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基因芯片技术在卫生毒理学中的应用


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国外医学卫生学分册

2001 年

第 28 卷

第5期

130 基因芯片技术在卫生毒理学中的应用
余增丽 , 张立实
( 四川大学华西公共卫生学院 , 摘要 : 四川 成都 610041)

基因芯片也称之为 DNA 阵列 , 或寡核苷酸阵列。基因芯片技术是同时将大量探针分子 固定于支 持物

上后与标记的分子进行杂交 , 通过检测每个探针分子的 杂交信号 强度进而获 取样品分 子的数量和 序列信息。 本文就这项技术在毒理学研究和危险评价中的应用作一探讨。 关键词 : 基因芯片 ; 毒理学 ; 应用 Q78 文献标识码 : A 文章编号 : 1001 1226( 2001) 05 0312 03 中图分类号 :

随着人类基因组计划的逐步实施以及分 子生物学相关学科的迅猛发展 , 越来越多的 动植物及微生物基因组序列已被测定, 基因 序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。 早在 1980 年, Bains 等就将短的 DNA 片段固 定到支持物上, 借助杂交方式进行序列测定。 但基因芯片从实验室走向工业化和大规模应 用却是直接得益于探针固相原位合成技术和 照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚 焦技术的引入。这些技术使得合成、 固定高 密度探针分子切实可行, 并且借助激光共聚 焦显微扫描技术可以对杂交信号进行实时、 灵敏、 准确的检测和分析。正如由电子管电 路向晶体管电路和集成电路发展时所经历的 过程一样, 核酸杂交技术的集成化正在引发 一场分子生物学技术的革命。 1 基因芯片技术的基本原理

指采用光引导聚合技术 ( light directed synthe sis) 将探 针 以原 位聚 合的 方 法合 成。 这些 DNA 分子或者是寡核苷酸序列, 或是部分基 因序列 , 或是全长的 cDNA 序列。芯片的面 积通常只有硬币大小, 嵌在一小块黑色的片 基上, 在 其 上 面, 铺 了 一 层 肉 眼看 不 见 的 DNA 纤维 地毯 , 即探针。对于熟悉 South ern Northern blots 杂交 试验 的研 究人 员而 言, DNA 阵列的操作原理及操作程序并不困 难。不过, 基因芯片技术是 Southern North ern blots 的翻转, 它是将待测的核酸加以标记 ( 同位素、 生物素或辣根过氧化物酶等 ) 。标 记后的 DNA 受激光光束激发后产生光信号 , 杂交信号的强弱与杂交的程度有关 , 对光信 号的分析可以对待测样品作出定量或半定量 的检测。也可以采用激光共聚焦显微镜或其 他荧光显微镜装置对片基进行扫描 , 用计算 机收集光信号 , 并对每个点的光强度数字化 后进行分析。 为了使结果的检验更加简便和快速 , Af fymetrix 公司的 基因芯片分析 系统中采用了 基因阵列扫描仪和专用的基因芯片工作站 , 对一幅包含数万个探针位点的基因芯片图样 的分析仅需数分钟。这样可在短短的几十分 钟至数小时内 , 完成用传统方法需要数月才 能完成的几万乃 至几十万 次杂交 分析。最 近, Holden 等从人 和小鼠 cDNA 文 库中选择 约 600 个与毒理学相关的基因进行克隆, 制

在分子生物学领域 , 阵 列 ( array) 通常是 指固定在无机片基或有机片基 ( 即支持相) 上的一系列核苷酸序列或氨基酸序列。DNA 阵列也被称为基因阵列或微阵列 , 但微阵列 和基因阵列并不完全一致, 微阵列一般是指 固定在玻璃片上的高度密集的分子序列, 即 将预先合成的探针通过特殊的微量点样装置 或仪器滴加到片基上而形成。而基因阵列是
收稿日期 : 2001 02 21; 修回日期 : 2001 07 16

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备了种属特异的毒理学基因组芯片。 2 基因芯片技术在卫生毒理学中的应用

与一个来自外周血基因文库的含 1046 个 cD NA 克隆的阵列作这两种病变状态基因差异 表达的比较 , 发现在类风湿关节炎组织中金 属蛋白酶组织抑制物 1、 铁蛋白轻链和锰超 氧化物歧化酶表达明显升高。该研究确定了 许多基因与这两种病变的关系 , 为其发病机 制的研究和治疗提供了新的思路。 分析外源因素的毒理作用机制时 , 研究 多基因间的相互作用显得十分必要。这时可 先按照系统的 DNA 裂解程序将核苷酸切成 不同的片段 , 然后再与芯片上的已知 DNA 序 列杂交, 一次就可以检测成百上千个基因从 而分析这些基因间的相互关系。就毒理学来 说, 一种毒性因子引起的机体损伤常常不是 单个基因作用 , 而是细胞内多个信号系统相 互作用的复杂结果。在卫生毒理学中 , 寻找 和鉴定与毒性因子或危险暴露相关的基因是 从分子水平上研究毒物致癌、 致突变、 致畸 , 揭示其发病机制的一项重要的基础性研究工 作。利用基因芯片寻找新基因时 , 固定在芯 片上的探针是某些 cDNA 文库内的 cDNA 片 段, 研究这些 cDNA 片段对应基因的差异性 表达, 就可 能 选到 差 异表 达 相关 基 因。如 Schena 等通过双色差 示表达系统 , 研究人 T 淋巴细胞 在热休克条件 下和佛波 酯作用下 1046 个未 知序列 的 cDNA 基因 诱导表 达情 况, 并对诱导表达的 cDNA 进行测序, 再与已 知基因进行比较。结果发现 , 热休克诱导了 已知的热休克蛋白的表达, 其中包括一些分 子降解的中间体。同样 , 佛波酯引起了佛波 酯调节基 因的信号传导 途径特征 基因的表 达, 如激活 细胞的磷酸酯酶和细胞因子 B1 等。另外, 还发现 3 个低表达的已知基因和 4 个低表达的新基因可能与该途径有关。 DNA 芯片技 术的进 一步应用 是单个核 苷酸多态性鉴定 ( ISNPs) 。基 因的变异是广 泛存在的( 大约每 1kb 左右就会发生一次 ) , 这也是限制性片段长度多态性分析在法医鉴 定中的基础。美国 Affymetrix 公司已设计出 同一基因序列多次重复的基因芯片 , 每个碱

尽管基因芯片技术尚处于初级阶段, 还 有待于进一步的改进与发展 , 但这一先进技 术已经显示出巨大的应用潜力。特别是当一 个芯片含有所要分析的标本的全部序列时, 它的价值就更大。因此 , 它的价值在应用酵 母和秀丽新杆线虫进行研究的学者中十分看 好。这两种微生物的基因组已完成全部测序 工作 , 已将酵母的基因组制成 DNA 阵列 , 用 于检测待测基因表达的研究。 90 年 代 初, 由 美 国 Affymetrix 公 司 的 Fodor 博士提出并开始基因芯片技术的研究。 至今, DNA 芯片技术在医学各个领域中已显 示出广阔的应用前景, 它以一次能检查上万 个基因状 态的优势相继 在人类肿瘤 疾病研 究、 遗传学研究、 毒理学研究等生物医学研究 领域中得到了越来越多的应用。Nuwaysir 等 研制 了包 括涉 及细 胞凋 亡、 DNA 复制 和修 复、 氧化应激 氧化还原内稳态、 二 恶英 多环


芳烃反应、 雌激素反应管家基因 ( house keep ing gene) 、 癌 基因 和抑 癌基 因、 细 胞周 期控 制、 转录因子、 磷酸酶等 2090 个基因的毒理 芯片 ( ToxChip v1. 0) , 该芯片既可用于毒物的 检测和遗传多态性的检测, 又可用于受检毒 物作用机制的研究。 研究基因的功能 , 确定基因与基因间的 相互关系 , 从而揭示毒物导致疾病发生、 发展 的分子毒 理学机制是毒 理学研究的 重要内 容, 也是基因芯片最重要的用途之一。Heller 等采用基因芯片技术研究了类风湿关节炎、 肠炎基因的特征性表达活性。分别用酞菁 3 和 5 对类风湿关节炎组织和肠炎粘膜的 cD NA 进行标记后, 与这两种疾病发生过程中目 前已知可能起作用的基因阵列进行杂交, 结 果发现已知炎症相关基因 , 如肿瘤坏死因子、 白介素和粒细胞集落刺激因子在相关组织中 有表达。还发现一些以前未知的炎症相关基 因如人黑素瘤生长刺激因子的表达。同时,

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基位点都含有全部可能出现的 4 种碱基, 以 供检测基因变异使用。用此样品与芯片杂交 后, 不仅可以检测到杂交程度的强弱, 而且也 可准确地确定靶基因的核苷酸序列。因此, ISNPs 的出现被认为在药物代谢和毒理学研 究中具有举足轻重的地位。如果单个碱基的 变异是发生在常规或某些基因的关键位点, 那么就可由此解释因这一基因变异所产生的 巨大的生物活性的不同。同时 , ISNPs 还可阐 明为什么有些人代谢外源性毒物 药物的能 力强于另一些人。故基因芯片可为毒理学家 研究可疑毒物和毒理学反应提供一项有力的 工具。 3 当前存在的问题 尽管基因芯片技术已经取得了长足的发

万的寡核苷酸探针由于序列本身有一定程度 的重叠因而产生了大量的丰余信息。这一方 面可以为样品的检测结果提供大量的验证机 会, 但同时 , 要对如此大量的信息进行解读 , 目前仍然是一个艰巨的技术问题。 4 展望

尽管目前 DNA 芯片技术还存在种种问 题, 有待改进, 但由于每个基因芯片一次可检 测 7000 个以上人类基因 , 这无疑为解读生物 体在长期进化中累计下来的浩瀚基因信息提 供了一个简便的工具, 特别是为毒理学中许 多问题的解决提供了一项有力的工具。目前 各国众多科学家正在 DNA 芯片技术的发展 方面作广泛的探索, 努力创造出更完美的芯 片技术。通过压缩每种 DNA 在芯片上所占 的面积, 有望生产出带有 160 万种 DNA 探针 的芯片, 相信不远的将来 DNA 芯片将在生命 科学的各个领域中发挥更大的作用。
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展, 得到世人的瞩目 , 但仍然存在着问题有待 解决 : ? 费用: 目前 DNA 芯片技术的昂贵费 用使很多研究者和使用者望而兴叹。 # 背 景: 在使用全核酸片段进行杂交时 , 应考虑常 见的背景干扰单个被检核酸变异的问题。 ? 重复性 : 不同的 RNA 提取方式会导致结果的 不同 , 因此每次试验要求重复 2~ 3 次来证实 最初的结果, 为节约费用 , 有人建议用 North ern blots 或 RT PCR 技 术来 验证。 % 敏感 性: 在信号的获取与分析上, 当前多数方法使 用荧光法进行检测和分析 , 重复性较好 , 但灵 敏性仍然不高。正在发展的方法有多种, 如 质谱法、 化学发光法等。基因芯片上成千上
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