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转座子


转座子标签法克隆分离植物基 因
报告人:赵红玉 小组成员:戎玲玲 夏丹萍 俞锞

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一转座子的概述 二转座子的结构和类型 三转座子标签法分离植物基因的原理 四转座子标签法克隆基因的方法 五转座子标签法分离植物基因的优点 六转座子在其他方面上的应用 七转座子研究的前景展望

一转座子的概述
? 转座子 转座子(transposon)是基因组中一段可以移动的 DNA序列,可以通过切割、重新整合等一系列过程 从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置 (McClintock 1951)。 ? 自从1951年Barbara McClintock在玉米中发现转 座子以来,已在矮牵牛、金鱼草、拟南芥等多种植 物中报道有转座子的存在。 ? 随着分子遗传学的发展,人们对转座子的结构与功 能的认识不断深化,转座子的应用研究日益受到广 泛的重视。在植物基因工程研究中,转座子主要是 用来分离植物基因和研究基因的功能。

二转座子的结构和类型
? 无论是在原核生物还是在真核生物体中,转 座子在结构上都有两个特点(1)转座子的两 端分别有一个DNA倒置重复序列,称为末端 反向重复序列,不同转座子系统该序列长度 不同。例如:Tn10的两端是两个取向相反 的IS1O,中间有抗四环素的抗性基因。 (2)在转座子重新整合的位点,转座子一侧 有一个正向DNA重复序列,这些重复序列的 长度也因不同的转座子系统不同而存在差 异。

? 根据转座方式转座子可以分为两大类:以DNADNA方式转座的转座子和以DNA-RNA方式转座的 反转录转座子。 ? 第一类转座子又可以分为自主性转座子和非自 主性转座子。自主性转座子本身具有能够编码 转座酶的基因,可以自主转座,如玉米中Ac转座 子。另一类为非自主性转座子,这类转座子本 身不具有编码转座酶的基因,需要在自主性转 座子提供转座酶的情况下才能发生转座,如玉 米中Ds转座子。

三转座子标签法分离植物基因的原理
? 用转座子来分离植物基因的技术称转座子 标签技术(Transposon tagging)。 ? 基本原理 基本原理是转座子转座并插入到植物基 因的内部或邻近位点,将破坏了该基因的结 构,造成基因的突变。以转座子序列为基础, 从突变株的基因文库中筛选出带有此转座 子的克隆,它必定含有与转座子序列相邻的 突变基因的部分序列,再利用这部分序列从 野生型基因文库中获得完整的基因(Blcells 等1991)。

四转座子标签法克隆基因的方法
? (1)构建含转座子的质粒载体; ? (2)将含转座子的质粒载体通过农杆菌介导 或其他适当的转化方法导人目标植物中; ? (3)转座子插入突变的鉴定与分离; ? (4)利用转座子序列作探针,与突变体基因 组文库杂交,获得部分基因序列; ? (5)用部分基因序列作探针,与野生型基因 组文库杂交 ,分离出完整的目的基因。

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? 随着分子生物学和生物技术的发展,转座子标签技 术也随着得到了发展,近年来研究一般采用二元转 座子载体系统,具有以下几个特点: ? (1)可以用于多种植物基因的分离; ? (2)标签转座子应不能催化自身的转座,而只能在 另外一个转座子(Ac)提供的转座酶之后的才能转 座; ? (3)表达转座酶的因子应缺少转座所需要的其他序 列,因而不能转座,如经改造的sAc; ? (4)标签因子应有一个表现显著的标记基因,以利 于选择出标签因子与突变表现型的共分离株; ? (5)标签因子应经过改造而易于分离突变基因。

五转座子标签法分离植物基因的优点
? 与T-DNA标签法相比,转座子标签法分离植物基因 存在几大优势: ? (1)转座子插入引起的突变由于转座子的切离而回 复; ? (2)转座子转座多发生在其邻近的位点,这样就可以 用来标签感兴趣的基因; ? (3)转座子导入异源植物不受转化条件的限制; ? (4)通过构建不同含Ac和Ds转座子的株系,通过不 同株系之间的自交和杂交,产生较大的含有不同插 入位点的转座子群体,有利于克隆多个植物基因。

六转座子在其他方面上的应用
? (一)构建突变体库:转座子具有可选择 的抗性标记而容易在体内鉴定突变,经转座 子诱变的突变子含有已知的DNA片段,可以 通过转座子序列的杂交来鉴定突变基因的 位置,经转座子诱变的突变体具有高度的极 性,使得被诱变的基因以及同一操纵子内的 下游基因完全丧失功能。

(二)利用转座子培育转基因动物
? 上海复旦大学发育生物学研究所的科研人 员将一种源于飞蛾的PB转座子,用于小鼠和 人类细胞的基因功能研究,他们发现PB转座 因子可在人等哺乳动物的细胞株中高效导 入基因并稳定表达,为体细胞遗传学的研究 和基因表达提供了一个高效、便捷系统。

(三)鉴别菌株及群体多样性
? 转座子通常限制性地分布于特定的 真菌菌株或群体中,可以作为特定 菌株的诊断工具,已用于丝状真菌 群体多样性分析。

(四)生态环境污染的生物修复
? 由于基因的可变性及转座子的遗传调 控,许多微生物能够利用人工合成的化 学物质,与微生物分解代谢相关的基因 往往与插入元件相连。当环境污染时, 转座子转移频率提高,增加了微生物种 群的生物降解潜力。

七前景展望
? 反转录转座子具有存在广泛、拷贝数高、 插入位点专一、产生的突变稳定、不受植 物种类差异的影响、异源转座率高、组织 培养诱导激活等优势,尤其是经实践证明,转 座子标签法是目前分离植物基因的有效手 段之一。 ? 但是,植物转座子主要来源于玉米、水稻等 草本植物,相应地,应用转座子分离基因的成 功实例也基本局限于草本植物。

? 随着目前转座子应用中存在的缺陷被逐步 克服,转座子将会在研究植物基因组的组成、 表达调控、进化、系统发育、生物多样性 评价以及林木基因工程等领域内发挥越来 越重要的作用。


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