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生物大实验


生物学教育综合实验
2012

课程特点:
将分子生物学、生物化学、发育生物学、生物技 术实验中的核心内容有机地整合,综合性强,涉及内 容广泛。力求与中学教学特点相适应,培养师范生的 课程设计和实验操作能力。 头绪较多,务必理清实验思路; 时间较长,一定合理分配时间。

课 程 设 计
?碱性磷酸酶的分离纯

化及其纯化参数测定

?碱性磷酸酶的小鼠腹水抗体的制备及ELISA检测

?鸡胚生长发育观察及石蜡组织切片制作

? 植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定

AKP的分离纯化及其纯化参数测定
AKP 诱导表达与粗提

阴离子交换层析

分子筛层析

AKP浓缩

1. 酶活力测定 2. 蛋白质含量测定

SDS-PAGE鉴定AKP 纯度和分子量

碱性磷酸酶的小鼠腹水抗体的制备及ELISA检测
分离与纯化后的AKP

腹腔免疫小鼠 分离血清 ELISA 检测

鸡胚生长发育
鸡胚的人工孵化

1. 种蛋的挑选 2. 孵化前准备 3. 孵化器孵化 4. 观察孵化过程并记录

Real-Time PCR 检测GAPDH

鸡胚组织石 蜡切片

1. 鸡胚组织RNA提取
2. RT反应合成cDNA 3. Real-Time PCR

1. 组织取材与固定 2. 石蜡包埋前处理

3. 石蜡包埋
4. HE染色

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定

转基因烟草的培养

转基因烟草的检测

1. 农杆菌的培养 2. 愈伤组织转化 3. 共培养 4. 筛选培养与分化

1. 采集叶片组织 2. 荧光体视镜观察 3. 对比未转化叶片

参 考 书
自编讲义

分子生物学实验指导(第二版)魏群主编

高教出版社
北京

生物化学实验方法和技术(第二版)张龙翔等编著 大学出版社 生物工程技术实验指导 社 魏群主编

高等教育出版

最新分子生物学实验技术

梁国栋主编

科学出版社

实验成绩(100分)
实验技能 40分

实验报告
实验态度和实验习惯等

20分
20分

设计报告
实验总结及体会

10分
10分

实 验 报 告 写 作 指 南
实验报告将包含下列一些科学文件的基本要点:标题页、
摘要、引言、实验材料和方法、结果、讨论、结论、图表。
实验报告的评分标准:
标题页(5%) 引言(10%) 摘要(中、英文,10%) 材料和方法(10%)

结果(20%)
结论(5%) 实验记录本(10%)

讨论(20%)
图表(10%)









必须做到课前认真预习(预习报告),课间做好实验记录、课

后详细总结实验结果并按时提交实验报告;
提前5分钟进入实验室; 请假须医院病假条或班主任签字的假条; 上课时需穿实验服,不许在实验室内吃东西; 实验课期间不许打闹、闲聊等,保持课堂纪律; 认真作好值日工作,离开实验室须向教师声明;

? 爱护实验器材;

? 注意门窗水电的安全;
? 在实验过程中一定要保持实验台面、地面、实验仪器有

序、整洁和卫生
个人要求:体会实验课设计思路、探究实验课教学方法

本次课实验内容
? 清点仪器 ? 试剂配制 ? 准备分子筛层析柱

试剂配制
1.缓冲液 A 50mmol/L 0.2mmol/L 0.5mmol/L 2. 缓冲液 B 50mmol/L 2mmol/L 1mmol/L pH 8.5 1000mL/组 Tris-HCl NaCl EDTA pH 8.5 500mL/组 Tris-HCl MgAc2 EDTA

试剂配制
3.5mol/L NaOH
4.LB培养基

500mL/班(一组)

100mL/班

分装到小试管中,每 管3ml,每组4管, 酵母提取物0.5g; 121℃高压灭菌20分 NaCl 1.0g 钟 加入200μ L 5mol/L NaOH调节pH至7.0-7.4,加 入去离子水至总体积100mL 胰蛋白胨 1.0g; 121℃高压灭菌20分钟

试剂配制
5.TM表达培养基 100mL 胰蛋白胨 1.2g; 每组配制300ml,放入500ml锥形瓶中 酵母提取物 2.4g;121℃高压灭菌20分钟 NaCl 1.0g; 50%甘油 1.2mL 加入1mol/L Tris 0.93mL调pH至7.4,加入去离 子水至总体积100mL, 6.枪头、EP管、离心管(50ml)等灭菌

层析技术 (Chromatography)

层析技术,亦称色谱技术,是利用混合

固定相

物中各组分的物理、化学、生物性质的差别,
使各组分以不同程度分布在两个相中(其中一 个相为固定的,称为固定相 – stationary phase; 另一个相则流过此固定相,称为流动相 – mobile phase)并使各组分以不同速率随流动相移动, 从而达到分离各组分的效果。

流动相

柱层析的基本装置

Column chromatography

层析柱

层析柱(自制或预装)

柱 层 析 的 基 本 装 置

五大层析技术
(1)凝胶层析(gel chromatography) 以凝胶层析介质为固定相,利用其交联度的不同形成不同 大小的网状孔洞,分离不同大小的物质,亦称分子筛层析。

层析技术
(2)离子交换层析(ion exchange chromatography) 以离子交换剂为固定相,利用其与流动相中带电的待分离 物质发生可逆的离子交换反应,根据物质的带电性质不同 进行分离 。

层析技术
(3)亲和层析(affinity chromatography) 根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力,将某种配 体连接在载体上作为固定相,对能与配体特异性结合的

生物大分子进行分离。

层析技术
(4)疏水层析(hydrophobic chromatography)

利用固定相载体上偶联的疏 水性配基可与流动相中的疏

水分子或分子的疏水表面发
生可逆性的结合,对混合物 进行分离 。

柱层析的基本操作
1。基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)的预处理 2。装柱 3。平衡 4。加样 5。洗脱 6。收集、鉴定及保存 7。基质的再生

凝胶层析 Gel chromatography

凝胶层析(gel chromatography)是以多孔
性凝胶填料为固定相,按分子大小顺序分 离样品中各个组分的液相色谱方法。

凝胶的种类和性质

1、交联葡聚糖凝胶(Sephadex)

Sephadex G 系列,G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。
2、琼脂糖凝胶(Sepharose;Bio-Gel)

3、聚丙烯酰胺凝胶
常见商品名为生物胶—P (Bio-Gel P-2 Bio-Gel P-300).

4、聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶。
常见商品名为Ultragel。

凝胶层析的原理

凝胶层析的基本概念

凝胶层析的基本概念
分配系数
分配系数Kav是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。 对于凝胶层析,分配系数实质上表示某个组分在内水体积 和在外水体积中的浓度分配关系。在凝胶层析中,分配系 数通常表示为:

Ve=V0+ Kav*Vi

凝胶层析的基本概念
对于某一型号的凝胶,在一定的分子量范围内,各个组分 的Kav与其分子量的对数成线性关系:
Kav=-b lg MW+c 其中 b 、 c 为常数, MW 表示物质的分子量。另外由于 Ve 和 Kav也成线性关系,所以同样有: Ve=-b’ lg MW+c’ 其中b’、c’为常数。这样我们通过将一些已知分子量的标准 物质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱,分别测定 Ve 或 Kav,并根据上述的线性关系绘出标准曲线,然后在相同的 条件下测定未知物的Ve或Kav,通过标准曲线即可求出其分 子量。

凝胶层析的基本概念
Ve

0
Fractionation range log (Mr)

洗脱特征与分子量的关系 (可用来确定未知蛋白分子量)

Resolution

凝胶层析的基本操作
1。凝胶的选择与预处理
2。装柱

3。平衡
4。加样

5。洗脱
6。收集、鉴定及保存

7。基质的再生

凝胶的选择 一般来讲,选择凝胶首先要根据样品的情况确定 一个合适的分离范围,根据分离范围选择合适型号 的凝胶。 选择凝胶的另一个方面就是凝胶的颗粒的大小。 颗粒小,分辨率高,但相对流速慢,实验时间长, 有时会造成扩散现象严重;颗粒大,流速快,分辨 率较低但条件得当也可以得到满意的结果。

分子筛层析装柱
1. 将50ml固体介质倒入250ml烧 杯,补加 50-100 ml buffer A,搅拌 均匀。 2. 将层析柱清洗干净,垂直固定 在铁架台上。关闭层析柱出水口 (或连接到恒流泵上),向柱管内 加入蒸馏水或缓冲液,检查是否漏 液,保留5 cm 水柱。然后将薄浆状 的凝胶液缓慢地、连续地倾入柱中, 使其自然沉降约2-3cm高。

分子筛层析装柱
3.打开柱的出口,或启动恒流泵,调节合适的流速 (15ml/h),使凝胶均匀沉降,并不断加入凝胶(待凝胶 下沉到一定高度是,用吸头吸出液体部分,加入凝胶悬液, 用玻璃棒在交界处轻轻搅动,重复此过程直到凝胶高度为 50-58cm左右,不能有气泡,不能分层)。 4.最后使柱中凝胶表面平坦并在表面上留有2-3cm高的 缓冲液,同时凝胶表面不再下降,关闭出水口或关闭恒流 泵开关(最后将出水口抬高,避免柱子流干)。

利用恒流泵装柱 和平衡

装柱注意事项

1)预先检查层析柱和各接头是否漏气、漏液,是否有 滤膜。 2)柱子中不能有气泡。 3)装柱要均匀,既不过松,也不过紧,最好在要求的 操作压下装柱,流速不宜过快,避免因此压紧凝胶。 4)始终保持柱内液面高于凝胶表面,否则水分蒸发, 凝胶变干。也要防止液体流干,使凝胶混入大量气泡, 影响液体在柱内的流动,导致分离无法进行,不得不 重新装柱。

下周实验安排
? 周三下午助教预培养:接一含pET21a=AKP 表达质粒的单菌落到3mL含有50μg/mL Carb 的LB液体培养基中,37℃、190r/min振荡培 养过夜; ? 周四将过夜培养的菌液2mL接种于300mL含 有50μg/mL Carb的TM液体培养基中,37℃、 250r/min震荡培养3小时; ? 向其中加入IPTG至终浓度为50μmol/L,25℃ 震荡培养16小时 ? 周五收集菌液


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