, 凋亡通路通过这种方式干扰膜蛋白的代谢, 从而导致细 胞膜泡状化(blebbing)4。研究的不断深入将王晓东的目光从胆固醇调节基因转向了凋亡。 传奇的前奏-细胞调亡的研究背景 细胞凋亡是由基因编码控制的程序化死亡。凋亡的细胞形态上发生很大的改变:胞体变小,胞浆浓缩,核染 色质密度增高,细胞膜内陷形成凋亡小体等。最后凋亡的细胞被巨噬细胞吞噬而消亡。细胞凋亡在胚胎发生 过程负责清除多余的细胞。在当时,人们用遗传学的方法鉴定了三个控制线虫发育过程中细胞凋亡的基因:c ed-9 ,ced-3 和 ced-4。基因 ced-9 编码的蛋白抑制细胞凋亡,已知它在人中对应的蛋白是 bcl-2;而 ced-3 和 ced -4 编码的蛋白则促进细胞凋亡。其中 ced-3 基因编码一种富含丝氨酸的蛋白酶。1993 年,复旦毕业的华人 学生袁钧英用蛋白序列分段检索的办法巧妙地找到了 ced-3 蛋白在人中的同源蛋白:它们隶属于 ICE(interl eukin-1-converting enzyme)蛋白酶家族 5。其中 caspase 3 的序列和功能与 ced-3 最为接近。Caspase 3 特异地在天冬氨酸残基的位置剪切底物蛋白(比如前面说的 SREBPs),而自己本身在细胞凋亡中也在天冬氨 酸的位置被剪切为两个片断。人们推断有一个 caspase 级联(cascade)放大的过程控制凋亡的发生。当时生 物学界蓄势待发,很多生物学家都酝酿着回答这个问题:细胞是通过什么途径执行凋亡程序的 6。 核心故事-凋亡体(apoptosome)的发现 1995 年王晓东完成博士后训练,组建了自己的实验室。他显然已经决定将寻找凋亡通路中的蛋白定为实验室 未来的研究方向。 顺着以前的研究而上,他首先想鉴定直接剪切 caspase 3 的蛋白酶究竟是什么。当仓鼠肝细胞组织匀浆液与 caspase 3 温育后,caspase 3 被其中的蛋白酶剪切成两个片断。追踪这个活性,他实验室纯化得到了这个蛋

白,测序结果显示它也是一个 ICE 蛋白酶的成员,与人的 caspase 2 高度同源 7。仍然是“体外 assay 跟踪纯 化进程”这一套,王已经掌握程咬金的“三板斧”了。 王晓东意识到 caspase 3 的剪切是凋亡的一个简单的检测指标,通过它建立体外 assay,跟踪活性,可能可以 找出细胞凋亡的通路。首先他想找到在体外能刺激启动凋亡的小分子。他把手头有的激酶、去磷酸酶抑制剂、 核苷酸等,加入到未启动凋亡的 Hela 细胞质裂解液中。非常幸运地,他筛选到 ATP 或 dATP 能够激活细胞裂 解液的凋亡反应:1、caspase 3 被剪切激活,2、下游分子 PARP 和 SREBP 能被激活的 caspase 3 剪切,3, 当用激活的细胞质裂解液与仓鼠肝细胞的细胞核温育,细胞核的 DNA 被分解成核小体片断大小的 DNA,这是 细胞凋亡的经典指标。 借助于 caspase 3 被剪切和细胞核 DNA 分解这两个 assay,王对细胞质裂解液进行分级纯化,跟踪引起凋亡 的活性组分。当他们过第一个纯化柱后,发现结合在柱子上的蛋白和通过柱子的蛋白只有重新混和在一起后, 才能对 dATP 有凋亡反应。这表明两个组分可能分别代表一个凋亡反应蛋白。通过固定一个组分跟踪另一个 组分的方法,王和他的第一个学生刘雪松展开了竞赛:看谁先纯化到其中的一个蛋白。但是老***被新兵打败 了。刘雪松发现用 50%(90%?)硫酸铵沉淀组分后,活性成分仍然处在上清中,而此时的上清其它蛋白已 经很少了,很快地,刘雪松把组分纯化到了一条带。传奇有时候是由巧合加运气造就的。这条带在 PAGE 胶 上竟然是紫色的。王对它的光谱进行分析,发现它的光谱与细胞色素 C 一样,而蛋白测序的结果也确证了这 个结论。王对于花这么大功夫纯化到在公司可以轻易买到的蛋白感到万分沮丧,而细胞色素 C 是线粒体电子 传递链中的组分,它本不应该分布在细胞质裂解液中,另外对于线粒体在凋亡中有什么作用,王是没有一点 头绪。 慢着! 前面提到的抑制凋亡的 bcl-2 蛋白就是分布在线粒体外膜上的。 当用细胞色素 C 的抗体特异地除掉细胞 色素 c 后,细胞质裂解液也不对 dATP 反应。进一步地,王证明是因为破碎细胞的时候过于粗暴,线粒体在制 备细胞质裂解液中被破坏了,如果加入蔗糖保护线粒体,裂解液将不再对 dATP 起凋亡反应(错误造就了发 现!)。最后,如果用凋亡分子刺激细胞,王发现细胞色素 c 的确从线粒体释放到细胞质中。这些实验无可 辩驳地证明了线粒体参与了凋亡的反应 6。 王晓东纯化的那个组分在过另外一个纯化柱后又分成了两个必需组分,顺理成章地,这两个组分最后被纯化 并命名为 Apaf-1 和 caspase 98,9。谜底揭开了:Apaf-1 正是线虫 ced-4 在人中的同源蛋白,而这些结果进一 步说明细胞色素 c 在凋亡中的作用无可置疑。 王将研究的注意力集中在阐述这三个蛋白的相互关系上。 Apaf-1 通过 N 端的 CARD 结构域与 caspase 9 相互结合,通过 C 端的 WD 结构域与细胞色素 c 相互结合,通 过 Walker’s 结构域与 ATP/dATP 相互作用。因为与 Apaf-1 共沉淀的多为 ADP 而非 ATP 形式,加之不能水解 的 ATP 类似物 AMP-PNP 或者 ATP-γ-s 不能导致 caspase 3 剪切,王当时推测 ATP 的水解是必需的。但是同 期与其他科学家合作的发现让王重新审视了这一设想:通过比较 Apaf-1 和在果蝇中的同源蛋 DARK 的序列发 现,原先被认为负责 ATP/dATP 降解的两个氨基酸在 DARK 中并不保守,这提示 ATP/dATP 的降解在凋亡反 应中也许并 不是必须的。进一步的实验结果验证后者才是正确的:与纯度更高的 Apaf-1/caspase 9/cytochrome c 复合 体结合的主要形式是 dATP 而不是 dADP;复合体在凋亡前后结合的 dATP 并没有被降解为 dADP;ATP 的另 外一个非降解类似物 ADPCP 同 ATP 一样可以启动凋亡。 通过重组表达蛋白的体外重建系统,以及后来与其它实验室合作对复合体结构的研究结果,王的实验室清晰 地描绘了这些蛋白在凋亡中相互作用的情景:细胞收到凋亡信号刺激后,细胞色素 c 从线粒体中释放到细胞 质,它与 Apaf-1 作用增进了与 ATP/dATP 的结合,与 ATP/dATP 的结合使 Apaf-1 蛋白 CARD 结构域相互作 用多聚化, 形成的含有 7 轴对称的蛋白和核苷酸的复合体被命名为凋亡体。 凋亡体中的 Apaf-1 结构发生改变, 招募 caspase 9 并导致 caspase 9 被剪切成两段,从而被激活。激活了的 caspase 9 进一步地剪切 caspase 38-12。 王的以上发现在生物界扔了一颗重磅炸弹,很多科学家参与到细胞凋亡的领域中来,竞争开始变得非常激烈, 而凋亡的研究也在飞速发展。 乘胜追击-凋亡体上游与下游执行蛋白的发现

顺流而下,capspase 3 的激活导致了细胞核 DNA 被剪切成核小体 DNA 大小的片断,那么中间的执行者是什 么蛋白呢?如果将激活的 caspase 3 加入 Hela 细胞裂解液并与仓鼠肝细胞核温育,细胞核内的 DNA 被剪切 成片断。这说明裂解液中存在执行蛋白。通过以上的体外 assay,跟踪裂解液纯化的过程,鉴定出两个异源二 聚体蛋白:DFF45 和 DFF4013。DFF40 是其中的活性蛋白,DFF45 是 DFF40 的伴娘分子(chaperone),如 果没有 DFF45 共表达帮助折叠,单独表达的 DFF40 没有剪切染色质 DNA 的活性。同时 DFF45 抑制 DFF40 的活性,DFF 复合体本身没有活性,激活的 caspase 3 把 DFF45 剪切成片断后,DFF40 才从复合体中释放出 来行使功能 13-16。 在纯化 DFF 的时候王发现了一个奇怪的现象:被激活的 DFF 与细胞核温育可以剪切染色质 DNA,但是基本上 不剪切裸露的 DNA。这促使王考虑到可能在核内存在着另外的因子介导或者帮助 DFF40 切割染色质 DNA。D FF40 本身有剪切裸露 DNA 的微量活性,但是当加入细胞核裂解液后这种活性得到了提高。据此建立 assay, 对细胞核裂解液进行分级纯化,鉴定出这个蛋白是 HMG-217。相似地,HMG-1 和 histone 可能通过招募的方 式也能提高 DFF40 切割裸露 DNA 的活性 15。 DFF 敲除的老鼠细胞仍然在调亡刺激后有残余的剪切染色质 DNA 的活性, 表明除了 DFF 以外有其它因子负责 剪切染色质 DNA。当时其他科学家已经发现 AIF 能从线粒体中释放并能直接导致细胞核染色质的片断化。王 想系统筛选出另外的从线粒体释放并直接导致细胞核染色质 DN***断化的因子。它将线粒体和细胞核温育, 当加入刺激线粒体释放 cytochrome c(认为此时其它因子也一起从线粒体释放)的因子后,细胞核染色质 D NA 发生片断化。据此建立 assay,将处理后的线粒体上清蛋白进行分级纯化,鉴定出了 endonuclease G 蛋 白。endonuclease G 是线粒体特异的核酸酶,它单独就能够剪切细胞核染色质 DNA 和降解裸露的 DNA。Ed onuclease G 的发现进一步说明了线粒体能存在一种途径不依赖于 caspase 而导致调亡事件的发生 18。 逆流而上,王想知道什么因子影响了线粒体 cytochrome c 的释放。早在发现 cytochromec 在凋亡的作用后, 本能的反应也应该是另外一个分布在线粒体外膜的凋亡蛋白 bcl2 与 cytochrome c 有没有什么关系。王找到 两个细胞株:bcl2 低表达的 HL-60 neo 和 bcl2 高表达的 Bcl-2。用调亡刺激物刺激后,前者启动了调亡,cyt ochrome c 释放,而后者则启动调亡,也没有 cytochrome c 的释放。这个结果表明 bcl2 可能通过抑制 cytoc hrome c 从线粒体的释放来抑制调亡的 19。 进一步地,王建立了以下 assay 鉴定刺激细胞色素 c 释放的因子:加活性形式的 caspase 8 到细胞质裂解液, 与线粒体温育,cytochrome c 释放。据此,对裂解液进行分级纯化,鉴定出蛋白 tbid。Caspase 8 剪切 tbid, tbid 的 C 端片断从细胞质中转位到线粒体,引起细胞色素 c 的释放。Bcl2 可以与 tBid 结合并拮抗它诱导细胞 色素 c 释放的功能 20。 对实验现象的敏锐观察往往能有新的发现。王在实验中发现,在体内,2 小时 UV 照射后的细胞分离出来的线 粒体才能观察到细胞色素 c 的释放和 Bak 的寡聚化(Bak 寡聚化后被认为在线粒体膜上形成了孔道供蛋白通 过,Bak 的寡聚化是调亡的另一个指标)。在体外,30 分钟 UV 照射后的细胞分离出来的线粒体,在 37 度 温育 30 分钟后即可以看到等量 Bak 寡聚化以及细胞色素 c 的释放。 体内的细胞色素 c 的释放相比于体外至少 被延迟了一个小时。这进一步肯定了体内存在抑制细胞色素 c 释放的因子。将 UV 照射 1 小时后分离的线粒 体与未照射的细胞质裂解液混和,发现后者具有抑制细胞色素 c 释放的活力。跟踪这个活力对裂解液进行半 纯化,用已知的 Bcl-2 家族蛋白的抗体发现活性成分包括 Mcl-1 和 Bcl-XL。进一步的实验发现,UV 照射导致 Mcl-1 蛋白合成的停顿以及 Bcl-XL 从细胞质中转位到线粒体。前者是后者的上游事件 21。 Smac 的发现是另外又一个小现象大发现的例子。在研究 apoptosome 过程中,王发现如果在制备细胞裂解液 的溶液中加入去垢剂,caspase 3 的被剪切活性会增加,而制备了裂解液后再加入等量去垢剂则不具有这种 效应。很显然的一个推断是去垢剂增加了膜蛋白的溶解,即某种膜蛋白能提高这种活性。果然,细胞膜沉淀 后用去垢剂重新溶解的样品具有提高这种活性的能力。依此建立 assay,对细胞膜样品分级纯化,得到了 Sm ac 蛋白。通过生化实验以及与华人施一功实验室解晶体结构的合作研究,王得到了一系列重要发现。在调亡 过程中,Smac 从线粒体中释放出来,通过与 IAP(caspase 的一类抑制蛋白)相互作用,释放出与 IAP 结合 的 caspase,从而解除了 IAP 对 caspase 的抑制。在研究中,王偶然发现 GST 融合表达的 Smac 完全没有活 性,这提示 Smac 的 N 端是极其重要的。SmacN 端的四个氨基酸与它在果蝇中的同源蛋白非常保守。进一步

分析发现,体外合成的这四个氨基酸就有拮抗 IAP 的功能。Smac 发现之后,其它实验室发现了另外一个拮 抗 IAP 的蛋白 Omi/protein22-24。 值得一提的是,同时期的科学家的发现完善了调亡的线粒体途径。由于该领域激烈竞争,王对 Smac 以及之 前的 endonuclease G 研究的结果都是和其它科学家的结果同时发表在一个期刊上。 而更多的蛋白纯化鉴定出 来之后发现别人已经对它有研究了。不过王的结果都是用体外重建的方式清晰阐明的,这些结果进一步梳理 了调亡的线粒体途径(图二)。 超越-新的视角,新的起点 以上的重要发现让王晓东获得了荣誉,也使他有能力重新审视这一切,决定新一轮的研究方向。 早在 2000 年,王晓东就曾雄心勃勃地想通过体人工脂质体体外重建细胞色素 c 从线粒体中释放的过程。这表 明他的雄心早已超越他的成就。尽管这一计划没有实现,但他因此而发现了磷脂 Cardiolipin 能帮助活化的 tB id 定位到线粒体 25。 王晓东回溯过去最开始对 cytochrome c 的研究,难道当初筛选到 dATP 就是运气吗?筛选几个区区的分子竟 然就筛到了,那么体内应该有和 dATP 类似功能的能启动细胞质裂解液调亡程序的小分子吧?这种小分子还 有可能用于开发药物。通过检测 caspase 3 的活性,王筛选了 2 万中细胞成分,结果发现小分子 PETCM 能够 象 dATP 激活 caspase 3。跟踪活性分级纯化,活性成分分成三组 Q-ft(包含 cytochrome c),Q30(包含 A paf-1 和 caspase 9),Q100。这三个组分重新组合后加入 PETCM 并不能激活 caspase 3,而需要微量的 dAT P。这表示在总裂解液中内源的微量 dATP 支持 PETCM 激活 caspase 3 的活性。对 Q100 进行纯化后发现活 性组分是三个相互间高度同源相互结合的 PHAP 蛋白。但是纯化后发现单独的 PHAP 与 Q-ft 和 Q100 就能激 活 caspase 3,并不需要 PETCM。但是如果再加入 Q100,PHAP 就失去这种能力,需要 PETCM 加入才能激 活 caspase 3。这表明 Q100 中有 PHAP 的抑制蛋白。对这种抑制活性进行跟踪纯化,发现它是 Pro T 蛋白。 进一步的体内体外实验表明:PHAP 促进 caspase 9 的激活,ProT 抑制调亡体的形成,而 PETCM 则解除 Pro T 的抑制效应。这些发现也帮助解释了以前一直困扰的问题:为什么当初 dATP 需要加超过生理浓度很多时才 能激活调亡反应 26。 细胞调亡基础研究的快速发展也为应用做好了准备。例如 Smac 的 N 端氨基酸促进调亡的作用有可能用于开 发治疗癌症。王与其他人合作,积极进行这方面的研究 27。此外王晓东还将“建立体外检测体系-跟踪纯化活 性”的模式用于研究 RNAi 的机理,从果蝇中纯化到了 R2D2,它与 Dicer 2 形成的复合体能够与 siRNA 结合 并加强指向的 mRNA 的降解 28。 结语 由于王晓东的研究逻辑清晰,方法简单明了,在按时间顺序阅读文献的过程中,通过预测文献的内容以及当 年王晓东即将开展的工作,我得到了象看推理小说一样的乐趣。而预测之外的许多工作都让我茅塞顿开,受 益匪浅。正是这些乐趣与受益支撑我花很多时间和努力看完文献并写下此文。 这种受益是全面的:不同 assay 的微小差别决定了纯化得到的蛋白的不同;体外重建的清晰性给我留下了很 深的印象;我发现有几篇文章的内容和质量都远远超出所发表杂志的要求,而国内实验室肯定会牺牲竞争需 要的时间往高分杂志投,或者将文章拆成几篇;文章文字的简洁;通过突变分辨是自剪切还是其它蛋白的剪 切;体外实验应该取得体内实验的支持;为了确证最好用不同的细胞株不同的调亡刺激重复实验;对于王晓 东为何在高度竞争的领域能一直处于领先,我有了自己的一些猜测;对于调亡的研究,我有了自己的一些想 法…… 1. Briggs MR, Yokoyama C, Wang X, Brown MS, Goldstein JL. Nuclear protein that binds sterol regul atory element of low density lipoprotein receptor promoter. I. Identification of the protein and deline ation of its target nucleotide sequence. J Biol Chem. 1993;268:14490-14496

2. Wang X, Briggs MR, Hua X, Yokoyama C, Goldstein JL, Brown MS. Nuclear protein that binds ster ol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. II. Purification and characterizatio n. J Biol Chem. 1993;268:14497-14504 3. Wang X, Pai JT, Wiedenfeld EA, Medina JC, Slaughter CA, Goldstein JL, Brown MS. Purification of an interleukin-1 beta converting enzyme-related cysteine protease that cleaves sterol regulatory ele ment-binding proteins between the leucine zipper and transmembrane domains. J Biol Chem. 1995;2 70:18044-18050 4. Wang X, Zelenski NG, Yang J, Sakai J, Brown MS, Goldstein JL. Cleavage of sterol regulatory ele ment binding proteins (SREBPs) by CPP32 during apoptosis. Embo J. 1996;15:1012-1020 5. Yuan JY, Horvitz HR. The Caenorhabditis elegans genes ced-3 and ced-4 act cell autonomously to cause programmed cell death. Dev Biol. 1990;138:33-41 6. Liu X, Kim CN, Yang J, Jemmerson R, Wang X. Induction of apoptotic program in cell-free extrac ts: requirement for dATP and cytochrome c. Cell. 1996;86:147-157 7. Liu X, Kim CN, Pohl J, Wang X. Purification and characterization of an interleukin-1beta-converting enzyme family protease that activates cysteine protease P32 (CPP32). J Biol Chem. 1996;271:13371 -13376 8. Zou H, Henzel WJ, Liu X, Lutschg A, Wang X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegan s CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell. 1997;90:405-413 9. Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad M, Alnemri ES,Wang X. Cytochrome c and dATP dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 1997;91:479-489 10. Zou H, Li Y, Liu X, Wang X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptos ome that activates procaspase-9. J Biol Chem.1999;274:11549-11556 11. Jiang X, Wang X. Cytochrome c promotes caspase-9 activation by inducing nucleotide binding to Apaf-1. J Biol Chem. 2000;275:31199-31203 12. Acehan D, Jiang X, Morgan DG, Heuser JE, Wang X, Akey CW. Three-dimensional structure of t he apoptosome: implications for assembly, procaspase-9 binding, and activation. Mol Cell. 2002;9:423 -432 13. Liu X, Zou H, Slaughter C, Wang X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 1997;89:175-184 14. Liu X, Li P, Widlak P, Zou H, Luo X, Garrard WT, Wang X. The 40-kDa subunit of DNA fragmen tation factor induces DNA fragmentation and chromatin condensation during apoptosis. Proc Natl Aca d Sci U S A. 1998;95:8461-8466 15. Liu X, Zou H, Widlak P, Garrard W, Wang X. Activation of the apoptotic endonuclease DFF40 (c aspase-activated DNase or nuclease). Oligomerization and direct interaction with histone H1. J Biol C hem. 1999; 274:13836-13840 16. Widlak P, Li P, Wang X, Garrard WT. Cleavage preferences of the apoptotic endonuclease DFF40 (caspase-activated DNase or nuclease) on naked DNA and chromatin substrates. J Biol Chem. 2000; 275:8226-8232 17. Toh SY, Wang X, Li P. Identification of the nuclear factor HMG2 as an activator for DFF nucleas e activity. Biochem Biophys Res Commun. 1998;250:598-601 18. Li LY, Luo X, Wang X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 2001;412:95-99 19. Yang J, Liu X, Bhalla K, Kim CN, Ibrado AM, Cai J, Peng TI, Jones DP, Wang X. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science. 1997;275:1129-1132

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