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植物RNA的分离纯化(LiCl沉淀法)


实验三 植物RNA的分离纯化(LiCl沉淀法) 植物RNA的分离纯化(LiCl沉淀法)
一、实验原理
总RNA包括线粒体RNA、叶绿体RNA、tRNA和mRNA。与DNA一 样,RNA在细胞中也是以与蛋白质结合的状态存在。RNA分子主 要存在于细胞质中,约占75%,另有10%存在于细胞核内,15% 在细胞器中。RNA以rRNA的数量最多(80-85%),tRNA 及核内小 分子RNA占10%-15%,而mRNA 分子只占1%-5%。mRNA 分子大小 不一,序列各异。 RNA提取一般使用蛋白质强变性剂有效抑制RNA酶活性,同 时并使DNA变性,再通过有机溶剂反复抽提去掉蛋白质、多糖 等物质,在RNA沉淀剂的作用下,针对性分离出RNA。 总RNA提取原则:① 保持核酸结构的完整性;② 排除其 它分子的污染。

二、仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平、冰箱 三、材料及试剂 1.材料:植物任何部分的新鲜组织 2.试剂: ① 水饱和酚(pH4.9); ② 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合溶液; ③ 3mol/L NaAc(pH 5.2); ④ RNA提取缓冲液:内含0.2mol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.4mol/L LiCl、25mmol/L EDTA和1%SDS; ⑤ 2mol/L LiCl; ⑥ 75%乙醇;

⑦ 无水乙醇; ⑧ 灭菌双蒸水(ddH2O,无Rnase); ⑨ 氯仿。

四、操作步骤
1.取取植物材料0.5g,放入预冷的研钵中,加入0.1mlβ-巯基 乙醇 。 2.液氮中充分研磨,中间可补充液氮,直到将材料磨成粉末。 3.将粉末迅速分装到3-5个1.5ml离心管中,分别加入0.6ml提 取液,剧烈振荡2-3min。 4.分别加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液,振荡1min,冰 上放置5min。 5.4℃、12000g离心10min。 6.将上层水相转到对应的灭菌离心管中,加入等体积的苯酚: 氯仿:异戊醇 混合液,振荡混匀,室温下、12000g 离心 5min。

7.重复步骤6,直至无白色界面物质。 8.将水相转至对应的灭菌离心管中,加入等体积氯仿振荡混 匀,以除去痕 量的苯酚。 9.室温下、12000g离心5min。 10.将上层水相转移至对应的灭菌离心管中,加入1/10体积的 NaAc(3mol/L, pH 5.2) 和2倍体积的无水乙醇,混匀,-70℃ 放置30min。 11.4℃、12000g离心20min。 12.弃去上清夜,向沉淀加入0.3ml LiCl(2mol/L),并振荡溶 解,冰上静置 10-30min。4℃、12000g离心20min。 13.弃去上清液,加入0.3ml灭菌双蒸水(ddH2O,无RNase), 振荡使沉淀溶解。 14.加入1/10体积的NaAc(3mol/L, pH 5.2) 和2倍体积的无水乙 醇,混匀,-70℃放置30min。 15.4℃、12000g离心20min。

16.弃去上清液,沉淀分别用70%乙醇和无水乙醇1ml洗涤,并 短暂离心。 17.小心吸去残留的乙醇,空气中凉干3min。 18.RNA用20-30?l无菌水溶解,贮藏于-70℃备用。 19.RNA的浓度测定和纯度分析 取2-5?lRNA溶液稀释至100?l,于紫外核酸蛋白检测仪上测 定A260、A280和A320的OD值,并计算RNA浓度和得率。 核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm,对纯的 注:核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在 ,对纯的RNA来 来 说,OD260/OD280为2.0,1个OD260约为40?g/ml RNA。 20.RNA的完整性检测 1.2%琼脂糖凝胶电泳 在紫外检测仪下观察,完整的总RNA样品应呈现三条带: 28S、18S、和5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应该为18S

rRNA条带的1.5-2倍。反之,说明部分28S rRNA已经降解成 18S rRNA。若无清晰条带,则说明样品RNA已严重降解;若 加样孔内或孔附近有荧光区带,则说明有DNA污染。

【注意事项】 注意事项】
1.条件允许的实验室应专门辟出RNA操作区,离心机、移液 器、试剂等均应专用,RNA操作区应保持清洁,并定期行除 菌。 2.操作过程中应始终戴一次性手套,并经常更换,以防止手、 .操作过程中应始终戴一次性手套,并经常更换,以防止手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的 酶带到试管或污染 用具。 用具。 3.避免在操作过程中说话聊天。 4.配制溶液用的酒精、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶。 5.所有旧塑料制品都必须用0.5mol/L的NaOH处理10min,用 双蒸水彻底冲洗,DEPC-H20浸泡过夜后灭菌。 6.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下烘烤6h或更 长时间。 7.配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC在37℃处理12h以上, 然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当 用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22?m滤膜过滤除 菌。

8. 无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次,这样通常可 以消除RNA酶的活性。但氯仿会溶解某些塑料制品,应当注 意。 9.有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗, .有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗, 乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温 室温10min,然后用 乙醇干燥,再浸泡在 ,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。 水冲洗, 水冲洗 晾干。 10. DEPC有致癌的潜在嫌疑,操作时要小心仔细,一定要戴 上手套,并且最好在通风橱中进行。 11.RNase AwayTM试剂可以替代DEPC,操作简单,价格 低,且无毒性。只需将RNase AwayTM直接倒在玻璃器皿和塑 料器皿的表面,浸泡后用水冲洗去除,即可以快速去除器皿表 面的RNase,并且不会残留而干扰后继实验。 12.如果提取的RNA样品暂时不用,最好置于-70℃低温冰箱 中保存,再次使用时应做RNA琼脂糖变性胶电泳分析,以检测 RNA的完整性。

酶抑制剂】 【常用的RNA酶抑制剂】 常用的 酶抑制剂
1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制 剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质 变性,从而抑制酶的活性。 变性,从而抑制酶的活性。 2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂 酶抑制剂, 酶抑制剂 解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从 酶失活。 解组织的同时也使 酶失活 核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。 RNA 3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物, 它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的 活性。 4. RNA酶的蛋白抑制剂(Rnasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得 来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可 以和多种RNA酶结合,使其失活。 5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。


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