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第一讲 细胞培养的基本要求


第一讲 细胞培养的基本要求

一、体外培养的概念
就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体 内取出,放在类似于体内生存环境的体外环境中,让 其生长和发育的方法。

1、组织培养:指从生物体内取出活的组织(多指组织块) 在体外进行培养的方法。 2、细胞培养:指将活细胞(尤其是分散的细胞)在体外 进行培养的方法。
<

br />3、器官培养:指从生物体内取出的器官(一般是胚胎器
官)、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。

二、细胞培养的基本要求
?由于体外培养的细胞没有抗感染能力, ?因此防污染是决定培养成功的首要条件。 ?一切操作需要保证无菌和有条不紊。

一) 细胞工程实验室条件
1、无菌操作:要求工作环境和条件必须保证无微生

物污染和不受其它有害因素的影响。
2、防止微生物污染和有害因素影响,要求工作环境

清洁、空气清新,干燥和无烟尘。
3、无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作

和封闭培养于一室,为10万级洁净环境的洁净室。而
洗刷消毒工作设在洁净室外,避免物品污染洁净室内 环境。细胞洁净室需要一个空调系统并对外界保持一 定的正压。

?准备室 ?无菌间 ?操作间 ?培养室 ?分析室

二)细胞培养的基本条件
无菌条件:净化工作室,高效过滤器,生物安全柜,
超净工作台,紫外灯,电热干燥箱, 滤器,高压灭菌器,抗生素

细胞生长条件:纯水蒸馏器,纯水仪,培养板,
培养瓶,CO2培养箱, 培养基,血清

细胞检测条件:倒置显微镜,酶标仪,微孔板震荡器,
高速离心机,移液器

细胞保存条件 :液氮罐

1、常用仪器设备
超净工作台
超净工作台的工作原理 是利用鼓风机驱动空气遁 过高效滤器除去空气中的

尘埃颗粒,使空气得到净
化。净化空气徐徐通过工

作台面,使工作台内构成
无菌环境。

冰箱

■ 普通冰箱
(4℃,-20 ℃ )

■ 低温冰箱(-20 ℃ )

■ 超低温冰箱(-80 ℃ )

消毒灭菌
电热干燥箱
■ 烘干和干热灭菌玻璃器皿 ■100度以下时再打开箱门 ■ 塑料制品、橡胶等不能在干 燥箱内消毒

全自动高压蒸汽灭菌锅 灭菌锅

环氧乙烷灭菌

日本SANYO*MLS-3750, MLS-3780 高压灭菌锅

细胞培养箱
CO2培养箱:37 ℃,5% CO2 。

使用CO2培养箱应注意的问题 : ① 用螺旋口瓶培养细胞时,需将瓶 盖微松,以保证通气。

② 保持培养箱内空气干净。定期消
毒(90 ℃ ,14 h)。

③ 箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水
槽中以保持箱内湿度,避免培养液

蒸发。

显微镜

倒置显微镜

离心机
?1000转/分

细胞冷冻储存器
液氮温度:-196℃ 不断挥发,及时补充

超低温冰箱:-86℃

?程序降温方法是利用程序降温盒设定程序由室温

降低至-80℃,最后再放置到液氮槽中长期保存。

冻存管

滤 器

自动双重纯水蒸馏器

纯水仪

酶标仪

微孔板震荡器

移液器

培养皿

培 养 板

培养瓶

其 他

三) 无菌技术

◆ ?培养用品清洗

?灭 菌 方法

1、培养用品清洗
玻璃器皿的清洗
◆ 浸泡 新瓶使用前用自来水简单刷洗,后用稀盐酸浸泡

过夜。使用过的器皿应立即浸入水中,避免干涸难洗
◆ 刷洗 软毛刷沾洗涤剂洗涤 ◆ 浸酸 关键一环。时间不少于6小时,一般过夜。清洁

液变绿应重新配制。
或干热(160度2小时)

◆ 冲洗 洗涤装置与手工烘干、包装、高压(15磅20分钟)

清洁液的配制

胶塞的清洗
◆ 新购置胶塞
有大量滑石粉,用自来水洗净,再常规处理

◆ 常规清洗方法:水中浸泡--- 2%NaOH煮沸
10-20分钟---自来水冲洗2-3次---1%盐酸浸泡
30min---自来水冲洗---蒸馏水清洗2-3次---包装—

高压灭菌

包 装
◆ 包装材料:皱纹包装纸、硫酸纸、棉布、
铝饭盒及金属消毒筒
● ●

局部包装 全包装 小物品装饭盒,注意期限,标明物品名。
吸管用脱脂棉将管接口端堵塞,装入消毒筒,

筒底垫棉花

2、灭菌方法
重要概念
1.消毒 2.灭菌 3.防腐 杀死物体上病原微生物的方法;并不一定能 杀死含芽胞的细菌或非病原微生物 杀死物体上所有微生物的方法。 防止或抑制微生物生长繁殖的方法。 不存在活的微生物。

4.无菌 5.无菌操作

防止微生物进入机体或局部环境的操作技术。

蛋白质含水量(%) 50 凝固所需温度
56

25 76

18 8090

6 145

0 160170

结论一:蛋白质在湿热中较易凝固变性 。

热型

温度 (度)

时间 (h) 4 3

布层内温度 20层 40层 100层 86 101 72 101 70.5 101

灭菌效果 不完全 完全

干热 130140 湿热 105.3

结论二:湿热的穿透力比干热强。

细胞培养室中下列物品该如何消毒?
? ? ? ? 玻璃培养瓶,移液管, 试管等玻璃器皿? 超净工作台台面? 金属手术器械? 不耐热的液体培养基和胰蛋白酶等 ?

? 橡胶塞和塑料瓶盖等?

? 细胞培养室?
? 操作人员的手部? ? 实验室桌面、地面等?

物品 培养室 工作台 玻璃 制品 金属 器械 塑料 制品

湿热

干热

过滤

紫外

化学 气体

消毒剂

电离 辐射

+ + + + +



+ + + + + +

+ + + + + + +

+ +

橡胶 制品
培养 用液 布类 棉类

四)细胞培养的常用液体
?水 ?平衡盐溶液 ?消化液 ?消化酶抑制剂 ?pH调整液 ?抗生素液 ?谷氨酰胺补充液

水:新鲜配置的三蒸水或去离子水

?水 ?平衡盐溶液 ?消化液 ?消化酶抑制剂 ?pH调整液 ?抗生素液 ?谷氨酰胺补充液
平衡盐溶液:无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS: NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.24 g 加水至1000 ml,调节pH至7.4

?水 ?平衡盐溶液 ?消化液 ?消化酶抑制剂 ?pH调整液 ?抗生素液 ?谷氨酰胺补充液

原代培养时常常需要将组织块消 化解离形成细胞悬液,传代培养 时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消 化下来,常用的消化液有胰酶 (Trypsin)溶液和EDTA溶液, 有时也用胶原酶(collagenase) 溶液等。

?水 ?平衡盐溶液 ?消化液 ?消化酶抑制剂 ?pH调整液 ?抗生素液 ?谷氨酰胺补充液

血清抑制胰蛋白酶

培养基
?细胞的生长需要一定的营养环境,用于维持细胞

生长的营养基质称为培养基,即指所有用于各种 目的的体外培养、保存细胞用的物质,就其本意 上讲为人工模拟体内生长的营养环境,使细胞在 此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营 养和促进细胞生长增殖的物质基础。

无毒、无污染
?体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没

有抵抗能力,因此培养基应达到无化学物质污染、 无微生物污染(如细菌、真菌、支原体、病毒 等)、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物 质污染(如抗体、补体)。
?对于天然培养基,污染主要来源于取材过程及生

物材料本身。对于合成培养基,污染主要来源于 配制过程,配制所用的水,器皿应十分洁净,配 制后应严格过滤除菌。

① 天然培养基
?天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离

提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡

胚浸出液等。组织培养技术建立早期,体外培养
细胞都是利用天然培养基。
?但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异

大,因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使

用的天然培养基是血清。

血清(serum)
?血清种类:主要是牛血清,培养某些特殊细胞也用人血

清、马血清等。
?牛血清分为小牛血清

(calf serum ,CS) 、胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS) 。胎牛血清应取自剖腹产 的胎牛;新生小牛血清取自出生24小时之内的新生牛; 小牛血清取自出生10-30天的小牛。
?胎牛血清:(进口血清)要求剖腹取胎制成。 ?国内厂家往往不能做到,经常把出生 2天以内采血称为

胎牛血清。

血清的使用

?使用前处理:大部分血清在使用前必须灭活处理,

即56℃水浴锅处理30分钟。灭活的目的是灭活血 清中的补体和支原体。
?血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分,

如生长因子,因此也有人提出血清不经灭活直接 用于培养,前提是确认血清中不含补体成分。

Gibco 血清

②合成培养基
?基本培养基包括四大类物质:无机盐、氨基酸、

维生素、碳水化合物。
MEM细胞培养基系列; DMEM细胞培养基系列 RPMI-1640细胞培养基系列; 199细胞培养基系列 水解乳蛋白细胞培养基; 欧氏平衡盐 F-10,F-12细胞培养基系列; 其它类型细胞培养基

Hyclone 培养基

?人工合成培养基只能维持细胞生存,要想使细胞

生长和繁殖,还需补充一定量的天然培养基(如

血清)。
?血清中含有:①多种蛋白质(白蛋白、球蛋白、

铁蛋白等)②多种金属离子;③激素;④促贴附
物质,如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等⑤各种

生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分

消化液:
?胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健,

除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,影响细胞骨架,从而 使细胞分离 ?胰蛋白酶液浓度越高,作用越强,但超过一定限度 会损伤细胞。 ?胰蛋白酶是一种黄白色粉末 ,用无 Ca2+ 、 Mg2+ 的 PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是 0.25%。用 滤器过滤除菌。 ?胰蛋白酶液消化时间:2-10分钟。
?血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用,可以用血清

来终止胰蛋白酶的消化

抗菌素的使用:
?在培养液配制后,培养液内常加适量抗菌素,以抑制可

能存在的细菌的生长。
?

通常是青霉素P.+链霉素S.联合使用。培养基内P.S. 最终使用浓度为每毫升100单位或微克。 庆大霉素:每毫升100单位——方便、广谱、稳定 比较合理的建议是,在常规的细胞培养中不要使用 抗生素。只有在培养污染源很多(比如组织培养), 或者培养非常珍贵的细胞株时才使用抗生素

? ?

完全培养基的组成
?体外培养的细胞直接生活在培养基中,因此培养

基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、 渗透压、pH等诸多方面的要求。
?基础培养基(1640或DMEM) ?血清

80%一95% 5%一20%

?NaHCO3
?P.

2.0 -3.7 g/L
各100单位/毫升

S.

?HEPES

2.0 -5.98 g/L

培养基的配制
RPMI-1640/DMEM培养粉 碳酸氢钠 1袋 2.0 g

青、链霉素
加三蒸水 至 1000ml,4℃过夜

各100单位/毫升

过滤除菌。
调节pH值至7.2

加血清(终浓度 10%)


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