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考研-华南理工大学-发酵工程-工业微生物复习题及答案


复习思考题及答案
第一章 微生物与工业微生物学
1.什么是微生物? 广义的微生物和工业微生物主要包括哪几大类? 答: 微生物是指所有形体微小,单细胞或结构简单的多细胞,或没有细胞结构的一群最低等的生物。 整个微生物家族的成员包括三大类:(1) 非细胞类微生物 (真病毒、亚病毒 );(2) 原核细胞类微生物 (细

菌、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体、衣原体);(3) 真核细胞类微生物 (酵母菌、霉菌、蕈菌、藻类、原 生动物)。 以上三大类微生物中, 原核生物中的细菌、放线菌,真核生物中的酵母菌、霉菌和蕈菌, 以及非细胞生物中 的噬菌体, 是在工业上有重要用途或关系密切的微生物。

2.微生物具有哪些主要特性? 试简要说明之。 答: 微生物, 除了具有一般大型生物的共性外, 还带来了以下这些任何其它生物所不能比拟的特性:

(1)种类多

到目前为止, 人们已经发现并已认识的微生物种类大约有 20 万种, 其中绝大多数为较容易观

察和培养的真菌、藻类和原生动物等大型微生物。据粗略估计, 微生物的种类约为几百万种。人类已经开发利用 的微生物则仅占已发现微生物种的约 1%, 都是与人类的生活、生产关系最密切的那些种类。此外,在现有环境 中还存在着极其大量的“不可培养的” (unculturable)微生物。微生物种类多, 一方面还表现在微生物的生理代 谢类型多, 另一方面还表现在微生物能产生和积累的代谢产物种类繁多。

(2)分布广 微生物因其形体微小、重量轻, 故可以随着风和水流到处传播。在空气、水、土壤和动植物体
表体内, 到处都充满了大量的各种微生物。可以说微生物是无处不有, 无孔不入, 几乎到处都是微生物活动的场 所。只要环境条件合适, 它们就可以在那里大量地繁殖起来。凡是有动植物生存的地方都有微生物存在, 而没有 动植物生存的地方也有微生物存在。因为一部分微生物具有特殊的抗逆性, 它们可以在某些恶劣的极端环境条件 下生活, 被人们认为是生物圈上下限的开拓者和各种世界记录的保持者。

(3)繁殖快
意义。

微生物惊人的生长繁殖速度是其它任何生物都望尘莫及的。 在最适宜的培养条件下, 人们最熟

悉的大肠杆菌每 13~20 分钟就可分裂出新的一代。微生物繁殖速度快这一特性, 在发酵工业上有着重要的实践

(4)代谢强

微生物的代谢强度比起高等生物要高出几百至几万倍。微生物代谢能力强主要表现在吸收多,

转化快。吸收多即“胃口大” 。微生物代谢能力强这个特性, 为它们的高速生长繁殖和产生大量代谢产物提供了 充足的物质基础。其代谢能力强的主要原因是由于个体小,比表面积大,因此它们能够在细胞与环境之间迅速交 换营养物质和代谢产物。 同时, 它们在细胞内也会不断合成具有高活性的代谢酶类以适应自身迅速生长繁殖的需 要。

(5)易变异

微生物容易发生变异的主要原因, 是个体多为单细胞或结构简单的多细胞,甚至非细胞结构。

因而在受到外界物理或化学因素影响后,很容易引起细胞内的遗传物质发生突变,结果导致遗传性状,包括形态 或生理表型上的变异。 微生物易变异的另一个原因是细胞增殖速度快, 细胞数量多, 因而尽管其自发突变率很低, 也会造成在短时间内产生较多的变异后代。很显然,微生物容易变异的特性对人类而言既有益又有害。

3.何谓微生物的分类、鉴定和命名?微生物的主要分类单位有哪些?其命名法则怎样? 答:微生物分类学的内容包括分类、鉴定和命名三个部分。分类是根据微生物表型特征的相似性或系统发育 的相关性进行分群归类, 编排成系统;鉴定是依据现有的微生物分类系统, 通过各种特征描述和测试, 确定一个

未知名微生物所应归属分类群的过程;命名则是根据国际统一命名法则, 给予每个新发现的微生物一个特有的专 用名称, 即学名。 微生物种以上的分类单位自上而下依次分为域、界、门、纲、目、科、属、种共 8 级,这是主要的分类单位。 此外,在两个主要分类单位之间,还可添加亚门、亚纲、亚目、亚科、亚属、亚种等次要分类单位。 微生物与其他生物一样,按国际命名法规命名,即采用双名法或三名法,给每一种微生物取一个国际学术界 都公认的科学名称,即学名(scientific name)。每一个微生物的学名均由拉丁词、希腊词或拉丁化的外来词组成, 在出版物中应排成斜体字。

4.若按六界系统分类,生物可分为哪六界?工业微生物在该分类系统中的位置怎样? 答:若按 1977 年我国学者王大耜等在魏塔克(R. H. Whittaker)主张五界系统的基础上再增加一个病毒界而 形成的六界系统,那么微生物在该分类系统中应分别属于病毒界、原核生物界、真核原生生物界和真菌界。工业 微生物在该分类系统中的位于: 动物界 植物界 蕈 菌 真菌门 真菌界 霉 菌 酵母菌 粘菌门 — 粘菌 原生动物 生物分类系统 真核原生生物界 单细胞藻类 蓝色光合菌门 — 蓝细菌 原核生物界 细菌门 细 菌 病毒界 — 病毒(噬菌体) 放线菌

微 生 物

5.微生物分类鉴定的主要依据是什么?微生物的分类鉴定方法和技术可归纳为哪几种? 答: 微生物的分类是以它们的形态结构、 生理生化反应和遗传性等特征的异同为依据, 根据生物进化的规律, 将微生物进行分门别类,并根据相似性或相关性水平编排成系统。微生物分类鉴定的主要依据包括: (1) 经典的分类鉴定依据 微生物的形态特征、微生物的生理生化特性、微生物的生态特性、血清学反应; (2)现代的分类鉴定依据 细胞壁的化学成分、 细胞的其他化学成分、 DNA 碱基比例 (GC 比)、 DNA 杂交率、 rRNA 寡核昔酸序列同源性、微生物全基因组序列。

6.现代工业微生物学的新发展主要表现在哪几方面? 展望新世纪的工业微生物学, 有哪些发展趋势? 答:现代工业微生物学的新发展主要表现在: (1) 20 世纪 50、60 年代, 受抗生素工业迅猛发展的影响, 工业微生物学史上开始出现寻找各种有益微生物代 谢产物的热潮,而且工业微生物产品逐步向生产少量而贵重的生物药物新产品的方向发展。在此期间,工业微生 物学在应用研究方面, 则向着更自觉更有效和可人为控制的方向发展。 人们开始采用新的育种方法定向选育优良 菌种,以达到提高产品产量的目的。 (2) 从 70 年代初开始,固定化酶和固定化菌体技术已逐步发展起来并应用于工业化生产,它的优越性在于

可连续、稳定、长时间地反复进行生物催化反应,生产效率高,易于控制、节省原料和能源,它使传统的微生物 发酵工艺产生革命性的变化。 (3) 从 80 年代初开始,各种微生物细胞的原生质体和原生质体之间的融合再生技术得到迅猛发展,并已成 为微生物发酵工业中的另一种重要而有效的育种手段。 微生物种内、 异种间或异属间的细胞融合的结果形成了各 种类型的重组融合体,赋予了微生物新的遗传性状,从而能产生新的组分,新的代谢产物或提高某种产物的产量 等。 (4) 随着分子生物学和分子遗传学的发展,一门新兴的综合性的应用学科—生物工程学(又称生物技术)在 世界范围内迅速地发展起来。生物工程技术体系主要包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程(微生物工程) 和生化工程。现代工业微生物学已经与基因工程、细胞工程和酶工程等紧密结合起来,在生物工程这个高科技前 沿带中充分发挥其主角的作用并得到新的发展。 新世纪的工业微生物学发展趋势: (1) 新世纪微生物基因组学研究, 将进一步扩大到与工业、农业、环境、资源等密切相关的重要微生物,将 为进一步利用和改造微生物菌种产生质的飞跃, 将为不断地提高目标产物的生产水平或生产新的产物提供了可 能性。 微生物将是新世纪进一步解决资源和能源等实际应用问题的最理想材料。 (2) 新世纪的工业微生物学将更广泛地与能源、信息、材料、计算机等多种学科交叉、渗透和结合。 因此 加强学科间的交流和合作具有特别重要的意义, 它将开辟新的研究和应用领域, 并获得新的发展。微生物学的研 究技术和方法, 将会在吸收其他学科的先进技术的基础上, 向自动化、定向化和定量化发展。 (3) 21 世纪, 微生物产业将呈现全新的局面, 除了更广泛地利用和挖掘不同生境 (包括极端环境)的自然资源 微生物外, 基因工程菌将形成一批强大的工业生产菌, 生产外源基因表达的产物, 特别是药物的生产将出现前所 未有的新局面。结合基因组学在药物设计上的新策略, 将出现以核酸为靶标的新药物的大量生产, 微生物制药工 业的生产水平将进一步提高。在新世纪人类将完全征服癌症、艾滋病以及其他特殊的疾病。 (4) 在 21 世纪, 随着工业生物技术高潮的到来, 将出现一批崭新的微生物工业, 将生产出各种各样的新产品, 例如降解性塑料、DNA 芯片、生物能源、精细化学品等, 为全世界的经济和社会发展作出更大贡献。

第二章 重要的工业微生物
1. 细菌有哪几种基本形态? 其大小及繁殖方式如何? 答:细菌按其个体形态,基本上可分为球状、杆状、螺旋状三种,分别称为球菌、杆菌和螺旋菌。 球菌大小以其直径表示, 大多数球菌的直径为 0.5?1μ m; 杆菌大小以其宽度和长度表示, 多数杆菌的宽度与 球菌直径相近,其长度则为宽度的 1 倍至几倍 (约 0.5~5μ m); 螺旋菌大小也以其宽度和长度表示, 但长度一般 是指菌体两端点间的距离, 并非真正的长度。 多数螺旋菌大小为 0.3 ? 1 ? 1 ? 50μ m。 细菌一般进行无性繁殖, 最主要的无性繁殖方式是裂殖,即一个细胞通过分裂(二分分裂或折断分裂),结果 由一个母细胞形成大小基本相等的两个子细胞。有少数芽生细菌能象酵母菌一样进行芽殖, 即在母细胞一端先形 成一个小突起, 待其长大后再与母细胞分离的一种繁殖方式。此外,还有极少数细菌种类(主要是大肠杆菌) , 在实验室条件下能通过性菌毛进行有性接合。

2. 试述细菌细胞的一般结构、化学组成及其主要生理功能。 答:一般结构是指一般细菌细胞共同具有的结构,包括细胞壁、细胞质膜、核质体和细胞质等。 (1) 细胞壁 革兰氏阳性细菌细胞壁较厚(20 ~ 80 nm), 机械强度较高, 化学组成较简单, 主要含肽聚糖和 磷壁酸; 革兰氏阴性细菌细胞壁较薄, 机械强度较低, 但层次较多, 成分较复杂, 主要成分除蛋白质、 肽聚糖和脂 多糖外, 还有磷脂质、脂蛋白等。细胞壁的主要功能是: ①维持细胞外形,保护细胞免受外力(机械性或渗透 压)的损伤;②作为鞭毛运动的支点;③为细胞的正常分裂增殖所必需;④具有一定屏障作用,对大分子或有害

物质起阻拦作用;⑤与细菌的抗原性、致病性及对噬菌体的敏感性密切相关。 (2) 细胞质膜 细胞质膜的结构可表述为液态镶嵌模型(fluid mosaic model), 即由具有高度定向性的磷脂双分 子层中镶嵌着可移动的膜蛋白构成。其化学组成主要是蛋白质(占 50%~70%)和脂类(占 20%~30%) ,还有少 量的核酸和糖类。脂类主要是磷脂,每一个磷脂分子由一个带正电荷的亲水极性头(含氮碱、磷酸、甘油)和两 条不带电荷的疏水非极性尾(长链饱和与不饱和脂肪酸)组成。非极性尾的长度和饱和度因细菌种类和生长温度 而异。 细胞质膜的生理功能主要是:① 具有高度的选择透性,控制营养物质的吸收及代谢产物的排除, 是维持细 胞内正常渗透压的结构屏障; ② 含有各种呼吸酶系, 是氧化磷酸化或光合磷酸化产生 ATP 的部位; 是细胞壁 ③ 和糖被的各种组分生物合成的场所;④ 质膜上的间体与 DNA 复制分离及细胞间隔形成密切相关;⑤ 是鞭毛的 着生点并为其运动提供能量。 (3) 核质体 核质体实际上是一条很长的环状双链 DNA 与少量类组蛋白及 RNA 结合, 经有组织地高度压 缩缠绕而成的一团丝状结构,通常称之为细菌染色体(图 2 – 12) 。细菌染色体中心有膜蛋白核心构架,构架上 结合着几十个超螺旋结构的 DNA 环,而类核小体环不规则分布在 DNA 链上。其功能是起贮存遗传信息和传递 遗传性状的重要作用。 (4) 细胞质 主要化学成分是水(约占 80%)、蛋白质、核酸、脂类,少量糖类及无机盐类。一般细菌细胞质 中主要含有核糖体、贮藏物、酶类、中间代谢物、质粒、各种营养物质和大分子的单体等。少数细菌还含有磁小 体、羧酶体、气泡等组分。 其中,核糖体是由核糖核酸和蛋白质组成的微粒,由 50S 大亚基和 30S 小亚基组成, 每个细菌细胞约含 1 万 个,是合成蛋白质(酶)的场所。贮藏物是一类由不同化学成分累积而成的不溶性颗粒, 主要功能是贮存营养物 和提供碳源、能源、氮源和磷源等, 其种类主要有:糖原颗粒、聚?-羟基丁酸颗粒、硫颗粒、藻青蛋白、异染粒 等。

3. 细菌细胞的特殊结构包括哪些部分? 各有哪些生理功能? 答:特殊结构是指仅在某些细菌细胞才具有的或仅在特殊条件下才能形成的结构,包括糖被、鞭毛、菌毛和 芽孢等。 (1) 糖被 糖被的生理功能主要是:①起保护作用,使细菌能抗干燥、抗噬菌体吸附、抗白细胞吞噬;②是 菌体外的贮存物质, 营养缺乏时可作为碳源和能源利用; ③可使菌体附着于某些物体表面; ④作为透性屏障, 使 细菌免受重金属离子毒害。 (2) 鞭毛 鞭毛的生理功能是运动, 鞭毛的运动引起菌体的运动,以实现其趋性 (包括趋化性、趋氧性、趋

光性等),其运动方式有泳动、滑动、滚动或旋转。 (3) 菌毛 普通菌毛的主要功能是使细菌较牢固地粘附在动植物细胞或组织的表面,即作为细菌感染动植物 组织(如呼吸道、消化道和泌尿生殖道等的粘膜)的粘附器官。性菌毛是雄性菌株(供体菌)在有性接合过程中, 向雌性菌株(受体菌)传递遗传物质的通道。此外,某些 RNA 噬菌体(如 M13)以性菌毛作为特异性吸附受体。 (4) 芽孢 一个细菌只形成一个芽孢,一个芽孢萌发为一个营养细胞,故细菌产芽孢并无繁殖功能,而是产 芽孢细菌生存的一种形式。与营养细胞相比,休眠状态的生芽孢细胞对热、辐射、干燥和化学药品等恶劣环境具 有极强的抵抗能力。

4. 简单表述肽聚糖的组成和结构。革兰氏阳性和阴性细菌细胞壁结构和组成有何不同? 答:每一肽聚糖单体由 3 部分组成: ①双糖: 由 N—乙酰葡萄糖胺(NAG)与 N—乙酰胞壁酸(NAM)通过 β -1,4-糖昔键相连形成双糖单位(易被溶菌酶水解); (图 2 – 7) ② 短肽(四肽尾): 由 4 个氨基酸分子按 L 型与 D 型交替方式连接而成, 短肽接在 N—乙酰胞壁酸(NAM)上; ③ 肽桥(肽间桥): 起着连接前后 2 个短肽分子的

作用, 其组成分具有多样性, 如金黄色葡萄球菌的肽桥为-(Gly)5-, 而大肠杆菌的肽桥为-CO·NH-。 肽聚糖的结构可简单表述为:由 N—乙酰葡萄糖胺(NAG)与 N—乙酰胞壁酸(NAM)重复交替连接构成 骨架,接在 N—乙酰胞壁酸上的相邻短肽由肽桥再交叉相联, 形成致密的多层网状结构。短肽和肽桥的组成分及 联接方式依不同种类细菌而异。 革兰氏阳性细菌细胞壁较厚(20 ~ 80 nm), 机械强度较高, 化学组成较简单, 主要含肽聚糖和磷壁酸;革兰氏 阴性细菌细胞壁较薄, 机械强度较低, 但层次较多, 成分较复杂, 主要成分除蛋白质、肽聚糖和脂多糖外, 还有磷 脂质、脂蛋白等。

5. 什么是革兰氏染色法? 其基本原理及操作步骤怎样? 答:1884 年,丹麦医生革兰氏(Gram)发明了一种重要的细菌鉴别染色法称革兰氏染色法 (Gram stain)。 该染色法的步骤是: (1)先用结晶紫液初染; (2)再用碘液媒染(与结晶紫形成不溶于水的复合物)(3)接着 ; 用 95%乙醇进行脱色; (4)最后再用番红(沙黄)液复染。经过这种染色方法可以将所有细菌基本上区分为两大 类: 革兰氏阳性细菌(Gram positive bacteria):原经(1) (2)步已染上的紫色复合物不被乙醇洗脱仍保持紫色, 称革兰氏阳性(G +) 。 革兰氏阴性细菌(Gram negative bacteria):原已染上的紫色复合物易被乙醇洗脱,又变成无色菌体最后则被番 红复染而呈红色,称革兰氏阴性(G ) 。 革兰氏染色反应机理:一般认为,革兰氏阳性细菌细胞壁较厚而紧密,肽聚糖网层次多、交联致密,不含类 脂质。 当用乙醇脱色时, 因失水而引起肽聚糖层网格结构的孔径缩小乃至关闭, 阻止了结晶紫—碘复合物的洗脱, 故菌体最后仍呈紫色或紫红色;相反, 革兰氏阴性细菌因其细胞壁薄, 外膜层的类脂含量高, 而肽聚糖层薄和交 联度差, 当乙醇脱色时,外膜层的物质迅速被溶解,通透性增大,结晶紫—碘复合物被抽提洗脱,细胞褪成无色, 再经沙黄等红色染料复染, 结果阴性菌呈现红色。


6. 什么是原核生物? 哪些微生物属于原核生物? 答:原核微生物 — 这类微生物细胞中的核比较原始简单,没有核膜包围,不具核仁和典型的染色体,也没 有固定形态。主要包括:细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原体等,在工业上有重要作用的原核 微生物主要是细菌、放线菌和蓝细菌。

7. 请解释下列名词:菌落、菌苔,单菌落、菌膜、菌落特征。 菌落 细菌接种在固体培养基后, 在适宜的条件下以母细胞为中心迅速生长繁殖所形成的肉眼可见的子细胞 堆团,称为菌落(colony) 。 菌苔 将某一纯种细菌的大量细胞密集地划线(直线或之字线)接种到琼脂斜面上,培养 2 ~ 4 天后,每个 细胞长成的菌落相互联接成一片,称为菌苔(lawn) 。 单菌落 由一个单细胞繁殖而成的菌落则称之为单菌落, 可认为是细菌的纯培养物即纯种。 菌膜 好氧细菌在试管的液体培养基中静置培养后,在液体表面的生长状态。 菌落特征 在一定的培养条件下,各种细菌在固体培养基表面所形成的菌落具有一定的形态、构造等特征。

8. 试述工业上常用几种细菌 (大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、枯草芽孢杆菌)的学名、 用途及细胞形态特征。 答:工业上常用几种细菌的学名、用途及细胞形态特征: 大肠杆菌 (Escherichia coli) 大肠埃希氏菌, 俗称大肠杆菌。 菌体呈短杆或长杆状, 0.5~1.0×1.0~3.0 ? m,

革兰氏阴性,运动(周毛)或不运动,无芽孢,一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色,扩展,光滑,闪光。大肠杆菌 的用途主要有: 制取氨基酸、制备多种酶、作为基因工程受体菌、作为水和食品中微生物学检验的指示菌。 谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum) 为直到微弯的杆菌,常呈一端膨大的棒状,行折断分裂而 成八字形排列或栅状排列。大多数种不运动。革兰氏阳性。 棒状杆菌的用途主要有:高产谷氨酸、生产其它多 种氨基酸、生产 5′-核苷酸、水杨酸、棒状杆菌素等。 乳酸杆菌(Lactobacillus SP.) 为革兰氏阳性菌(老培养物中的细胞可能是阴性) ,大小一般为 0.5~1×2~ 10 μ m,形成长丝,单个或成链。无芽孢,多数不运动。乳酸杆菌的主要用途有:工业生产乳酸、发酵生产乳 制品、生产其它乳酸发酵食品、生产药用乳酸菌制剂、生产禽畜益生菌制剂。 双歧杆菌(Bifidobacterium SP.) 菌体细胞呈现多形态, 有的呈较规则形短杆状,有的为纤细杆状带有尖细 末端,有的呈长而弯曲状,也有的呈各种分枝或分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状,V 形、栅状排列,或聚集 成星状。革兰氏阳性、不形成芽孢、不运动。双歧杆菌的主要用途有:生产微生态制剂、生产含活性双歧杆菌的 乳制品。 以双歧杆菌和嗜酸乳杆菌为主、 再辅以嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌等菌种, 混种发酵生产而成的酸乳, 是一种具有很好保健作用的功能性食品。 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 俗称枯草杆菌。细胞 0.7~1×2~3 μ m,直杆状,单个,着色均匀,

无荚膜,运动(周生鞭毛) ,革兰氏染色阳性。芽孢小于或等于细胞宽,椭圆至圆柱状,中生至近中生,壁薄。 菌落粗糙,不透明,不闪光,扩展,污白色或微黄色。枯草芽孢杆菌的用途主要有:生产各种酶制剂、发酵生产 核苷、生产某些抗生素、生产各种多肽、蛋白质类药物和酶。

9. 试述放线菌的形态特征和细胞的结构。 答:放线菌菌体是由分枝状菌丝组成的(图 2 – 29), 菌丝细胞在培养生长阶段无横隔膜,故一般都呈多核的 单细胞状态。以种类最多(约 500 种)、形态特征最典型的链霉菌为例,其菌丝可分为营养菌丝、气生菌丝和孢子 丝三种:基内菌丝、气生菌丝、孢子丝。孢子丝成熟后,可形成各种各样形态不同的分生孢子。 放线菌菌丝细胞的结构基本上与细菌相似, 细胞壁主要也由肽聚糖组成, 但各种放线菌细胞壁所含肽聚糖的 组成分有所不同。细胞壁化学组成中也含有原核生物所特有的胞壁酸和二氨基庚二酸,而不含几丁质或纤维素。 在幼龄菌丝细胞中有明显的核质体(拟核) ,且为数众多。菌丝细胞革兰氏染色一般呈阳性反应。

10.放线菌孢子形成的方式可归纳为哪几种? 答:放线菌孢子形成的方式可归纳为以下三种:(1) 横隔分裂形成分生孢子, 如链霉菌、诺卡氏菌,; (2) 形 成孢子囊产生孢囊孢子, 如链孢囊菌和游动放线菌; (3) 在菌丝顶端形成少量孢子, 如小单孢菌。

11.为什么说放线菌是介于细菌和真菌之间而又更接近于细菌的一类原核微生物? 答:(1)放线菌与霉菌相似之处 放线菌和霉菌都具有显著分枝的菌丝, 菌丝的生长和分枝方式也很相似, 而且多数都能产生分生孢子并以分 生孢子进行无性繁殖。很多放线菌在液体培养基中的生长状态(形成菌丝球)也与霉菌相似。在琼脂培养基上生长 形成的老龄菌落与某些霉菌(如青霉)相似。 (2)放线菌与细菌相同或相似之处 放线菌的菌丝和孢子的宽度与杆菌的宽度很相仿(约 1μ m) ,但比霉菌菌丝细得多;幼龄放线菌的菌落大小和表 面特征与某些细菌很相似。 放线菌的菌丝细胞结构基本上与细菌细胞相同,都属于原核生物,无核膜、核仁和典型染色体,细胞壁的主 要成分是肽聚糖,含有原核细胞壁特有的胞壁酸和二氨基庚二酸,一般革兰氏染色阳性;放线菌噬菌体的形状与 细菌的相似;与细菌一样对溶菌酶敏感。此外放线菌的最适生长 pH 为中性至微碱性,与多数细菌基本相同。

基于上述的比较,可见放线菌是一类在形态上介于细菌和霉菌之间,但在分类学上,在亲缘关系上却与细菌 十分接近的原核微生物。

12.放线菌有何用途? 试举例说明放线菌在生物制药工业上的重要性。 放线菌的最突出特性是能产生各种各样大量的抗生素。 抗生素作为最主要的抗感染药物, 使人类基本上控制 了传染病的危害。至今已发现的约 1 万种抗生素中,由放线菌产生的就约占 70%。 放线菌的次生代谢产物可用于制备酶抑制剂、抗癌剂、免疫调节剂、受体拮抗剂等许多新的微生物药物;有 的放线菌在工业上还用于生产酶制剂和维生素。此外,放线菌在甾体转化、石油脱腊、烃类发酵、污水处理和环 境保护等方面也有重要作用。 例如链霉菌属是放线菌中最大的一个属,种类繁多。而且其中有一半以上能产生抗生素。所有由放线菌产生 的抗生素中。约有 90 %是由链霉菌属产生的。链霉菌在生物制药工业上的主要用途有:生产多种重要的抗生素、 生产多种酶类、生产各种酶抑制剂、生产维生素。

13.酵母菌细胞结构与细菌细胞结构主要有哪些不同? 答:酵母菌的细胞主要由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、液泡和线粒体等构成。 酵母细胞壁与细菌细胞壁相比,在坚韧性上较差,在结构和组成分上也大不相同。酵母细胞壁可分三层:外 层的组成分是甘露聚糖 (mannan) 和磷酸甘露聚糖,约占 40 %~ 45%;中间层是蛋白质,约占 5% ~ 10%, 其中有 些是与甘露聚糖相结合的各种酶类 (如葡聚糖酶、 蔗糖酶、 脂酶等) 内层的组成分是葡聚糖 (glucan), ; 约占 35%~ 45%,为分枝状聚合物, 是维持细胞壁机械强度的主要成分。此外,细胞壁中还含有酯类(3% ~ 8%) 、少量几丁 质(1% ~ 2%)和灰分。 酵母菌为真核微生物,其细胞核由双层多孔核膜包裹着,膜孔直径约为 80 ~ 100 nm,用以增大膜的透性和 膜内外的物质交换。细胞核中含有由 DNA 和组蛋白结合而成的线状典型染色体。 在有氧时生长的酵母细胞质中,分布有一种数目较多,棒状或圆筒状,大小为 0.3 ~ 1×0.5 ~ 3 μ m 的细胞 器 — 线粒体 (mitochondrion)。在老龄的酵母细胞质中,出现一个被单层膜包围的液泡(vacuole) 。

14.真核生物与原核生物在细胞核结构上有何不同? 哪些微生物属于真核生物? 答:原核微生物 — 这类微生物细胞中的核比较原始简单,没有核膜包围,不具核仁和典型的染色体,也没 有固定形态。主要包括:细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原体等,在工业上有重要作用的原核 微生物主要是细菌、放线菌和蓝细菌。 真核微生物 — 该类微生物的细胞具有真正的核,细胞核有核膜包围,核内有核仁和染色体, 细胞质中存在 线粒体或同时存在叶绿体等细胞器。主要的真核微生物有:酵母菌、霉菌(丝状真菌) 、蕈菌(大型真菌) 、藻类 和原生动物。本章将着重介绍在工业上用途最广的酵母菌、霉菌和蕈菌。

15.酵母菌的繁殖方式与细菌有何不同? 答:酵母菌的繁殖方式可分为无性繁殖和有性繁殖两种方式。无性繁殖主要有芽殖、裂殖、产无性孢子(节 孢子、掷孢子、厚垣孢子)等三种方式,而有性繁殖则以产生有性孢子—子囊孢子的方式进行繁殖。其中,最典 型和最主要的繁殖方式是芽殖、裂殖和产子囊孢子 细菌一般进行无性繁殖, 最主要的无性繁殖方式是裂殖,即一个细胞通过分裂(二分分裂或折断分裂),结果 由一个母细胞形成大小基本相等的两个子细胞。有少数芽生细菌能象酵母菌一样进行芽殖,。

16.工业上常用的酵母菌主要有哪些? 它们各有何特性和用途?

答:工业上常用的酵母菌主要有:

(1) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 主要用途有:用于生产酒精(乙醇) 、用于生产白酒和其它
饮料酒、用于食品工业生产多种食品、用于医药工业生产各种医药品。

(2)卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis) 主要用途有:用于生产啤酒、生产食用药用和饲料
酵母、提取麦角固醇(含量较高) 、作为维生素测定菌等。

(3)异常汉逊氏酵母 (Hansenula anomala)
药物、制造发酵食品等。

用途主要有:用于增加食品的味、生产单细胞蛋白、某些

(4)假丝酵母 (Candida sp. ) 用途主要有:生产酵母蛋白作为人畜可食的蛋白质、石油发酵脱蜡并制取饲
料蛋白、由烷烃发酵生产柠檬酸等有机酸。

17.鉴别啤酒酵母菌种质量的指标主要有哪几项? 答:(1) 酵母细胞数一般约为 1 亿 / ml, 是反映酵母繁殖能力和培养成熟的指标 ; (2) 酵母出芽率要求在 15% ~30%,是衡量繁殖是否旺盛的指标 ; (3) 酵母死亡率应在 1%以下, 正常培养的酒母不应有死亡现象。

18.列表比较根霉、曲霉和青霉形态结构的异同? 答:根霉、曲霉和青霉形态结构的异同(由学生自行列表比较): 根霉 (rhizopus) 的菌丝无横膈膜,单细胞。菌丝体白色,气生性强,在固体培养基上迅速生长交织成疏松 的棉絮状菌落,可蔓延充满整个培养皿。 根霉在固体培养基上或自然培养物上生长时,由营养菌丝体产生具有延伸功能的弧形匍匐菌丝 (stolon),在 培养基表面向四周蔓延生长。由匍匐菌丝分化出分枝状的假根 (rhizoid),接触基质并吸取养分。在与假根相对的 方向上生出孢囊梗(柄) ,顶端膨大形成孢子囊,内生孢子囊孢子。孢子囊内有一近球形的囊轴,囊轴茎部与梗 相连处有囊托。孢子囊成熟后,孢子囊壁消解或破裂,可释放出大量的孢子囊孢子。 曲霉 (aspergillus) 的菌丝有横膈膜,为多细胞丝状真菌。某些菌丝细胞特化膨大成为厚壁的足细胞,由足细 胞生出直立的分生孢子梗 (无横隔) 顶部膨大形成球形的顶囊。 , 在顶囊的表面以放射状生出一层或两层小梗 (初 生小梗、次生小梗) ,小梗的顶端着生成串的分生孢子。顶囊、小梗及分生孢子链一起构成分生孢子穗(或分生 孢子头) ,分生孢子穗具有各种不同的颜色和形状 。 青霉 ( penicillium ) 的菌丝与曲霉相似,有横隔,多细胞,但无足细胞。分生孢子梗(也有横隔)直接由气 生菌丝生出,顶端不膨大成为顶囊,而是经过多次分枝成为帚状枝(孢子穗) 。帚状枝是由单轮、二轮或多轮分 枝构成,对称或不对称。最后一轮分枝称为小梗,在小梗顶端产生成串的蓝绿色分生孢子。有极少数青霉能产生 闭囊壳,内生子囊和子囊孢子。

19.霉菌的繁殖方式怎样?霉菌可产生哪些无性孢子和有性孢子? 答:在正常自然条件下,霉菌是通过气生菌丝分化出各种形态的子实体,如孢子囊、分生孢子穗、分生孢子 器和子囊果等,再产生各种无性孢子(孢子囊孢子、分生孢子、厚垣孢子、节孢子、芽孢子等)和有性孢子(接 合孢子、子囊孢子、卵孢子等)分别进行无性和有性两种繁殖方式。

20.试述工业上常用几种霉菌的主要特性、用途及分类位置。 答:工业上常用几种霉菌的主要特性、用途及分类位置:

(1)根霉 根霉具有活力强大的淀粉酶,其中糖化型淀粉酶与液化型淀粉酶的比例约为 3.3:1,可见其糖化
型淀粉酶特别丰富,活力强大,能将淀粉结构中的α ―1,4 糖苷键和α ―1,6 糖苷键打断,最终较完全地将淀 粉转化为纯度较高的葡萄糖。根霉除具有糖化作用外,还能产生少量乙醇和乳酸。根霉的主要用途有:用于制曲

酿酒、生产葡萄糖、生产酶制剂、生产有机酸、生产发酵食品、用于医药工业。

(2)毛霉 毛霉大都能生产活力强大的蛋白酶,有很强的分解大豆的能力。毛霉可产生多种酶类和各种有机
酸。毛霉的用途主要有:发酵生产大豆制品、生产多种酶类、生产有机酸、转化甾体化合物。

(3)曲霉 曲霉属的菌种具有很多活力强大的酶,如淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、纤维素酶和
半纤维素酶、柚苷酶和橙皮苷酶、脱氧核糖核酸酶等。曲霉是一类具有重要经济价值而被广泛应用的真菌, 主要 用途有:生产传统发酵食品、生产多种重要的酶制剂、工业化大量生产柠檬酸、生产多种其他有机酸、生产多种 真菌类抗生素、生产真菌毒素、甾体化合物的转化等。

(4)青霉 青霉属中的点青霉 (P. notatum)又称音符型青霉,是第一个用于生产青霉素的菌种。1943 年开始
改用产黄青霉(P. chrysogenum) ,又称橄榄型青霉, 进行工业化大量生产青霉素。青霉还可生产其它抗生素 (灰 黄霉素、桔霉素、岛青霉肽、苹果菌素和扩展霉素等), 生产有机酸(葡萄糖酸、柠檬酸、抗坏血酸等), 生产多种 酶类(葡萄糖氧化酶、中性碱性蛋白酶、酰化酶、5′―磷酸二酯酶、脂肪酶、凝乳酶、真菌细胞壁溶解酶)等。

(5)头孢霉 头孢霉 ( cephalosporium ) 的主要用途有:发酵生产头孢菌素 C、生产半合成新头孢菌素类抗
生素。

21.画出根霉、曲霉和青霉形态简图,并注明各部分的名称。 答:

青霉

根 霉

曲 霉

22.列表比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的个体形态、细胞结构、繁殖方式的特点。 答:由学生自行填入下表: 细 菌 个体形态 放线菌 酵母菌 霉 菌

细胞结构

繁殖方式

23.如何在显微镜下区分上述四大类微生物? 答:细菌 菌体微小透明,一般要经染色并用油镜((1000~1500 倍))才能看清其个体形态(球状、杆菌、 菌体细胞较大,可直接制成水浸片用高倍镜(400~600 倍)观察其活细胞(椭园或卵园形, 一般不必经染色, 用

螺旋状); 酵母菌

往往有芽细胞)放线菌 一般要经染色, 用油镜或高倍镜观察其微小分枝的菌丝体; ; 霉菌 低倍镜(100~150 倍)就可观察其较粗且分枝的菌丝体和子实体(孢子头)。

24.列表比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌菌落的形态特点。 答:由学生自行填入下表: 细菌菌落 酵母菌菌落 放线菌菌落 霉菌菌落

25.如何从平板上区分上述四大类微生物? 其菌落形态与细胞形态有何联系? 答:按上表列出的细菌、放线菌、酵母菌和霉菌菌落的形态特点的不同回答第一个问题。 个体形态与群体形态之间存在的明显相关性。以细菌为例,多数细菌的菌落一般呈现湿润、光滑、粘稠、较 透明、易挑取、质地均匀、颜色较一致等共同特征。但由于不同细菌细胞在个体形态结构上和生理类型上的各种 差别,因此必然会极其密切地反映在上述各种菌落特征上。 例如, 生有粘液层的细菌菌落, 通常较大型, 呈透明的蛋清状; 生芽孢细菌的菌落往往外观不透明, 表面干 燥粗糙;无鞭毛、不能运动的球菌通常都形成小而厚、边缘整齐的半球形菌落; 长有鞭毛、有运动性的细菌一般 都长成大而平、边缘缺刻的不规则形菌落等等。 细菌这种在个体形态与群体形态之间存在的明显相关性, 对许多微生物学实验和研究工作很有参考价值。

26.蕈菌在生长发育过程中, 菌丝的分化可分成哪四个阶段? 答: 可分成下列四个阶段: (1) 形成由单核细胞构成的菌丝(一级菌丝);(2) 形成由双核细胞构成的菌丝(二 级菌丝); (3) 分化形成菌丝束或菌丝球 (三级菌丝); (4) 形成大型肉质子实体。

27.试述蕈菌双核菌丝的锁状联合形成过程。 答:锁状联合方式发生在菌丝顶端双核细胞的两核之间,其过程是: ①从双核之间的细胞壁向外侧生出一 个突起,并逐步伸长和向下弯曲形成钩; ②两核之一移入突钩之中;③两核同时进行一次有丝分裂, 产生 4 个 子核; ④突钩中分裂核的两个子核, 一个留在突钩之中, 另一个进入菌丝细胞顶端, 另一个分裂核的两个子核也 同时分开; ⑤突钩顶端弯到细胞之上并与细胞相连形成一个桥,其中子核通过桥到达细胞另一端; ⑥在突起产

生的起点形成一隔膜,又在桥的下方垂直形成另一隔膜, 结果把双核母细胞分成两个双核子细胞并各具两个不同 的子核。

28.简述蕈菌有性繁殖产生担子及担孢子的过程。 答:产生担孢子进行有性繁殖是蕈菌独有的特征。担孢子是着生在担子上的一种外生孢子, 其形成过程为: ①子实体成熟后, 双核菌丝的顶端膨大成为担子细胞; ②其中的两个核融合(核配), 形成一个二倍体新核; ③ 此新核经过二次分裂,其中一次为减数分裂,产生四个单倍体子核; ④与此同时,担子细胞顶端产生四个小梗, 小梗顶端稍微膨大; ⑤四个子核分别各进入四个小梗内; ⑥此后每核各发育成为一个有性孢子, 即担孢子。典 型担子菌的担子上都有四个担孢子。

29.试简述蓝细菌的形态特征、生理特性及主要用途。 答:蓝细菌的形态差别很大,概括起来有球状或杆状的单细胞和丝状的细胞链两种形态。根据它们的形态特 征, 可进一步分成下列五类: (1) 由二分裂形成的单细胞; (2) 由复分裂形成的单细胞; (3) 无异形胞菌丝状; (4) 有异形胞菌丝状; (5) 有异形胞分枝菌丝状。 蓝细菌只有少数为化能异养型生物, 多数为专性光能自养型生物, 能象高等绿色植物和高等藻类一样进行产 氧光合作用,同化二氧化碳为有机物质,加之许多种还具有固氮作用。因此,蓝细菌对营养要求很简单,不需要 维生素,只要有空气、阳光、水分和少量无机盐类,便能大量地生长繁殖。由于某些细胞能转化形成异形胞、静 息孢子和链丝段,而且菌体外面还包有能保持水分、抗干燥的胶黏质层,因此,使蓝细菌的生活和繁殖力更强。 上述这些生理特性,正是蓝细菌能广泛分布于各种自然条件下的主要原因。 蓝细菌的主要用途有:固氮作用、作为食物和营养品、用于提取各种生物药物。

30.什么是噬菌体? 试述噬菌体的形态结构和生长繁殖过程。 答:噬菌体(phage)是侵染原核生物(细菌、放线菌和蓝细菌)的病毒,它是一种超显微的,没有细胞结构的, 专性活细胞寄生的大分子微生物。 噬菌体的基本形态有蝌蚪形、微球形和纤线形三种类型,又可再细分为六种不同形态:(1) 尾部长而直,有 尾鞘,能收缩,双链 DNA; 尾部长而易弯,无尾鞘,不能收缩,双链 DNA; (3) 尾部比头部短,无尾鞘,不 能收缩,双链 DNA; (4) 六角形头部的顶角各有一个较大的衣壳粒,单链 DNA; (5) 六角形头部的顶角无衣 壳粒或有小衣壳粒,单链 RNA;(6)丝状噬菌体,无头部和尾部,为一条长而略弯的纤线, 单链 DNA。 以典型的蝌蚪形噬菌体 E.coli T4 为例, 其基本结构由头部、尾部和颈部三个部分组成:(1) 头部 呈二十面 体对称结构,其衣壳由衣壳粒组成。头部衣壳内,一条线状双链 DNA 分子折叠盘绕其中; (2) 尾部呈螺旋对称 结构, 由尾鞘、尾髓(尾管) 、基板、刺突和尾丝五个部分组成;(3) 头部与尾部相连处有一构造简单的颈部,由 颈环和颈须构成。

31.解释名词﹕潜伏期、平均裂解量、温和噬菌体、溶源性细菌。 答:潜伏期 从噬菌体吸附并将 DNA 注入宿主细胞至第一个成熟的子代噬菌体从宿主细胞中释放出来之前这段 时间,称为潜伏期。 平均裂解量 平均每个宿主细胞裂解后所释放出的子代噬菌体的数量称为平均裂解量。 裂解量应该等于裂解 期所测得的最高噬菌斑数除以潜伏期测得的噬菌斑数(实为被感染的宿主细胞数) 。 温和噬菌体 当噬菌体吸附并侵入宿主细胞后,能将其 DNA 插入(整合)到宿主细胞核 DNA 的一定位置 上成为前(原)噬菌体(prophage) ,并可长期随宿主 DNA 的复制而同步复制,因而在一般情况下不进行增殖和 引起宿主细胞的裂解,这一类型的噬菌体称为温和噬菌体(temperate phage) 。

溶源性细菌 受到温和噬菌体侵染而带有原噬菌体却又没有形态上可见到的噬菌体粒子的宿主菌, 称为溶源 性细菌,简称溶源菌(lysogen 或 lysogenic bacteria) 。

32.什么是噬菌斑?检查噬菌体常用哪几种方法? 答:当噬菌体与敏感宿主菌混合于琼脂培养基中培养时,噬菌体便侵染宿主细胞,释放出子代噬菌体并通过 琼脂再扩散到周围的细胞中,继续侵染引起更多的细胞裂解,从而在平板的菌苔上形成一个肉眼可见的无菌、透 亮、近圆形的空斑,称为噬菌斑 。 噬菌体检查的方法有多种, 如载玻片快速法、平板点滴法、单层琼脂法、双层琼脂法、离心分离加热法等, 其中双层琼脂法和单层琼脂法也可用于噬菌体的效价测定, 其具体操作方法详见第四章。

33.谷氨酸发酵感染噬菌体时有何异常现象? 预防噬菌体感染可采取哪些措施? 答:以谷氨酸发酵时感染噬菌体的异常现象为例: (1)菌体不增长或溶菌,表现为光密度(OD)不升或回 降; (2)pH 升高达 8.0 以上,且不下降; (3)不耗糖或耗糖极慢; (4)发酵液泡沫多、粘性大,色泽深; (5) 镜检菌体初期胀大变粗,边缘不整齐;后期细胞破碎呈云雾状,革兰氏染色呈红色碎片; (6)不产或极少产谷氨 酸。 工业发酵生产中,必须贯彻“以防为主,防重于治”的积极措施,这些措施主要有: (1)消灭噬菌体及其寄 主菌。污染了噬菌体的发酵液或种子液必须加热彻底杀灭后才能排放;严禁活菌体(如取样液)到处排放散布; 加强对环境(如车间空气)的噬检和消毒工作;加强车间环境的清洁卫生; (2)保证无菌空气净化系统的严密 有效。包括保证空气过虑器的装填严格合理,保证压缩空气有足够的冷却面积,以便充分去除油水等; (3)彻 底消除设备死角及渗漏,排除隐患; (4)严防种子携带噬菌体进入发酵罐(种子液要经过严格噬检) (5) ; 备有不同噬菌体类型的生产菌,定期轮换使用菌种; (6)选育抗噬菌体突变菌株; (7)必要时可考虑添加某 些噬菌体抑制剂。

34.简述λ 温和噬菌体的形态结构。λ 噬菌体侵染细菌时,能以哪两种状态存在? 答:λ 噬菌体也由一个直径约 55 nm 的正 20 面体头部和一条长约 150 nm、粗约 12 nm 的尾部构成。头部含 有一条线状的 DNA 分子,长度约只有 T 偶数噬菌体的四分之一(约 48Kb) 。包裹在头部外壳蛋白的这条 DNA 是通过尾部注入到细菌细胞内的。 λ 噬菌体侵染非溶源性细菌时,能以两种状态存在,一种是自主的,即营养体状态。处在这种状态时,λ DNA 不依赖寄主 DNA 而自行繁殖; 另一种是整合的, 即原噬菌体状态。 处于这种状态时, DNA 成为寄主 DNA λ 的一部分,并与其同步繁殖。

35.野生型λ 噬菌体 DNA 如何改造才能用作基因工程中的克隆载体? 答:野生型λ 噬菌体 DNA 必须经过改造才能适用于基因工程中运载体的目的。改造主要集中在两方面:(1) 消除多余的限制性内切酶位点;(2) 去除λ DNA 中一些非必要区段。经改造后构建而成的λ DNA 载体可以分为 两类:①插入型载体, 如λ gt 系列载体;②替换型载体, 如 Charon 系列载体和 EMBL 系列载体。这些载体及其 衍生载体已在基因工程中得到广泛的应用。

第三章 微生物的生长繁殖及其控制
1. 细菌/酵母菌等单细胞微生物群体生长的典型曲线分哪几个阶段?各个阶段有何特点? 答案要点:根据细菌/酵母菌生长速率常数的不同,一般可把细菌的典型生长曲线粗分为延迟期、对数期、

稳定期和衰亡期等四个时期。 各个阶段的特点教材中已有详细论述。答题时注意细菌和酵母菌的不同之处。 2. 微生物生长繁殖需要的营养物质主要有几类?各有何生理功能? 答案要点:微生物生长繁殖需要的营养物质主要有水、碳源、氮源、无机盐和生长因子等五种。 五种营养物质的生理功能如下: (1)水是微生物最基本的组成分。微生物体内和体外的绝大多数营养成分通过水来溶解和吸收,代谢废物 通过水进行排泄。水是细胞质组分,直接参与各种代谢活动。此外水的比热高,传热快,有利于调节细胞温度和 保持环境温度的稳定。 (2)碳源物质通过微生物的分解利用,不仅为菌体本身的合成提供碳架来源,还可为生命活动提供能量, 碳源往往也可作能源。碳源物质还是微生物细胞物质及其代谢产物的重要组成部分。 (3)氮源物质为菌体本身的合成代谢提供氮素来源,还可为极少数微生物的生命活动提供能量。氮源物质 是微生物细胞物质及其代谢产物的重要组成部分。 (4)无机盐为微生物生长提供必需的矿质元素。矿质元素参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性,维 持细胞结构的稳定性,调节细胞渗透压,控制细胞的氧化还原电位,有时可作某些微生物生长的能源物质。 (5)绝大多数生长因子以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应。 3. 分析营养肉汤琼脂培养基、察氏液体培养基中碳源、氮源、矿物质和生长因子的来源。 答案要点:营养肉汤琼脂培养基配方:蛋白胨 10g,牛肉膏 3g,氯化钠 5g,琼脂 15~20g,水 1000ml。其 中:碳源为蛋白胨;氮源为牛肉膏;矿物质来自氯化钠;生长因子的来源为蛋白胨和牛肉膏。 察氏培养基配方:蔗糖 30g,K2HPO4 1g,MgSO4?7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,KCl 0.5g,NaNO3 3g,蒸馏水 1000ml。其中:碳源为蔗糖;氮源为 NaNO3,矿物质来自 K2HPO4、MgSO4?7H2O、FeSO4、KCl、NaNO3。由于 是合成培养基,所以培养基中无生长因子。 4. 高温灭菌的方法有那些?适用范围如何? 答案要点:高温灭菌的方法从大类上分为干热灭菌法和湿热灭菌法。主要的灭菌方法和适用范围如下: (1)干热空气灭菌法:采用烘箱加热的方法可对金属制品或清洁玻璃、陶瓷器皿进行灭菌。 (2)灼烧灭菌法能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。 (3)巴氏消毒法可用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体的消毒。 (4)煮沸消毒法 一般用于饮用水的消毒。 (5)间歇灭菌法适用于不耐热培养基的灭菌。 (6)常规加压灭菌法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料 的灭菌。 连续加压灭菌法在大规模的发酵工厂用作培养基的灭菌。 5. 简述消毒剂杀死微生物的原理。 答案要点:消毒剂杀死微生物的原理包括:

(1)改变细胞膜的渗透性或损害细胞膜,影响正常的物质交换,损伤细胞。 (2)氧化作用,可使细胞物质如酶氧化,使细胞物质失去活性。 (3)改变原生质的胶体性质,使菌体蛋白质、核酸发生沉淀、变性或凝固。 6. 乙醇、新洁尔灭为什么可做消毒剂? 答案要点:70%~75%的乙醇可作为消毒剂。因为乙醇可使微生物中的蛋白质变性,还能溶解类脂,损伤细 胞膜,又能使细胞脱水,从而造成细胞的死亡。 0.05%?0.1%新洁尔灭能使微生物的蛋白质变性,还能破坏细胞膜,从而杀灭微生物,因此可作为消毒剂。 7. 温度、pH 对微生物的生长繁殖有何影响? 答案要点:温度对微生物的影响包括高温杀菌、适宜的温度培养微生物、低温降低微生物的代谢活性。 培养基或环境中的 pH 值与微生物的生命活动有着密切的联系。因为环境的 pH 值会影响到细胞膜所带的电 荷,从而引起细胞对营养物质的吸收状况的变化。pH 值还可以通过改变培养基中有机化合物的离子化作用程度 而对细胞施加间接的影响(多数非离子状态化合物比离子状态化合物更容易渗入细胞) ,改变某些化合物分子进 入细胞的状况,从而促进或抑制微生物的生长。 8. 培养微生物的主要条件包括什么? 答案要点: (1)适宜的营养条件; (2)适当的外界环境; (3)消除其他微生物的干扰。 9. 列表比较灭菌、消毒和防腐的异同,并举例说明。 答案要点:灭菌、消毒与防腐均为控制微生物生长繁殖的方法,但程度不同。举例包括:发酵灭菌、医学消 毒和食品防腐。 10. 11. 简述控制微生物生长繁殖的方法及其原理。 答案要点:同 9。

如何分离到能利用甲苯为碳源和能源的细菌纯培养物? 答案要点:培养基的设计中以甲苯为唯一碳源,适当考虑添加真菌抑制剂。如果结合微生物的分离与筛选部

分答题,则更佳。 12. 为什么微生物的营养类型多种多样,而动物、植物的营养类型相对单一? 答案要点:从营养物质的利用方面考虑,重点考虑碳源;结合微生物容易变异的特点答题更好。 13. 怎样制备培养基?培养基制备过程中怎样满足微生物对营养物质、pH 和无菌等方面的要求? 答案要点:实验室中经过下列步骤可配制出培养基。①计算称量;②加水溶解;③调节 pH;④过滤分装; ⑤放塞包扎;⑥加压灭菌。 培养基制备过程中要严格按照配方配制,注意各种营养物质的加入次序,防止沉淀产生和营养成分的破坏, 可满足微生物对营养物质的要求。培养基需要调整到适宜的 pH 值,并尽可能采用具有一定缓冲作用的物质,如 天然物质等,从而有利于微生物的培养。另外,还要采用适当的方法杀菌,防止其他微生物的干扰。

第四章 工业微生物学基本实验技术
1. 用光学显微镜观察细菌时, 为什么一般都需要先将细菌进行染色? 制作细菌染色标本片时,为什么必须 先对涂在载玻片上的细菌样品进行固定? 固定时应注意什么问题?

答: 由于细菌细胞小且无色透明, 直接用光学显微镜观察时, 菌体和背景反差很小, 难以看清细菌的形态, 更 不易识别某些细胞结构, 因此,一般都需要先将细菌进行染色, 借助于颜色的反衬作用, 以提高观察样品不同部 位的反差, 能更清楚地进行观察和研究。 此外, 某些染色法还可用于鉴别不同类群的细菌, 故细菌的染色是工业 微生物学实验中重要的基本技术。 染色前必须先对涂在载玻片上的细菌样品进行固定,固定的作用一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上, 一是 增加菌体对染料的亲和力。 一般常用酒精灯火焰加热固定的方法,但应注意防止细胞膨胀和收缩,尽量保持细 胞原形。

2. 革兰氏染色法包括哪几个基本步骤? 你认为影响革兰氏染色结果正确性的关键环节是什么? 答:革兰氏染色法的基本步骤是: 先用初染剂草酸铵结晶紫进行初染, 再用媒染剂碘液媒染,然后用脱色剂乙 醇处理, 最后用复染剂石炭酸复红或番红进行复染。经此法染色后, 若细菌不被酒精脱色,能保持结晶紫与碘的 复合物而呈现蓝紫色,则该菌称为革兰氏阳性细菌(G+);反之,若细菌能被酒精脱色,而被复红或番红复染成红 色, 则称之为革兰氏阴性细菌(G-)。被普遍采用的经 Hucker 氏改良的革兰氏染色法, 其操作步骤为:制片 → 初 染 → 媒染 → 脱色 → 复染 → 干燥 → 观察。 影响革兰氏染色结果正确性的关键环节是用脱色剂乙醇处理, 为了保证革兰氏染色结果的正确性, 必须控制 乙醇脱色时间, 尽量采用规范的染色方法。

3. 放线菌、酵母菌和霉菌显微标本片的制作分别可采用哪些方法? 各有什么特点? 答:放线菌与细菌的单染色一样,可用石炭酸复红或吕氏美兰等染料着色后,在显微镜下观察其形态。但为 了观察放线菌在自然生长状态下的形态特征, 可应用各种培养、制片和观察方法, 其中印片法、插片法和玻璃纸 法是三种常用的方法。 观察酵母菌形态可制备水浸片,若加入一滴美兰染色液,还可区别死活细胞(呈兰色的为死细胞,无色的为 活细胞), 这是因为活细胞具有较强的还原能力,能使无毒性的美蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型。 霉菌具有复杂分枝的菌丝体, 分基内菌丝和气生菌丝。由气生菌丝分化产生繁殖菌丝, 再由繁殖菌丝产生孢 子。霉菌菌丝较粗大,制片时容易收缩变形,孢子也容易分散。为了得到清晰、完整、保持自然状态的标本片, 常用载片培养法和玻璃纸培养法进行制片观察。

4. 简述透射电镜微生物样品的制备方法与操作步骤。 答:透射电镜采用覆盖有支持膜的载网来承载被观察的微生物样品。最常用的载网是铜网,而支持膜可用塑 料膜(如火棉胶膜、聚乙烯甲醛膜等),也可用碳膜或金属膜。透射电镜样品制备技术主要有下列三种:① 负染 技术;② 投影技术;③ 超薄切片技术。 透射电镜的微生物样品的简单制备步骤为: 处理金属载网 → 制备支持膜 → 转移支持膜到载网上 → 制备 微生物电镜样品。

5. 何谓微生物的纯培养技术?主要包括哪些技术内容? 答:在微生物学中,通常只有纯培养物才能被较好地进行研究、利用和重复其结果;在工业发酵生产中,绝 大多数情况下也只有采用纯培养物, 才能实施正常运作和具有实用价值。因此, 把特定的单一微生物从自然界 (或含菌样品) 以混杂存在的状态中分离出来、经纯化、转接、繁殖、并以纯培养物的形式保藏下来等一系列操 作技术, 称之为纯培养技术。它是进行微生物学研究和工业发酵生产最基本的技术。 纯培养技术主要包括:培养基的配制与灭菌技术、无菌操作技术、工业微生物分离与纯化技术、厌氧微生物 纯培养技术、工业微生物菌种保藏技术等。

6. 试述一般培养基的配制方法和操作步骤。高压蒸汽灭菌和干热灭菌的操作方法怎样?应注意哪些事项? 答:一般培养基的配制方法如下 (各种天然培养基的配制方法略有不同): l. 按照配方的组分及用量先分别 称量并配成液体;2. 根据要求调到一定的酸碱度(pH 值);3. 若要制成固体则加入 2%琼脂并加热融化;4. 根据 需要的数量分装入试管或三角瓶中, 加上棉塞或盖上纱布; 5. 包扎好灭菌后备用。 配制斜面培养基为例,一般操作步骤为:称量 → 溶解 → 调 pH 值 → 加琼脂 → 过滤 → 分装 → 加 棉塞 → 包扎 → 灭菌 → 摆斜面 → 无菌检查。 高压蒸汽灭菌法 一般培养基、无菌水、耐热药物及玻璃器皿等常采用高压蒸汽灭菌法。该法的优点是时间 短, 灭菌效果好。它可以杀灭所有的微生物, 包括最耐热的细菌芽孢及其它休眠体。 一般培养基常用 0.1MPa (1 kg/cm2 或 15 Ib/in2 ), 约 120℃维持 15~20 分钟, 便可达到彻底灭菌的目的; 单独 玻璃器皿灭菌的温度可高些, 维持的时间可长些。灭菌的温度及维持的时间, 应随灭菌物品的性质和容量多少而 灵活掌握。 要注意灭菌的因素是高温而不是高压, 故灭菌锅内的冷空气要彻底排除 (在排除冷空气的条件下, 蒸汽压与 温度之间有一定关系),否则, 压力虽达到 0.1Mpa (l kg/cm2 ), 但温度并没有达到要求。 干热灭菌法 常用玻璃器皿(培养皿、三角烧瓶、试管、吸管等)、金属器皿及其它干燥耐热物品, 烘干后经

适当包扎(勿装液体), 可采用干热灭菌法。干热灭菌一般在电烘箱内利用干热空气灭菌。 该法比湿热灭菌法所需的温度要高些 (160~170℃), 时间也要长些 (1~2 h)。但灭菌温度若超过 180℃, 包 扎器皿的纸或棉塞就容易烧焦。

7. 为什么微生物菌种移接的所有操作, 均应在无菌环境下进行严格的无菌操作? 什么是无菌的环境条 件? 什么是无菌操作技术? 答: 微生物无处不在, 无孔不入, 因此, 在对微生物的研究和应用过程中, 必须随时注意保持微生物纯培养物 的纯洁性, 防止乃至杀灭其他微生物(杂菌)的混入;在进行分离、转接及培养微生物纯培养物时, 要采用严格的 无菌操作技术, 防止被其他微生物所污染。 在微生物学研究中, 常需用接种环把微生物纯培养物, 由一个器皿移接到另一个培养容器中进行培养。由于 周围环境(主要是空气)中, 存在着大量肉眼无法发现的各种微生物, 只要一打开器皿,就可能会引起器皿内的培 养基或培养物, 被环境中其他微生物所污染。此外,实验室人员与所试验的微生物,应保证没有或最少直接接触 或气雾接触。因此, 微生物菌种移接的所有操作, 均应在无菌环境下进行严格的无菌操作。 无菌环境是指在无菌室、无菌箱、超净工作室或超净工作台等无菌或相对无菌的环境条件下进行操作。 无菌操作技术的要点是要充分利用酒精灯焰周围的高温区(无菌区), 即接种时, 管口和瓶口始终保持在火焰 (如酒精灯焰)旁边, 进行熟练的移接种操作, 以便保证微生物的纯种培养。此外,挑取和移接微生物纯培养物用 的接种环及接种针, 应采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备, 使用时用火焰灼烧灭菌;转移液体纯培 养物时, 应采用无菌吸管或无菌移液枪。

8.常用的微生物分离纯化方法有哪些? 这些方法各有什么优缺点? 答:常用的微生物分离纯化方法有:稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、 液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设备, 分离 纯化效果好 稀释混合倒平板法有两个缺点,一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成 的菌落微小难于挑取;一是在倾入熔化琼脂培养基时,若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌,过低则会引起琼 脂太快凝固, 不能充分混匀。

在微生物学研究中, 更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。另一种简单快速有效的涂布平板法, 为玻璃 涂棒连续涂布分离法。 平板划线分离法的特点是简便快速, 但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的, 需再重复划线 1~2 次, 并结 合显微镜检测个体形态特征, 才可获得真正的纯培养物。

9. 厌氧微生物常用哪些纯培养技术? 简述厌氧手套箱培养法的原理和操作过程。 答:目前, 已发展了很多厌氧微生物培养技术, 有化学方法、物理方法、物理与化学相结合的方法,如真空 干燥器化学吸氧法、厌氧罐培养法、厌氧手套箱培养法、厌氧发生袋培养法、庖肉培养基法、亨盖特氏(Hungate) 厌氧技术等。 厌氧手套箱是利用通入的氢气, 在箱内黑色钯粒的催化下, 与氧结合生成水的反应, 达到除去箱内氧的目 的。厌氧箱可分为操作室和交换室两部分。 操作室用于进行厌氧操作, 前面有一对供操作用的套袖及胶皮手套。操作室内的常温钯粒和干燥剂用钢丝网 分别装着, 并与电风扇组装在一起, 不断除去操作室内的氧及所形成的水分。操作室内还备有接种针和用于接种 针灭菌的电热器, 有的还安装有培养箱。 交换室是用于室外物品的放入和室内物品的取出。 交换室又与真空泵及混合气钢瓶相连。 混合气体体积分数 一般为 10 % CO2 、5 %~10 % H2 和 80 %~85 %高纯 N2 。 以平板法分离双歧杆菌的纯培养为例, 厌氧手套箱的操作过程:厌氧箱的准备 → 培养物的准备 → 换混合 气培养 → 观察挑取菌落。

10. 微生物菌种长期保藏根据什么基本原理? 常用哪些保藏菌种的方法? 这些方法各有什么优缺点? 答:微生物菌种保藏共同的基本原理是:使微生物的新陈代谢处于最低或几乎停止的状态, 因而极少或不发 生变异;保藏方法通常都是基于温度、水分、氧气、营养成分和渗透压等方面考虑;保藏条件都是人工方法创造 的低温、干燥、缺氧环境。 目前,已建立了许多种长期保藏菌种的方法, 包括:斜面冰箱保藏法、穿刺法、液体石蜡保藏法、沙土管保 藏法、滤纸法、甘油低温保藏法、冷冻干燥保藏法、低温法、液氮超低温保藏法等。 斜面冰箱保藏法操作简单、使用方便, 但保藏时间短、容易被污染;液体石蜡保藏法制作简单, 不需经常移 种, 实用且效果较好; 沙土管保藏法操作通常比较简单, 效果较好, 可保存几年时间, 广泛应用于抗生素工业的 生产菌种保藏中, 但不能用于保藏营养细胞;甘油低温保藏法简单易行,保藏时间可达 1 年至几年;冷冻干燥保 藏法综合利用了各种有利于菌种保藏的因素(低温、干燥和缺氧等) ,是目前最有效的菌种保藏方法之一; 液氮 超低温保藏法比其他任何保藏方法都要优越, 被世界公认为防止菌种退化的最有效方法, 适用于各种微生物菌种 的保藏。

11. 了解并熟悉不同工业微生物的生理与发酵试验技术有什么实用意义? 如何进行微生物对碳源和氮源的 利用试验? 厌氧的酵母菌酒精发酵试验与好氧的短杆菌谷氨酸发酵试验有什么不同?

答: 了解不同工业微生物的生理特性, 并熟悉其生理与发酵试验技术。 使人们能利用这些不同的生理特性, 作 为不同微生物分类鉴定和菌种选育的依据;利用它们的多种发酵类型和代谢产物, 更有效地为发酵工业作贡献。 碳源的利用试验: 糖类发酵试验 (1) 绝大多数细菌和酵母菌都能利用糖类作为碳源和能源,但它们在分解糖

类物质的能力上有很大差异,糖类发酵试验主要是试验多种糖类能否被利用作为碳源或能源。 (2) 淀粉水解试 验 淀粉酶能水解淀粉成为小分子的糊精、双糖和单糖, 此过程可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。淀

粉遇碘液会产生蓝色反应, 但细菌水解淀粉后的周围区域, 用碘测定不再显示蓝色, 使平板上的菌落周围出现透

明圈, 表明该细菌能产生淀粉酶, 以此鉴别不同细菌。 (3) 脂肪水解试验 脂肪也是碳源之一。 微生物对大分子 的脂肪不能直接利用, 必须依赖其胞外产生的脂肪酶, 将脂肪分解成小分子的甘油和脂肪酸, 才能被微生物所吸 收利用。脂肪被脂肪酶水解后产生的脂肪酸, 可改变培养基的 pH.,使 pH 降低。加入培养基的中性红指示剂, 会 使培养基从淡红色变为深红色, 说明微生物胞外能产生脂肪酶。 氮源的利用试验:工业微生物对于氮源的利用, 主要是看其对蛋白质、蛋白胨、氨基酸、铵盐和硝酸盐的利 用能力, 例如:(1)酵母菌对氮源利用试验; (2)明胶液化试验;(3)石蕊牛奶试验;(4)尿素分解试验;(5)硝酸 盐还原试验。 酒精发酵试验是在无氧条件下, 某些酵母菌(如酿酒酵母)能把己糖转化为酒精和二氧化碳的作用, 称为酒精 发酵。酵母菌由于其种类不同, 酒精发酵力的强弱也不同, 工业生产上必须采用酒精发酵过程中所生成的二氧化 碳和酒精的量, 以及计算其发酵度来测定不同酵母菌种的发酵力。 谷氨酸发酵试验是在有氧条件下,谷氨酸短杆菌在各种酶系的作用下, 葡萄糖经己糖酵解、 单磷酸己糖、 三羧 酸循环和乙醛酸循环等途径生物合成谷氨酸。因此,谷氨酸发酵是好氧性发酵。谷氨酸短杆菌是生物素营养缺陷 型,当培养基中含有充足的生物素时,菌体大量生长,但不积累谷氨酸产物,因此,发酵培养基中的生物素要控 制在一个亚适量的水平 (除非采用特殊的发酵工艺)。

12. 在科研和工业发酵生产实践中,最常用的微生物检测项目主要有哪些? 各有什么实际意义?试举例说 明之。 答:在科研工作和生产实践中,最常用的微生物检测项目是细胞数或生长量的测定。例如, 在酒精、啤酒 和白酒等的成熟酒母在镜检时, 除了要求菌体细胞饱满肥大、细胞质均匀、空泡小、出芽率高外, 还要求酵母细 胞数每毫升达到 l 亿个以上, 以此作为酵母菌繁殖能力和培养成熟的指标;又例如,在谷氨酸发酵生产中,每间 隔 2~4 h,就要取样用光电比浊法测定发酵液的光密度(OD),以此作为短杆菌增殖数量的指标, 有助于指导发酵 过程的工艺控制。

13. 简述水和食品中细菌菌落总数的测定程序。 多管发酵法测定水与食品中大肠菌群数的操作过程有何异 同? 答:细菌菌落总数是指水或食品检样经处理, 在肉汁营养琼脂培养基中, 于 37℃经 24 h 培养后, l ml 或 l g 检样中所生长的嗜中温需氧性细菌菌落总数。 一般都采用平板菌落计数法进行测定。 它主要作为判定水和食品被 污染程度的标志, 也可应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态, 以便对被检样品进行卫生学评价时提供依 据。 水和食品中细菌菌落总数的测定与前面的平板菌落计数法测定活菌数, 在原理和方法上基本是相同的。其测 定过程如下: 培养基的制备 → 检样的采取 → 检样的稀释 → 倾注平板及培养 → 菌落总数的计算 → 菌落总 数的报告。 食品中大肠菌群数是以每 100 毫升(克)检样中大肠菌群最可能数(MPN)表示的。 多管发酵法检测食品中大肠 菌群数的操作过程为:培养基的制备 → 食品检样稀释 → 乳糖初发酵试验 → 平板分离培养 → 证实试验 → 报告 MPN。

14. 噬菌体的检查根据什么原理? 试述单层琼脂平板法检查噬菌体和双层琼脂平板法测定噬菌体效价的方 法及操作过程。 答:噬菌体侵染敏感寄主细胞后, 释放出子代噬菌体, 通过琼脂再扩散到周围的细胞中, 继续侵染引起更多 细胞裂解, 从而在平板上形成一个个肉眼可见的透亮无菌近圆形的空斑, 称为噬菌斑, 它是噬菌体存在的一种特 性标志, 由此检出噬菌体的存在。

单层琼脂法 将指示菌液和经适当稀释的噬检液与单层培养基一起倾注平板。 充分混匀并凝固后, 置适温下 培养约 12 h,观察计数。此法较简便,可用于噬菌体的效价测定。但若培养基较厚易产生上下噬菌斑重叠现象, 影响计数的准确性。 双层琼脂法 一般采用的效价测定方法。 双层琼脂法是先用含 2%琼脂的固体培养基倾注底层平板,再在 其上倾注一薄层半固体上层培养基,上层培养基事先已与对数期指示菌液和噬检液混合均匀。经适温培养后,便 可观察计数。 此法的优点是所形成的全部噬菌斑基本处于同一平面上,因而各斑大小均匀,边缘清晰易见,不发生上下噬 菌斑重叠现象。此外,因上层半固体培养基较稀,使形成的噬菌斑较大,也有利于计数。因此,该法是一种被普 遍采用并能精确测定效价的方法。

单层琼脂法噬检操作过程

双层琼脂法测定噬菌体效价操作过程

第五章

微生物的代谢调节与控制

1. 什么叫生物氧化?微生物的生物氧化有哪 3 种方式?各有什么特点? 答:生物氧化 (biological oxidation) 就是发生在活细胞内的一系列产能性氧化反应的总和。生物氧化不同于 普通的氧化反应。首先,它们是由一系列酶在温和的条件下按一定次序催化的多步式梯级反应;第二,生物氧化 反应放能是分段逐级进行的;第三,生物氧化反应中释出的能量一部分以化学能的形式储藏在 ATP 分子等能量 载体内。 根据微生物进行生物氧化时有无外界的最终电子受体, 可以把微生物生物氧化分为呼吸和发酵两大类。 没有

任何外源的最终电子受体的生物氧化类型称为发酵, 有外源的最终电子受体的生物氧化类型称为呼吸。 再根据外 源最终电子受体是不是分子氧,又可以把呼吸分为有氧呼吸和无氧呼吸。 有氧呼吸是一种最普遍又最重要的生物氧化或产能方式, 其特点是底物脱下的氢经完整的呼吸链传递, 最终 被外源分子氧接受,产生了水并释放出 ATP 形式的能量。这是一种递氢和受氢都必须在有氧条件下完成的生物 氧化作用,是一种高效产能方式。 无氧呼吸指一类呼吸链末端的氢受体为 O2 以外的外源氧化物。这是一类在无氧条件下进行的、产能效率较 低的特殊呼吸。其特点是底物脱氢后,经部分呼吸链递氢,最终由氧化态的无机物或有机物受氢,并完成氧化磷 酸化产能反应。 发酵是指在无氧等外源氢受体的条件下,底物脱氢后所产生的还原力[H]未经呼吸链传递而直接交某一内源 中间代谢物接受,以实现底物水平磷酸化产能的一类生物氧化反应。其特点是以有机化合物作为电子供体(被氧 化)和电子受体(被还原) ,电子的传递不经过细胞色素等中间电子递体,直接由电子供体交给电子受体,因此 可以看作是分子内的转移。这种氧化作用不彻底,最终形成还原性产物,只放出一部分化学能,而大部分能量仍 储存在还原性产物中。 2. 试述异氧微生物对糖降解途径的多样性及其生理机能。 答:工业上使用的微生物绝大多数属化能异氧型,以糖类作为最重要和最普遍的碳源和能源。糖类作为氧化 基质, 通过各种降解方式形成构建菌体成分的中间代谢物, 同时伴以能量的产生。 微生物降解葡萄糖的方式很多, 远比高等生物复杂,其降解途径及最终产物因微生物种类和发酵条件而异,主要有下列方式: (1)EMP 途径 EMP 途径是多种微生物所具有的代谢途径,其产能效率虽低,但生理功能极其重要:①供应 ATP 形式的能 量和 NADH2 形式的还原力,厌氧微生物是以此途径作为获得能量的唯一方式;②是连接其它几个重要代谢途径 的桥梁,包括三羧酸循环(TCA) 、HMP 途径和 ED 途径等;③为生物合成提供多种中间代谢物;④通过逆向反 应可进行多糖合成。若从 EMP 途径与人类生产实践的关系来看,则它与乙醇、乳酸、甘油、丙酮和丁醇等的发 酵生产关系密切。 (2)HMP 途径 HMP 途径在微生物生命活动中意义重大,主要有: ①供应 5-磷酸核糖,以合成嘌呤和嘧啶核苷酸,最后合成核酸、辅酶等; + + ②提供大量的还原力 NADPH+H ,除了部分被转氢酶催化变为 NADH+H ,再进入呼吸链氧化,可生成 大量的 ATP 外,主要还是作为细胞合成脂肪酸、胆固醇、谷氨酸等需氢的一种重要来源; ③途径中的 4-磷酸赤藓糖是合成芳香族氨基酸的前体; ④磷酸戊糖循环的功能对于光能和化能自养菌具有重要作用,这两类微生物细胞中的含碳成分都是由 CO2 和 1,5-二磷酸核酮糖缩合而成,而后者是由 5-磷酸核糖转变而来; ⑤生成的 6-磷酸果糖、3-磷酸甘油醛等可进入 EMP 途径,进而代谢为丙酮酸,这样 HMP 途径与 EMP 途径相联系。 (3)ED 途径 ED 途径是少数 EMP 途径不完整的细菌所特有的利用葡萄糖的替代途径。由于它可与 EMP 途径、HMP 途 径和 TCA 循环等代谢途径相联,故可相互协调,满足微生物对能量、还原力和不同中间代谢产物的需要。所以 ED 途径也是微生物的一条重要代谢途径,广泛分布在细菌尤其是革兰氏阴性菌中。 (4)PK 途径 除了常见的 EMP 途径、HMP 途径和 ED 途径外,尚有两个磷酸酮缩酶途径(phosphoketolase pathway,简称 PK 途径)是少数细菌所有的,例如异型乳酸发酵的乳酸杆菌、双叉乳杆菌和双歧杆菌等,因为该途径的部分与 HMP 途径相同,所以可认为是 HMP 途径的分叉。 3. 何谓组成酶、诱导酶?诱导酶是如何被诱导合成的? 答: 微生物体内参与代谢活动的酶, 有些是细胞所固有的, 经常存在于细胞内, 以恒定速度和恒定数量生成, 不随微生物的代谢状态而变化,这一类酶称为组成酶(constitutive enzymes) ;而另一些酶,在一般情况下细 胞内不生成或数量很少,这些酶只有在底物或其结构类似物存在时才生成,这一类酶被称为诱导酶(induced enzymes) ,引起酶生成的化合物叫诱导物。 酶的诱导可以用 Jacob 和 Monod 提出的操纵子模型(Operon Model)来解释,例如大肠杆菌乳糖操纵子包括 三个结构基因 z、y、a(相应编码β -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷透性酶和β -半乳糖苷转乙酰酶)和结构基因前 面的操纵基因(O)和启动子(P) ,这三种酶都能被乳糖或β -半乳糖苷系列化合物所诱导。其作用机制是:当不

存在诱导物时,由调节基因所合成的阻遏物附着在操纵子“O”的部位,此时从启动子部位开始的由 RNA 聚合酶 合成 mRNA 的活动受到了阻遏,酶就无法生成。如果有诱导物质存在,阻遏物与诱导物质相结合失去了阻遏活性, 此时与操纵基因相结合的部位就被解除了,从而能进行 mRNA 的合成,此时酶即可产生。 4. 图示并解释乳糖操纵子的作用机制。 答:如下图所示,大肠杆菌乳糖操纵子包括三个结构基因 z、y、a(相应编码β -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷 透性酶和β -半乳糖苷转乙酰酶)和结构基因前面的操纵基因(O)和启动子(P) ,这三种酶都能被乳糖或β -半 乳糖苷系列化合物所诱导。其作用机制是:当不存在诱导物时,由调节基因所合成的阻遏物附着在操纵子“O” 的部位,此时从启动子部位开始的由 RNA 聚合酶合成 mRNA 的活动受到了阻遏,酶就无法生成。如果有诱导物质 存在,阻遏物与诱导物质相结合失去了阻遏活性,此时与操纵基因相结合的部位就被解除了,从而能进行 mRNA 的合成,此时酶即可产生。此外,cAMP 以及 CRP(cAMP receptor protein)都参与乳糖操纵子的调控,当 cAMP 和 CRP 相结合附着在启动子上游部位时,就能促进从启动子部位开始的 RNA 聚合酶的活动。 诱导酶的合成机制,其本质就是解阻遏(诱导物解除了阻遏蛋白对操纵基因的阻塞) 。值得注意的是,这种 诱导物与阻遏蛋白的结合是可逆的,结合或解除结合取决于细胞内效应物的浓度。正因为结合是可逆的,所有调 节可以双向进行。

5. 何谓分解代谢物阻遏?当大肠杆菌培养于含有葡萄糖和乳糖的培养基中时,会出现怎样的生长现象?为 什么? 答:分解代谢物阻遏(Catabolite repression)简称分解阻遏,在微生物代谢中普遍存在,即微生物在含 有能分解的两种底物的培养基中生长时, 首先分解快速利用的碳、 氮源底物, 而不分解慢速利用的碳、 氮源底物。 是微生物在长期进化过程中形成的一种重要代谢调节方式。当大肠杆菌培养于含有葡萄糖和乳糖的培养基中时, 会出现了二次生长(diauxie)现象。即在第一阶段快速生长,大肠杆菌优先利用葡萄糖作为能源和碳源,当葡 萄糖消耗完毕,细菌生长速度出现了一个下降的间隙(大约几分钟) ,然后又慢慢回升为第二阶段,此时它改用 乳糖作能源和碳源,生长速度比第一阶段稍慢一些。 从细胞的分析发现,在第一生长阶段中,细胞内的β -半乳糖苷酶活性很低。由此可见,细菌在利用葡萄糖 时,乳糖操纵子的表达受限制;当葡萄糖耗尽时,生长明显下降,几分钟后,细菌开始利用乳糖生长,此时测得 的β -半乳糖苷酶活性要比第一阶段高得多。当时把这种葡萄糖干扰其他碳源利用的现象称为“葡萄糖效应” 。随 后的研究表明:葡萄糖效应并非由葡萄糖直接造成,而是其某种分解代谢产物所引起的。葡萄糖分解的某种产物 阻遏了能够产生该物质的酶的合成,例如产气杆菌的组氨酸裂解酶将组氨酸分解为α -酮戊二酸和氨,而葡萄糖 也可以降解为α -酮戊二酸,故能阻遏组氨酸裂解酶的合成。如果某种酶的作用产物没有与葡萄糖(或其它快速 利用碳源) 分解中间产物相同的物质, 便不发生葡萄糖效应。 随着分子生物学的发展, 对其分子机制的阐明, 1961 年的一次生物学会议上正式定名为“分解代谢物阻遏”这个术语来代替“葡萄糖效应”这一俗称。 6. 酶活性调节与酶合成调节有何区别?它们之间又有何联系? 答:在代谢途径中,酶量的调节是在转录水平上阻遏或诱导酶的合成,这是通过调节基因活动的结果,是微 生物不通过基因突变而适应于环境变化的一种措施, 这种措施对于环境变化的反应比较迟缓。 当环境存在过量的 某一终产物时, 虽然通过反馈阻遏作用可使合成这一终产物所需要的一系列酶都停止合成, 但对细胞中早已存在

的酶没有作用,终产物还在继续合成,只有当已存在的酶降解后才能停止催化反应。 酶活性的调节是当某一终产物过量时, 反馈抑制合成该终产物的关键酶 (一般为途径中第一个酶或第二个酶) 的活性,使酶暂时失活,待终产物浓度降低后,酶的活性又重新恢复,反应继续进行。由于反馈抑制不涉及蛋白 质的合成过程,这种调节比较直接、迅速和灵活。而反馈阻遏是对酶合成的阻碍,所以效果就不如反馈抑制那样 迅速。 由此可见,酶量调节虽然见效慢,但可节约生物合成的原料和能量,这对生物体来说是必需的。当酶量调节 与酶活性调节两者共存时,就能获得最大调节效果。前者称为粗调,后者称为细调。在分支途径的多酶体系中, 代谢调节通过许多不同系统联合进行,互相配合,使酶的活性随环境所需而增强或减弱,使代谢作用得以和谐地 进行。 7. 解释组成型突变、抗分解阻遏突变、抗反馈调节突变、营养缺陷突变、渗漏突变、条件致死突变的定义 及其选育方法原理,它们能过量积累某代谢产物的机制。 答:没有诱导物时仍能正常地合成诱导酶的突变体叫组成型突变体。酶合成对诱导物依赖性的消除,可能发 生在调节基因的突变,不能合成有活性的阻遏蛋白;或是操纵基因的突变使它失去与阻遏蛋白结合的能力。组成 型突变体的筛选方法有多种,一方法是在恒化器中加入限量浓度的基质诱导物,可选择出不再需要β -半乳糖苷 诱导物而产生高浓度的β -半乳糖苷酶的大肠杆菌突变体。另一方法是将经受诱变的细胞接种在含有非诱导物的 基质作为唯一碳源(或氮源)的琼脂平板上,只有组成型突变体才可以在此条件下生长。例如,在乙硫氨酸中分 离出的突变体可使硫醚合成酶(蛋氨酸合成中的一种酶)含量增加 120 倍。 葡萄糖为廉价原料易被微生物利用吸收,所以在发酵生产上是常用原料。葡萄糖和其它碳源同时存在时,细 菌通常只利用葡萄糖而不利用其它碳源,显示出分解产物阻遏。在这种情况下,只有解除分解产物阻遏,才能合 成利用其它碳源的有关酶, 有时通过改变培养条件达到除去分解产物阻遏的目的, 但是若采用抗分解产物阻遏的 突变菌株则更加有效,因为它可明显地改变葡萄糖分解途径,致使缓慢地利用葡萄糖,并使整个酶体系去阻遏。 选育抗分解阻遏突变体的一种方法是选择在含受分解阻遏的酶的基质作为唯一氮源,在琼脂平板上生长的菌落。 例如, 葡萄糖-脯氨酸琼脂就可用来选择鼠伤寒沙门氏菌的这种突变体。 因为脯氨酸氧化酶一般受葡萄糖的阻遏, 野生型细胞在此培养基上不能生长,只有抗分解阻遏的突变株能够氧化脯氨酸,并从该物质取得氮源。又如铜绿 假单胞菌的酰氨酶的合成受琥珀酸阻遏, 在乳酰胺加琥珀酸盐中一般不能生长, 但抗分解阻遏突变体就可在这种 类型的培养基中生长出来,此突变体可产生占细胞蛋白质 10%的酰胺酶。筛选抗分解阻遏突变体的另一种方法 是用葡萄糖类似物。例如 2-脱氧葡萄糖(2-dG)不被微生物同化也不抑制生长,但有分解阻遏作用,用棉子糖 -2dG、淀粉-2dG 或纤维素-2dG 平板可分别选出蔗糖酶(麦芽糖酶) 、淀粉酶或纤维素酶脱敏的突变体。 微生物生长时常需要一些代谢物,如氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶等化合物用于细胞组分的合成。如果将这 些代谢物的结构类似物,又称为抗代谢物或代谢拮抗物,加入到培养基中,由于它们与代谢物结构类似,能和正 常代谢物竞争性与阻遏物及变构酶结合。 但它们往往不能代替正常代谢物用于合成细胞成分, 它们在细胞中的浓 度不会降低,因此与阻遏物以及变构酶的结合是不可逆的,这就使得有关的酶不可逆地停止合成,或是酶的催化 作用不可逆地被抑制,这就是代谢拮抗物的作用机理。抗代谢物造成的这种假反馈抑制(pseudo-feedback inhibition)使正常细胞不能生长。如果细胞的变构酶基因发生突变,使变构部位不能再与抗代谢物结合,而其 活性部位却不变;或是调节基因发生突变,使调节蛋白(阻遏蛋白)不能再与抗代谢物结合,那么,正常代谢的 终产物不能与结构发生改变的变构酶或阻遏物相结合, 因而在细胞中大量合成终产物时仍能继续不断合成有关的 酶。这类突变表现出对该抗代谢物具有抗性(或称耐药性) ,故又称为抗代谢类似物突变。 营养缺陷型(nutritional mutant)是指原菌株由于发生基因突变,致使合成途径中某一步骤发生缺陷,从 而丧失了合成某些物质的能力, 必须在培养基中外源补加该营养物质才能正常生长的突变型菌株。 在控制所缺陷 营养物的添加量下,就可遗传性地解除终产物的反馈抑制,使得中间产物或另一分支途径的末端产物得以积累。 另外,它还可以起到节省碳源的作用。 渗漏缺陷型(leaky mutant)是一种不完全遗传障碍营养缺陷型,能自己合成微量的某一代谢终产物但达不 到反馈调节的浓度, 所以不会造成反馈抑制而影响中间代谢产物的积累。 与营养缺陷型不同的是不需外源添加所 渗漏缺陷的物质。 条件致死突变(Conditional lethal mutation)是在某些条件下能存活的,而在另一些条件下致死。温度 s 敏感突变型(Tm )就是一个典型的例子,它们在亲代能生长的温度下不能生长,而只能在较低温度下生长。例如 噬菌体 T4 的温度敏感突变型在 25℃时能在 E.coli 宿主上正常生长,形成噬菌斑,但在 42℃时就不能生长。其 原因往往是细胞内某些酶蛋白(如 DNA 聚合酶)的肽链中更换了几个氨基酸,从而大大降低其抗热性的缘故。在 抗生素和酶制剂的工业生产中,为了改良菌株,提高产量,常常不可避免地会丧失菌株的孢子形成能力,造成保

存菌株与传代的困难。此时,可选育使用在高温下丧失孢子形成能力,成为高生产性的温度敏感突变株,在高温 下进行生产,在低温下形成孢子,进行保存与传代。 8. 什么叫次级代谢?次级代谢与初级代谢有何联系? 答:次级代谢是某些微生物在一定生长时期出现的一类代谢,产物有抗生素、酶抑制剂、毒素、甾体化合物 等,与生命活动无关,不参与细胞结构,也不是酶活性必需,但对人类有用。 二者关系:先初后次,初级形成期也是生长期,只有大量生长,才能积累产物。 9. 举例说明次级代谢调控的主要机制。 答:抗生素等次级代谢产物的产生菌,虽然不如大肠杆菌那样具备严密的调节机制,但抗生素合成酶的结构 基因及酶的活性也受到多种方式的调节, 影响着抗生素的产量。 关于抗生素等次级代谢产物生物合成的调节机制, 按作用方式可分为:诱导调节、反馈调节、代谢产物调节、磷酸盐调节、细胞形态分化和生长速率调节和细胞膜 透性调节等。 10. 说明青霉素生物合成及代谢调控机制。 答: (1)青霉素的生物合成与碳源分解代谢产物的关系 青霉素的生物合成受碳分解代谢产物阻遏,如合成青霉素的酰基转移酶就被阻遏。在青霉素发酵过程中,发 现能被青霉菌迅速利用的葡萄糖有利于菌体生长,但抑制青霉素的合成,而被缓慢利用的乳糖,却是产生青霉素 的最好碳源。乳糖是由葡萄糖和半乳糖所组成的双糖,并不是合成青霉素的特殊前体,所以乳糖比葡萄糖优越的 主要原因是乳糖被缓慢水解成单糖的速度正好符合青霉菌生产期合成青霉素的需要, 而不会产生很高浓度的分解 产物来抑制青霉素的合成,因此,碳源多用葡萄糖加乳糖或利用某些非糖质原料如植物油等。在生产期糖质原料 采用间歇补料或连续补料等措施,不论采用哪种措施,首先要用最容易利用的碳源(如葡萄糖等)使菌体生长, 然后到了生产期再陆续少量补加惰性碳源,即利用缓慢的乳糖、植物油等,通过不断补料把微生物维持在半饥饿 状态,控制初级代谢的生物合成,转向次级代谢。总之,碳源的缓慢利用是大量合成青霉素的关键。 (2)青霉素的生物合成与赖氨酸的反馈调节 用产黄青霉菌生产青霉素要受到赖氨酸的阻遏, 这是由于其赖氨酸生物合成途径的初始酶——高柠檬酸合成 酶受到了赖氨酸反馈阻遏。在赖氨酸生物合成途径中,从α -氨基已二酸分枝而产生青霉素,这种赖氨酸阻遏是 初级代谢调节的效果用到次级代谢上的最好例子,

第六章 微生物遗传变异与育种
1.名词解释 基因型/表型:即指某一生物个体所含有的全部基因的总和,是一种内在可能性或潜力。而可以观察的性状称为 表型,指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和,是一种现实存在,是具一定基因型的生物在一定条件 下所表现出的具体性状。 营养缺陷型:野生菌株发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力,在选择培养基( 或 基本培养基)上不生长。 抗性突变型:指野生型菌株发生突变后对物理、化学和生物因素表现出抗性的突变体。如紫外、氨苄青霉素和噬 菌体等的抗性突变体。 条件致死突变型:是指菌株经过突变后在某一条件下具有致死效应,而在另一条件下没有致死效应的突变型。常 用的条件致死突变是温度敏感突变。 回复突变:从突变株回到野生型的过程。 感受态:受体细胞能从周围环境中吸取 DNA 的一种生理状态。 转化:指某些自然或人工感受态的细菌(或其他生物)能通过其细胞膜摄取周围同源或异源的游离 DNA 分子(质粒

和染色体 DNA,并将此外源 DNA 片段通过重组整合到自己染色体组的过程 转导:指以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质重组的过程。它是细菌遗传物质传递和交换的另一种重要方式。 普遍转导:通过温和噬菌体为转导的媒介,将供体菌基因组上任何小片段 DNA 携带到受体细胞中,使后者获 得前者部分遗传性状的现象。 局限转导:部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中,并与受体菌基因组整合、重组,获 得表达的转导现象。 低频转导:一般溶源菌释放的噬菌体所进行的局限性转导,因其只能形成极少数(10-4— 10-6)转导子,故称低 频转导(LFT,low frequency trans-duction) 。主要由于核染色体组进行不正常切离的频率极低,因此在其裂 解物中所含的部分缺陷噬菌体的比例也极低(10-4— 10-6) 。 高频转导:双重溶源菌同时有两种噬菌体整合在细菌染色体上,其中一种为缺陷噬菌体能产生局限性转导;另一 种为正常的噬菌体又称为助体(或辅助)噬菌体(helperphage) ,可以弥补缺陷噬菌体的不足,使之也成为“完 整噬菌体”释放,提高了形成转导子的频率。 转染:用提纯的病毒核酸(DNA 或 RNA)去感染其宿主细胞或其原生质体,可增殖出一群正常病毒后代的现 象。 溶源转变:当正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时,因噬菌体基因整合到宿主的核基因组上,而使 宿主获得了除免疫性外的新遗传性状的现象。 接合:指供体菌( “雄性” )通过性菌毛与受体菌( “雌性” )直接接触,通过 F 质粒或其携带的不同长度的核基 因组片段传递,产生的遗传信息的转移和重组过程。 2.证明核酸是遗传物质基础的实验有几个?实验者是谁?试举其中之一加以说明。 经典转化实验——DNA 作为遗传物:Griffith 和 O.T.Avery 噬菌体感染实验——DNA 是遗传物质:A.D.Hershey 和 M .Chase 植物病毒的重建实验——RNA 是遗传物质:H .Fraenkel-Conrat 3、原核生物(细菌)和真核微生物的基因组的特点? 原核生物(细菌)基因组的特点:遗传信息的连续性、功能相关的结构基因组成操纵子结构、结构基因的单拷贝 及 rRNA 基因的多拷贝和基因组的重复序列少而短。 真核生物(细菌)基因组的特点: (1)真核生物基因组 DNA 与蛋白质结合形成染色体,储存于细胞核内,除配子细胞外,体细胞内的基因组是 双份的(即双倍体,diploid),即有两份同源的基因组。 (2)真核细胞基因转录产物为单顺反子(monocistron),即一个结构基因转录、翻译成一个 mRNA 分子,一条多 肽链。 (3)存在大量重复序列。 (4)基因组中不编码的区域多于编码区域。 (5)基因是不连续的。

(6)基因组远大于原核生物的基因组,具有许多复制起点,而每个复制子的长度较小。 4.什么是质粒?它有哪些特点?主要质粒有几类?各有何理论与实际意义? 质粒是一个复制子(replicon)。 大多数质粒控制着宿主的一种或几种特殊的性状,具有一定表现型,按其表现型不同分为以下几类型:F 因子 (fertility factor) 或称为致育因子或性因子,又称 F 质粒;R 因子(resistance factor)又称抗药性质粒;Col 因 子(Colicinogenic factor)又称为产大肠杆菌素因子;毒性质粒;共生质粒;降解性质粒。 5..什么是影印平板培养法?它有何理论与实际应用 需采用影印平板(Replica plating)的方法进行分离。营养缺陷型的筛选方法如下: (1)将待分离突变株的原始菌株以合适的稀释度涂布到野生型菌株和突变株均能生长的主平板(含完全培养 基)上,经培养后形成单菌落; (2)通过一消毒的―印章‖(直径略小于培养皿底,表面包有丝绒布,使其尽量平整,图 8-9b)将 a 平板的菌落 分别原位转移(或印迹)到 c 平板(含有与 a 平板相同的营养成份)和 d 平板(不含缺陷型所需的营养因子,即基本培 养基); (3)经培养后对照观察 c 和 d 平板上形成的单菌落,如果在 c 平板上长而在 d 平板上不长的,则为所需分 离的突变型; (4)在 d 平板上挑取 c 平板上不长的相应位置的单菌落,并进一步在完全培养基上划线分离纯化。?

6.能否找到一种仅对某一基因具有特异性诱变作用的化学诱变剂?为什么? 否,化学诱变剂主要针对核酸的碱基,而与基因的特异性无关。 7.根据突变修复原理紫外线诱变处理菌种时,应注意什么?如何保证细胞均匀的受到诱变剂的处理? 一般微生物细胞内都具有光复活酶,所以,微生物紫外线诱变育种应在避光或红光条件下操作。 在实际工作中,要得到均匀分散的细胞悬液,通常可用无菌的玻璃珠来打散成团的细胞,然后再用脱脂棉或滤纸 过滤。? 8、紫外诱变、5-溴尿嘧啶诱变的原理? 紫外线诱变机理是它会造成 DNA 链的断裂,或使 DNA 分子内或分子之间发生交联反应。交联是由二聚体引起 的,二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生, 也可以是在二条链的碱基之间形成。 它会引起 DNA 复制错误, 正常的碱基无法配对, 造成错义或缺失。 嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多。 嘧啶的光化产物主要是二聚体和水化物, 已经了解得较清楚的是胸腺嘧啶二聚体。 5-溴尿嘧啶(5-bromouracil,5-BU)它和 T 很相似,仅在第 5 个碳原子上由溴(Br)取代了 T 的甲基。5-BU 有两种异构体,一种是酮式,另一种是烯醇式,它们可分别与 A 及 G 配对结合,这样在 DNA 复制中一旦掺入 5BU 就会引起碱基的转换而产生突变。5-BU 一般以酮式状态存在于 DNA 中,因而与 A 配对。5-BU 很容易进行 酮式与烯醇式结构的互变异构,当 DNA 复制时,烯醇式 5-BU 不与 A 而与 G 配对,从而造成 A:T?G:C 的转 换。 9.诱变育种的基本环节有哪些?关键是什么?何故? 出发菌株的选择: 适合的出发菌株具有特定生产性状的能力或潜力, 即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶 系的基因,有效提高育种工作效率。 制备单孢子(或单细胞)悬液:诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞,并且是均匀状 态的单细胞悬液。 诱变处理:诱变剂的选择、诱变剂量的选择。 10、细菌接合作用机制?比较大肠杆菌的 F 、F 、Hfr 和 F’菌株区别? 指供体菌( “雄性” )通过性菌毛与受体菌( “雌性” )直接接触,通过 F 质粒或其携带的不同长度的核基因组片 段传递,产生的遗传信息的转移和重组过程。 F+(雄性)菌株是指细胞内存在游离的 F 质粒,细胞表面有性菌毛的菌株。 F 雌性菌株是指细胞中没有 F 质粒,细胞表面也无性毛的菌株,与 F 菌株或 F′菌株接合获得 F 质粒或 F′质 粒,并转变成为 F 菌株或 F′菌株。 细胞中 F 质粒从游离态转变成在核染色体组特定位点上的整合态的菌株。Hfr 菌株与 F 菌株的基因重组频率要 比单纯用 F+与 F 接合后的频率高出数百倍而得名。 它的遗传性状介于 F 菌株与 Hfr 菌株之间,是 Hfr 菌株细胞内的 F 质粒因不正常切离而脱离核染色体组时,形 成游离的、带小段染色体基因的环状的特殊 F 质粒,称 F′质粒。
+ - - + — + + -

11、发生转化的条件是什么? (1)供体 DNA 与受体细胞间的接触与互作,受体细胞在生理上处于感受态(competence),能接受外源 DNA 实 现转化。 (2)供体 DNA 的结合与穿入、联会和整合。最后,供体 DNA 的一条单链片段通过重组而整合到受体 DNA 中。 12.解释普遍性转导的机制? 通过温和噬菌体为转导的媒介,将供体菌基因组上任何小片段 DNA 携带到受体细胞中,使后者获得前者部分 遗传性状的现象,称普遍性转导(Generalized transduction) 。少数噬菌体将细菌的 DNA 误认做是它们自己 的 DNA,并以其外壳蛋白将其包围,从而形成转导噬菌体。由于可以转导细菌染色体组的任何不同部分,因此 称为普遍性转导。 噬菌体 DNA 的包装机制:进入供体菌的 P22DNA 经环化(冗余末端之间重组)和滚环复制形成一个多联体 (concatemer)分子。DNA 的包装从基因组的一个特殊位点(pac,package)开始,用噬菌体编码的酶按顺序进行切割, 并以―headful‖的长度进行包装, 如此同时, 该酶也能识别染色体 DNA 上类似 pac 的位点并进行切割, 以―headful‖ 的包装机制包装进 P22 噬菌体外壳,形成只含宿主 DNA 的转导噬菌体颗粒。

13.什么叫准性生殖?说明利用准性生殖规律进行半知菌类杂交育种的一般过程。 是指不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。 自然条件下, 一种真核微生物体细胞在同种而不同菌株的体

细胞间发生的自发性的原生质体融合, 它可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。 准性生殖是丝状 真菌,特别是不产生有性孢子的丝状真菌如半知菌类特有的遗传现象。 准性生殖一般过程:菌丝联结、形成异核体、核配、体细胞交换和单倍体化。 14.什么是原生质体融合?其基本操作程序如何?它在育种工作中有何优点? 原生质体融合(Protoplast Fusion)是通过人工方法将遗传性状不同的两个细胞的细胞壁去除,采用物理、化 学或生物学方法诱导它们的原生质体发生融合,而产生重组子的过程,亦可称为“细胞融合” (cell fusion) 。 微生物原生质体融合的一般原理和过程见图。主要步骤为:选择亲株、制备原生质体、原生质体融合、原生 质体再生及筛选优良性状的融合子。

与常规杂交相比,原生质体融合具有多方面优势: 重组频率较高、受接合型或致育性的限制较小、遗传物质的传递更为完整。

第七章

微生物的生态与环境保护

1. 什么叫生态平衡?微生物在自然界生态平衡中有何作用? 答案要点:生态系统发展到成熟阶段时,生物种类的组成,各个种群的数量及比率以及能量和物质的输入、 输出等都处于相对稳定的状态,这种状态叫做生态平衡。 和动植物一样, 微生物积极地参与了自然界中营养元素的生物循环。 微生物在自然界物质循环中的作用主要 包括: (1)生物食物链中的初级生产者,为高等的动植物提供原料; (2)有机物质的主要分解者,迅速把有机物 分解为简单的无机物,供初级生产者再利用。 2. 为什么说土壤是微生物天然的培养基? 答案要点:由于具有下列特点,我们说土壤是微生物的天然培养基: (1) 岩石在风化过程中产生的矿质元素和微量元素,能满足多数自养微生物的生长需要,土壤中的有机物 质为异样微生物提供了良好的碳源、氮源和能源,土壤中的水分也可以满足微生物的要求。 (2)土壤的 pH 值接近中性,缓冲性也较强,适合大多数微生物生长。 (3)肥沃的土壤具有较好的团粒结构,空隙中充满着空气和水分,为好氧和厌氧微生物的生长提供了良好 的环境。

(3)土壤的保温性能好,昼夜温差和季节温差的变化不大。在表土几毫米以下,微生物便可免于被阳光直 射致死。 3. 简述水体、空气中微生物的分布规律。 答案要点: (1)水体分为淡水和海水,其中微生物的分布规律为:水中存在的微生物 90%为革兰氏阴性菌, 主要有弧菌、假单胞菌、黄杆菌等。 微生物在淡水水体中的分布受到环境条件的影响:营养物质影响最大,其次是温度、溶解氧等。水体内有机 物质含量高,则微生物数量多;中温水体内微生物数量比低温水体内多;深层水中的厌氧微生物较多,而表层水 内好氧微生物居多。 海水含有相当高的盐分,一般为 3.2%?4.0%。海洋水体的特点是有机质等营养物的含量低、盐含量高、温 度低,因此,海洋微生物具有耐压、嗜冷和低营养要求的特点。 4. 研究极端条件下的微生物有什么重要意义?试举例说明。 答案要点:极端环境下微生物的研究,对开发新的微生物资源具有重要的意义。 例如嗜热菌的新陈代谢快、酶促反应温度高和世代时间短等特点是嗜温菌所不及的,在发酵工业、城市和农 业废物处理等方面均具有特殊的作用。但嗜热菌的抗热性能也造成了食品灭菌上的困难,造成食品的腐败变质。 5. 研究微生物生态的原位研究方法有何优点? 答案要点: 自然状态下的微生物生态研究方法也称为原位研究法。 微生物生态学主要是研究微生物在复杂生 态环境中的结构与功能。 实验室的纯培养方法在一定程度上可以研究自然环境中的微生物, 但并不能完全揭示它 们的组成和活动状况,因此发展自然状态下的微生物生态研究方法,十分必要。 6. 比较微生物相互之间三种偏利关系(偏利共生、互惠同生、共生)的异同。 答案要点:相同之处是偏利共生、互惠同生和共生均属于微生物之间的相互得益的偏利关系。 不同点重点从三者的定义来区分。 7. 比较微生物处理废水的活性污泥法、生物膜法和厌氧发酵法的原理与工艺。 答案要点:活性污泥法、生物膜法属于好氧处理法,厌氧发酵法属于厌氧处理法,因此处理废水的原理(包 括微生物菌群)等均不相同。 8. 简述污染环境的生物修复对环境保护的作用。 答案要点:生物修复可将农药、石油烃类、有机磷、有机氯和重金属等污染物转变成无毒的物质或二氧化碳 等。目前已成功应用于土壤、地下水、河道和近海洋面的污染治理。 阐述污染物对环境的危害,证明生物修复的作用。

第八章
1. 影响传染的因素有那些?简述彼此之间的关系。

免疫学基础

答案要点:机体是否发生传染,与病原微生物、寄主和环境条件等3个因素有着密切的关系。没有病原微生 物,机体就不会发生传染和传染病;寄主机体的免疫力的强弱,直接决定着传染是否发生;病原微生物和寄主当 时所处的外界环境条件也能直接或间接地对传染是否发生和发展起到重要的作用。

2. 当前人类面临的传染疾病形势如何?试讨论人类能否消灭传染疾病,为什么? 答案要点:当前人类面临的传染病形势非常严峻:旧的传染病由于微生物的变异死灰复燃,因为地球表面的 环境破坏新的传染性疾病不断产生,人类与其他生物的关系因资源与生存而日益恶化。 消灭传染病是人类的梦想,人类可以消灭部分传染病,如天花等,但由于微生物变异速度快,因此目前条件 下不可能消灭所有传染病。比如流行性感冒已经与人类共存几百年,病毒几经变异,目前仍是人类健康的大敌。 3. 从抗体形成的规律解释接种乙型肝炎疫苗为何要分多次进行。 答案要点:乙型肝炎疫苗为抗原,进入机体后产生抗体遵循初次反应和再次反应的规律。多次接种完成后, 如果机体遭遇乙型肝炎病毒入侵,则会产生大量的抗体,结合病毒,使人受到保护,免患乙型肝炎。 4. 什么是抗原?它应具备那些条件? 答案要点: 抗原是能与机体中相应克隆的淋巴细胞上的独特抗原受体发生特异性结合, 从而诱导该淋巴细胞 发生免疫应答,并能与相应的抗体在体外发生特异性结合反应的一类物质。 抗原应具备的条件包括:一定的理化性状、结构复杂和异物性。可结合情况具体阐述。 5. 比较传染可能的 3 种结局之间的异同。 答案要点:相同之处是传染可能的 3 种结局均为病原菌入侵机体后产生的;不同之处重点从隐性传染、带菌 状态和显性传染的定义区分。 6. 人工被动免疫和人工自动免疫各包括那些内容? 答案要点:人工自动免疫是指给机体注射某种抗原,由机体产生抗体。一般通过疫苗、类毒素等预防注射使 机体产生免疫力。 用注射含有抗体的免疫血清来防治疾病,这种免疫血清是由其它动物或人体提供的,故称人工被动免疫。人 工被动免疫包括给机体注射抗毒素、胎盘球蛋白、抗病毒血清、转移因子、胸腺素或免疫核糖核酸等。 7. 举例说明血清学反应在食品检测中的应用。 答案要点:微生物以及其它一些抗原性物质进入机体后,能在机体的血清中产生特异性的抗体。抗体与相应 的抗原在体外相遇,可以表现出凝集、沉淀、溶解、补体结合等多种反应,这些试验一般都要用免疫血清,所以 体外进行的抗原抗体反应常称之为血清学反应。 食品中病原菌的检测常常会利用血清学反应。例如环状沉淀反应试验常用来检查炭疽,称为 Ascoli 试验。 8. 简述酶联免疫吸附测定(ELISA)的原理。 答案要点:ELISA 的基本原理:利用酶与抗原或抗体结合后,既不改变抗原或抗体的免疫学反应特异性,也 不影响酶本身的特性,在特异抗原抗体反应后,形成酶—抗原—抗体复合物,再加入合适的酶底物,即会发生组 织化学反应,产生可见的不溶性有色产物。常用的为辣根过氧化物酶,其次有碱性磷酸酶等。免疫酶技术可用于 组织切片、细胞培养标本等组织细胞抗原的定性定位,也可用于可溶性抗原或抗体的测定,称酶联免疫吸附测定 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)。 ELISA 方法将可溶性抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上, 再进行免疫酶反应, 用分光光度计比色以定 性或定量。

第九章

微生物与现代食品工业

1. 引起乳品变质的微生物主要有那些?如何进行预防和控制? 答案要点:引起乳品变质的微生物主要有:乳酸链球菌、乳酸杆菌、腐败菌(如芽孢杆菌属、假单胞菌、变 形菌属的细菌) 、酵母菌和霉菌等。冷藏条件下在鲜奶中发现的大部分微生物是适冷微生物,主要有假单胞菌属、 不动细菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属和嗜冷大肠菌属,占优势的是气杆菌属和革兰氏阳性芽孢杆菌。 微生物引起的乳品变质的预防与控制主要从减少微生物和控制外界条件着手。 2. 引起肉品变质的微生物主要有那些?如何进行预防和控制? 答案要点: 参与肉类腐败过程的微生物多种多样, 常见的有腐生微生物和病原微生物。 腐生微生物包括细菌、 酵母菌和霉菌等,它们污染肉品,使肉品发生腐败变质。细菌主要是需氧的革兰氏阳性菌,如蜡样芽孢杆菌和巨 大芽孢杆菌等;需氧的革兰氏阴性菌有假单胞菌属、无色杆菌属、黄色杆菌属、产碱杆菌属、埃希氏菌属、变形 杆菌属等。此外,还有腐败梭菌、溶组织梭菌和产气荚膜梭菌等厌氧梭状芽孢杆菌。酵母菌和霉菌主要包括假丝 酵母属、丝孢酵母属、交链孢霉属、曲霉属、芽枝霉属、毛霉属、根霉属和青霉属等。病畜、禽肉类可能带有各 种病原菌,如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、炭疽杆菌和布氏杆菌等。 微生物引起的肉品变质的预防与控制主要从减少微生物和控制外界条件着手。 3. 引起粮食制品变质的微生物主要有那些?如何进行预防和控制? 答案要点:粮食制品除成品粮,如面条、米等外,还有糕点及各种方便食品等。这些食品以粮食为主要原料, 另外还含有许多其他成分,如奶、蛋、油脂和水果汁等。引起粮食制品变质的微生物包括大多数能引起食品腐败 变质的细菌、酵母菌和霉菌。 要预防和控制粮食制品的质量, 重要的一条是保证选用符合食品卫生要求的原料。 粮食制品容易被霉菌和霉 菌毒素污染,可以采用除氧剂以保持其低氧含量,同时降低保存温度,由此控制和减少微生物的生长,防止粮食 制品的酸败变质。 4. 如何进行罐藏食品变质的微生物学分析? 答案要点:第一类低酸性罐藏食品(pH 值 5.3 以上)特别容易遭受平酸腐败、硫化物腐败和腐烂。平酸通 常是由嗜热脂肪芽孢杆菌等嗜热菌所引起,致黑梭菌引起硫化物腐败,腐烂性腐败则是由肉毒梭菌等所引起。 第二类中酸性罐藏食品(pH 值在 5.3 和 4.5 之间)的腐败和第一类低性酸食品的情况差不多,不过嗜热厌氧 菌引起的腐败(TA 腐败)更为多见。 第三类酸性罐藏食品 (pH 在 4.5 和 3.7 之间) 容易发生平酸腐败、 缺氧发酵腐败、 酵母菌发酵腐败和发霉等。 平酸腐败通常由嗜酸热杆菌引起,丁酸梭菌和巴氏芽孢杆菌常会导致缺氧发酵腐败,球拟酵母、假丝酵母和酵母 属中的一些种会引起酸性食品发酵变质,两种耐热的纯黄丝衣霉和雪白丝衣霉有时会使第三类食品发霉。 第四类高酸性罐藏食品 (pH 在 3.7 以下) 通常不会遭受微生物的污染, , 但可产生氢膨胀 (第三类也有可能) 。 有时在高酸食品中也会出现由酵母和耐热霉菌所引起的发酵变质,其污染的微生物和第三类中的相同。 在分析微生物引起罐藏食品变质的过程中,应注意以下主要的几个特点: (1)微生物引起的产气型的变质, 主要是因微生物作用于含有碳水化合物的食品而产生的; (2)引起产气型变质的微生物,主要是细菌和酵母菌。

由细菌引起的,绝大多数发生于 pH 值在 4.5 以上的罐藏食品,并以具有芽孢的细菌最为常见。酵母菌的产气大 多发生在 pH 值 4.5 以下的罐藏食品; (3)微生物引起的非产气型变质,绝大多数发生于 pH 值在 4.5 以上并含 有碳水化合物的罐藏食品,以芽孢细菌为主要原因菌; (4)霉菌的出现,常是罐藏食品密闭不良所造成的。 5.食品的卫生指标主要有那些?各个指标有何意义? 答案要点:目前食品卫生标准中的微生物指标包括细菌总数、大肠菌群和致病菌三项。 检测食品中的细菌总数至少有两个方面的食品卫生意义。第一,可以作为食品被污染程度的标志。食品中的 细菌总数能够反映出食品的新鲜程度、是否变质以及生产过程的卫生状况等。一般来讲,食品中细菌总数越多, 则表明该食品污染程度越重,腐败变质速度越快。第二,可以用来预测食品存放的期限程度。 检测大肠菌群的食品卫生意义在于:第一,它可作为粪便污染食品的指标菌。如果食品中能检出大肠菌群, 则表明该食品曾受到人与温血动物粪便的污染。第二,它可以作为肠道致病菌污染食品的指标菌。 从食品卫生的要求来讲, 食品中不能有致病菌存在。 因为食品中含有致病菌时, 人们进食后会发生食物中毒, 危害身体健康,所以在食品卫生标准中规定,所有食品均不得检出致病菌。 6.动物的病原菌主要为细菌,而植物的病原菌主要为真菌,为什么? 答案要点: (1)营养成分。动物的成分主要为蛋白质、脂肪,而细菌,特别是有些好氧细菌能高效利用蛋白 质和脂肪;植物的重要成分为碳水化合物,是真菌类的主要营养物质。 (2)pH。动物的成分 pH 一般呈中性,适 合于细菌的生长,植物的 pH 一般呈酸性,适合于真菌。 (3)生长因子。动物的成分中所含的生长因子较多、较 高,而细菌属于原核生物,生长需要较多的生长因子。 7.微生物引起的食品腐败变质必须具备那些条件? 答案要点:加工前的食品原料带有微生物,食品加工过程中不可避免地要接触空气中的微生物,食品成品也 会受到微生物的污染。 发生微生物污染的食品, 是否会导致食品变质, 还与其它许多因素有关, 即: 食品发生腐败变质有一定条件。 一般说来,食品发生腐败变质,与食品本身的性质、微生物的种类和数量以及当时所处的环境因素都有着密切的 关系,其作用结果则决定着食品是否发生变质以及变质的程度。

第十章

微生物与现代发酵工业

1. 细菌酒精发酵与传统酵母菌酒精发酵相比有哪些优缺点?前景如何? 答:假单胞菌属的一些细菌与酵母菌酒精发酵的途径不同,即按 ED 途径进行酒精发酵。近年来,运动发酵 单胞菌(Zymomonas mobilis)已成为酿酒酵母之外发酵生产酒精的第二大菌种,因为与传统的酵母菌发酵生产 酒精相比,该菌具有下列优点:①耐高糖能力(400g/L) ;②耐乙醇能力高(100 g/L) ;③低生物产量和高乙醇 收率(在厌氧条件下,每消耗 1mol/L 葡萄糖,可得 1.9mol/L 乙醇) ;④比生产速率和发酵速度快。但从菌种特 性上运动发酵单胞菌也存在不少缺点:该菌一大弱点是底物范围狭窄,据目前所知,只有以葡萄糖和果糖为碳源 有良好效果,蔗糖发酵则有一定困难,会产生大量副产物果聚糖和山梨醇,其他糖类和脂肪酸均不能利用作为碳 源,在生产上细菌发酵容易染菌,对 pH 值的控制上也比酵母严格得多,此外,该菌培养时会分泌一种胞外物, 导致培养基黏度增加和形成稳定的泡沫等。 利用高温菌生产酒精则可以克服运动发酵单胞菌等中温菌上述缺点,高温菌可在 70℃以上高温下生长,由 于它的分解代谢能力强,因此发酵时间短,生产能力几乎接近于酵母菌;由于发酵温度高,所以氧在发酵液中的 溶解度减低, 有利于厌氧菌的生长, 而且当温度高时, 培养基的黏度下降, 因此用于培养液搅拌所需动力亦减少; 与中温菌相比,高温发酵对防止染菌问题无关重要;有些高温菌例如乙醇嗜热厌氧杆菌的最适 pH 值甚为广阔,

在 5.5~8.5 之间,有时在 pH4.5~9.5 范围内也能生长;多数高温菌生成乙醇的原料范围很大,包括淀粉、纤维 二糖、乳糖和各种戊糖。因此,细菌酒精发酵的前景广阔。 2. 工业上用酵母菌发酵生产酒精、甘油和酵母细胞时,在机理及发酵条件上有何差别? 答:酵母菌发酵生产酒精是走 EMP 途径,以乙醛(丙酮酸脱羧)为受体生成乙醇,这种发酵称为酵母的一型发酵; 当环境中存在亚硫酸氢钠时,不能以乙醛作为受体,而以磷酸二羟丙酮作为受体时,产物为甘油,称为酵母 的二型发酵;在弱碱性条件下(PH7.6) ,乙醛因得不到足够的氢而积累,两个乙醛分子间会发生歧化反应,一个 作为还原剂形成乙酸,一个作为氧化剂形成乙醇,受体为磷酸二羟丙酮,发酵产物为甘油、乙醇和乙酸,称为酵 母的三型发酵。这种发酵方式不产生能量,只能在非生长的情况下进行。 酵母菌发酵生产酵母细胞时,是进行好氧发酵。 3. 讨论在甘油发酵中加入亚硫酸盐并保持碱性条件的重要作用及其原理。为什么在甘油发酵中要选择耐高 渗透压酵母? 答: 亚硫酸盐法是利用酵母异常酒精发酵 (酵母的第Ⅱ型发酵) 来生产甘油的, 该生成途径有如下几个特点: ①甘油的生成是添加亚硫酸氢钠, 与乙醛复合而使磷酸二羟丙酮代替乙醛作为受氢体的结果, 因此甘油产量的大 小直接与被复合的乙醛的量有关。② 1,6-二磷酸果糖是甘油和乙醛途径的共同前体,由葡萄糖生成 1,6-二磷 酸果糖需要消耗 ATP,甘油生成途径中不产 ATP,而乙醛生成途径才产生 ATP,因此从能量守恒可知,要生成甘 油则必须有等摩尔量的乙醛生成。③ 乙醛与亚硫酸氢钠复合反应效率低于 89%,乙醛不能全部被亚硫酸氢钠复 合,而酵母菌体内有乙醇脱氢酶存在,这样,部分乙醇生成不可避免,由于乙醇的生成竞争性地利用 3-磷酸甘 油醛脱下的氢,而降低了磷酸二羟丙酮转化为α -磷酸甘油时所需的 NADH2 量,使甘油的产量降低。 耐高渗透压酵母的甘油生产,是在碱性条件下发生的(又称酵母的第Ⅲ型发酵) ,乙醛因得不到足够的氢而 有积累, 结果 2 分子乙醛之间行歧化反应, 生成等量的乙酸和乙醇, 总反应式为: 6H12O6+ H2O→2C3H5 2C (OH) 3COOH+ 3+CH C2H5OH +2CO2 其特点是:①具有耐高渗透压的特性(能在高达 20%~25%高浓度糖液中进行发酵) 。②发酵需要通风。③ 除能利用葡萄糖外,还能利用甘油等物质。④此过程产物复杂(CO2、乙醇、甘油、乙酸、高级醇) 。 4. 说明糖有氧降解的调节机制,并阐明黑曲霉能大量积累柠檬酸的原因。 答:糖经 EMP 途径生成丙酮酸,一方面丙酮酸经氧化脱羧形成乙酰 CoA;另一方面由 CO2 固定生成草酰乙酸, 这两者缩合形成柠檬酸,进入三羧酸循环。由于乌头酸酶失活或微弱,导致柠檬酸积累。所以柠檬酸工业生产采 用以微生物在代谢过程中积累中间体的方式。 柠檬酸是微生物好气代谢过程的中间产物, 正常情况下在胞内不会 积累,况且柠檬酸还可作为黑曲霉的碳源,因此,柠檬酸积累是代谢失调的结果。从理论上推断,积累柠檬酸必 须使生成柠檬酸的有关酶系要强大, 而柠檬酸后代谢的酶系要微弱, 其中糖酵解的调节是柠檬酸发酵最为重要的 调节。测定柠檬酸产生菌黑曲霉 B60 的酵解中间产物,发现磷酸果糖激酶(PFK)是一种调节酶,此酶可被柠檬酸 + + 所抑制,受 NH4 激活,NH4 存在可有效解除 PFK 对胞内柠檬酸积累的敏感性。为了使 PFK 不受柠檬酸的抑制,则 2+ 必须变更营养成份(例如 Mn )的限制与氧的供给等。黑曲霉在缺锰的培养基中培养时,可减少 HMP 途径和 TCA + 环有关酶的活性, 可提高细胞内 NH4 的浓度和呼吸活性, 可使 EMP 途径得到加强; 由于在培养基中限制添加氮源, 导致乌头酸酶一直处于较低水平,而柠檬酸合成酶的活性却自始至终均较高,从而导致柠檬酸大量积累。 5. 细胞膜缺损突变株在发酵工业中有何应用价值?试举例说明。 答:在谷氨酸发酵中,控制生物素浓度为亚适量,可增加谷氨酸产生菌细胞膜的通透性,使谷氨酸不断分泌 到细胞外,从而解除了过量谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制作用,提高谷氨酸的产量。或者添加青霉素,抑制 细胞壁后期合成,使细胞壁不能形成完整的网状结构,引起磷脂和胞壁组成分的 UDP-N-乙酰己糖胺向外分泌使 细菌的细胞壁及细胞膜的合成受到损伤,增加细胞膜的通透性,谷氨酸就能大量分泌到胞外。 2+ 2+ 同样,锰离子(Mn )对产氨短杆菌的肌苷酸透性也有明显作用。当培养基中含有过剩的 Mn 时,菌体生长 2+ 过量,肌苷酸积累减少,若控制培养基中 Mn 含量,或在发酵的某个时期添加抗生素或表面活性剂,则可解除细 胞膜透性对肌苷酸分泌的障碍。 6. 试述赖氨酸(或苏氨酸)生物合成的调节机制,并由此论述赖氨酸(或苏氨酸)发酵生产菌种的选育方 向及发酵条件的控制依据。 答: 根据赖氨酸的生物合成途径和代谢调节机制, 工业发酵生产赖氨酸主要选择谷氨酸产生菌为出发菌株诱

变选育所得的突变株,较容易获得高产菌。主要途径有下列几方面。 (1)彻底解除有关的代谢调节机制 ①选育营养缺陷突变株。 切断支路代谢是积累赖氨酸的有效措施, 赖氨酸单独对自身合成途径中的酶没有反 馈调节作用,因此在苏氨酸限量培养下,即使赖氨酸过量,也能由天冬氨酸生成天冬氨酸半醛。在苏氨酸缺陷型 (Thr )中天冬氨酸半醛可以进一步转变为赖氨酸和高丝氨酸,高丝氨酸又进而转变为蛋氨酸,但不能生成苏氨 酸。在高丝氨酸营养缺陷型(Hom )中,由于缺失高丝氨酸脱氢酶,丧失了合成高丝氨酸的能力,这就使天冬氨 酸半醛全部转入赖氨酸的合成。通过限制高丝氨酸补给量,使蛋氨酸和苏氨酸的生成有限,因而解除了苏氨酸和 赖氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制,使赖氨酸得以积累。工业上使用的赖氨酸生产菌以 Hom 为主,为防止回 复突变而增加遗传标记,如育成 Hom +Thr 或 Hom +Met (蛋氨酸缺陷型)的双重缺陷型,使生产稳定,增加产量。 ②选育抗类似物突变体,可以得到 AK 对反馈调节脱敏的菌株,代谢调节被遗传性地解除,不受培养基成分 的影响,使生产稳定,这是赖氨酸发酵育种的重要手段,尤其是使用营养缺陷型加类似物抗性的突变株。为增强 细菌对类似物的敏感性, 可采用赖氨酸类似物 AEC[S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸]+苏氨酸或苏氨酸类似物 AHV α ( -氨基-β -羟基戊酸)+赖氨酸来筛选 AK 脱敏的突变株。 ③变换优先合成。 优先合成的变换会引起一种终产物的积累。 选育 HomL (高丝氨酸渗漏缺陷型) Thrs(苏 和 氨酸温度敏感型)突变株,可以改变优先合成,积累赖氨酸。 (2)增加前体物的生物合成 ①选育丙氨酸缺陷型(Ala ) ;②增加前体物天冬氨酸;③应用柠磷酸合成酶低活性突变株或磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶高活性突变株。 (3)解除代谢互锁 ①选育亮氨酸缺陷型(Leu ) ;②选育抗亮氨酸类似物突变株。 s (4)选育温度敏感突变株(tem ) 选育亮氨酸温度敏感突变株,可提高赖氨酸的产量。 综上所述,若以谷氨酸棒杆菌等谷氨酸生产菌为出发菌株,选育赖氨酸高产菌,其定向育种的遗传标记为: r r r AEC [S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸抗性株]+CCL (α -氯己内酰胺抗性株)+CBL (苯酯基赖氨酸抗性株) +Ala +Leu +Hom +Thr 苏氨酸的代谢控制比赖氨酸更为复杂: 苏氨酸既是天冬氨酸族氨基酸分支途径的一种产物, 又是异亮氨酸生 物合成的前体物; 苏氨酸不仅与赖氨酸协同反馈抑制天冬氨酸激酶(AK), 它还对分支途径上的关键酶高丝氨酸脱 氢酶(HD)实行反馈调节。因此,要想积累苏氨酸,根据代谢控制理论的研究,必须选育营养缺陷型和抗代谢调节 的多重突变株,以解除反馈调节、切断不必要的支路以及阻断产物的分解,才能实现。苏氨酸高产菌的选育途径 可从以下几方面进行。 (1) 设法遗传性地解除自身的反馈调节 r 苏氨酸发酵首先必须要解除苏氨酸本身对关键酶 AK 和 HD 的反馈调节。选育 AEC 菌株常作为解除赖氨酸和 苏氨酸对 AK 的协同抑制及赖氨酸单独的反馈抑制的手段。 (2)切断支路代谢 切断蛋氨酸和赖氨酸的支路代谢, 并通过限量供应蛋氨酸和赖氨酸, 以解除它们对苏氨酸合成途径中关键酶 r 的反馈调节,可进一步提高苏氨酸产量。若能进一步切断通向赖氨酸的支路代谢,育成 AHV (α -氨基-β -羟基 戊酸抗性株)+Met +Lys (赖氨酸缺陷型) ,使天冬氨酸半醛全部转向苏氨酸,产量还会提高。 (3)增加前体物的生物合成 天冬氨酸是苏氨酸生物合成的前体物,增加天冬氨酸的合成,是苏氨酸得以大量积累的必要条件。可以通过 r r 选育天冬氨酸结构类似物抗性突变株,如天冬氨酸氧肟酸盐抗性株(AspHx ) 、磺胺类药物抗性株(SG )等,遗 传性地解除天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PC)的反馈抑制,使天冬氨酸大量合成。 为了进一步提高产量,也为了防止回复突变,可以筛选多重遗传标记突变株,归纳起来,苏氨酸产生菌定向 r r s 选育的遗传标记为:AHV +Met +Lys (或 DAP ,即二氨基庚二酸营养缺陷型)+AEC +Ileu (或 Ileu ,即异亮氨酸 r 温度敏感型)+SG 。 7. 阐述谷氨酸棒杆菌芳香族氨基酸生物合成的调节机制,并讨论选育芳香族氨基酸高产菌株的育种思路。 答:谷氨酸棒杆菌的芳香族氨基酸生物合成的调节机制与大肠杆菌不同。DAHP 合成酶、氨茴酸合成酶、分 支酸变位酶和预苯酸脱水酶是关键酶。该菌的 DAHP 合成酶只有 1 种,受苯丙氨酸和酪氨酸协同反馈抑制,色氨 酸增强这种抑制作用。当 3 种氨基酸共同存在时,最大抑制作用约 90%。氨茴酸合成酶受色氨酸强烈抑制,色氨

酸与分支酸是竞争性的,与谷酰胺是非竞争性的。色氨酸还阻遏该酶的合成。苯丙氨酸对末端途径第一个酶即预 苯酸脱水酶有反馈抑制作用,当苯丙氨酸浓度为 0.05mmol/L 时,对该酶的抑制作用达 100%。色氨酸对该酶起交 叉抑制作用(当浓度达 0.1mmol/L 时抑制 100%) ,而酪氨酸对该酶有激活作用,能和抑制剂相竞争。苯丙氨酸或 酪氨酸部分地抑制这两种氨基酸合成途径的分支酸变位酶,当两者共存(浓度达 0.1mmol/L)时,对该酶完全抑 制;而色氨酸激活分支酸变位酶(浓度为 0.1mmol/L 时酶活力为对照的 260%) ,而且能恢复被苯丙氨酸和酪氨酸 所抑制的酶活力。 苯丙氨酸对分支酸变位酶的生成有阻遏作用。 酪氨酸轻微地抑制本身末端途径的第一个酶预苯 酸脱氢酶。 第一个分支点处的分支酸变位酶有两个生理作用, 一是控制通向 L-phe 和 L-tyr 生物合成的代谢流; 二是平 -5 衡分配 L-phe、 L-tyr 和 L-trp 生物合成所需要的分支酸。 因为氨茴酸合成酶对分支酸的亲和力 m=6.25×10 mol) (K -3 大于分支酸变位酶(Km=2.9×10 mol) ,所以 L-trp 的生物合成优先于 L-tyr 与 L-phe 的合成。但由于 L-trp 对 分支酸变位酶有激活作用,能完全解除由 L-phe(0.1mol/L)所引起的抑制,并能一半地解除由 L-tyr 与 L-phe 共存所引起的抑制, 因此使分支酸趋向合成 L-tyr 和 L-phe。 当这两种氨基酸过量时, 便抑制该酶, 转向合成 L-trp。 通过 L-trp 激活分支酸变位酶的活性来平衡活菌体内这 3 种氨基酸生物合成之间的比例。 同样,第二个分支点处的预苯酸脱水酶所受的负、正调节机制,使 L-tyr 和 L-phe 合成平衡。由于 L-phe 的生物合成受到自身的反馈抑制,产生 L-tyr 比 L-phe 容易,并且由此产生的 L- tyr 与 L-phe 竞争性地解除后 者对预苯酸脱水酶活性的抑制。L-phe 将继续被合成,直至其浓度达到与 L-tyr 竞争性地抑制预苯酸脱水酶的水 平,此时 L-tyr 的生物合成又重新开始。因此,L-tyr 似乎在预苯酸脱氢酶和预苯酸脱水酶之间起分配作用,使 这两种氨基酸的合成保持平衡。进而,所产生的三种芳香族氨基酸又协同抑制其共同途径初始酶 DAHP 合成酶的 活性。 苯丙氨酸产生菌的选育, 一方面应设法解除苯丙氨酸自身的反馈调节, 另方面应切断合成酪氨酸和色氨酸的 支路代谢,同时应遗传性地解除苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的反馈调节。采用抗性兼营养缺陷型突变株能明显提 高苯丙氨酸产量。例如,谷氨酸棒杆菌一株原养型变异株对 PFP(对-氟苯丙氨酸)有抗性,在 10%糖蜜培养基中 r r 产生 5.5 g/L 苯丙氨酸和少量酪氨酸, 而另一株变异株[tyr(酪氨酸缺陷型) +PFP(对-氟苯丙氨酸抗性株) +PAP (对-氨基苯丙氨酸抗性株)],在糖蜜培养基中产生 9.55 g/L 苯丙氨酸。这些菌株具有脱敏的预苯酸脱水酶, 但 DAHP 合成酶仍受酪氨酸和苯丙氨酸的协同反馈抑制,故此必须控制培养基酪氨酸的量。 要积累大量的 L-酪氨酸,用谷氨酸棒杆菌选育多重营养缺陷型或是营养缺陷型与对芳香族氨基酸类似物多 重抗性的组合,后一类型往往能积累更多的产物。例如谷氨酸棒杆菌的双重缺陷突变株 LM-96[phe (苯丙氨酸缺 陷型)+Ade (腺嘌呤缺陷型)]在 20%糖蜜培养基中产酪氨酸 15.1 g/L。该菌株虽然在限量苯丙氨酸下能解除苯丙 氨酸的调节,但还存在酪氨酸对预苯酸脱氢酶的部分抑制作用。以野生型谷氨酸棒杆菌 KY101018 为出发菌株, L 先诱变育得 phe (苯丙氨酸渗漏缺陷型)突变株 KY10233,继而育得多种芳香族氨基酸结构类似物抗性突变株 98-TX-71,在含糖 10%的糖蜜培养基中生成 13.5 g/L L-酪氨酸。由此再衍生的酪氨酸敏感变异株(在含 100~ 400mg/L L-酪氨酸基本培养基中生长缓慢的菌落)pr-20 能使酪氨酸产量提高至 17.6 g/L。若能进一步育得 Trp (色氨酸缺陷型)或对 tyr 类似物有抗性,估计酪氨酸的产量还会提高。 从谷氨酸棒杆菌色氨酸生物合成调节机制可知, 色氨酸对自身分支途径的第一个酶具有反馈抑制和反馈阻遏 作用,因此,采用营养缺陷型,切断代谢支流,仍不能大量生产色氨酸。如谷氨酸棒杆菌 KY9456(phe +tyr ) 在有足够的分支酸下也只能产生微量的色氨酸(0.15 g/L) 。要大量累积色氨酸必须设法解除色氨酸对氨茴酸合 成酶的反馈调节,为此必须选育调节突变株。据此,从 KY9456 出发进一步选育得多重抗性突变株 4MT-11,在含 糖 10%的糖蜜培养基中产生 4.9 g/L L-色氨酸。该菌的色氨酸合成仍受苯丙氨酸和酪氨酸的抑制,因此再赋予其 结构类似物耐性的特点,得 pX-115-97 在上述条件下产色氨酸 12 g/L。最近报道将抗 5-氟色氨酸和氮丝氨酸的 黄色短杆菌 A-100 诱变,增加磺胺抗性标记,产色氨酸达 19 g/L。 8. 试述肌苷酸生物合成调节机制、菌种选育方向及发酵条件控制的原理。 答:产氨短杆菌中嘌呤系核苷酸合成的调节机制:IMP 合成途径的关键酶 PRPP 转酰胺酶受到 AMP、ADP、ATP 以及 GMP 的反馈抑制,被腺嘌呤阻遏,使用腺嘌呤缺陷型(Ade )时通过限制腺嘌呤添加量可以解除解除上述的反 馈调节,肌苷酸得以积累。IMP 以后有两条分支途径,其中 IMP 脱氢酶受到 GMP 反馈抑制,被鸟嘌呤阻遏;SAMP 合成酶受到 AMP、ADP、ATP 的反馈调节。如果在 Ade (SAMP 合成酶缺失)基础上再诱变成 Xan (IMP 脱氢酶缺失), 这样一方面切断支路代谢,同时通过限制鸟嘌呤或者黄苷的添加量解除 GMP 对 PRPP 转酰胺酶的反馈抑制,增加 IMP 积累。 在产氨短杆菌的 IMP 发酵合成过程中主要有两种控制机制, 分别控制腺嘌呤和锰离子的添加量。 腺嘌呤和锰 离子是控制 IMP 发酵合成的重要因子,起着限制菌株生长和 IMP 积累的作用,但是两者的影响是彼此独立的。腺

嘌呤对 IMP 合成途径的关键酶 PRPP 转酰胺酶有阻遏作用,因此发酵过程中对于 IMP 的积累有一个最适浓度,腺 嘌呤过量的时候 IMP 积累受到抑制,菌株生长增加。 补救合成途径也是产氨短杆菌积累 IMP 的重要途径。 在补救合成途径中, 核苷酸焦磷酸化酶受嘌呤核苷酸的 反馈抑制,由于核苷酸渗透出细胞比较困难,故此在解除反馈抑制的前提下,必须考虑细胞膜的渗透性。锰离子 与细胞膜渗透性就有着密切的关系。锰离子限量时,细胞膜产生异常,并会引起细胞形态发生变化,造成细胞伸 长或者膨胀,成不规则形状,同时由于细胞渗透性的变化,很多核苷酸补救合成途径的酶系分泌出来,在胞外经 补救合成积累 IMP,从头合成途径形成的 IMP 也分泌出细胞外,解除相应的反馈调节机制,使得细胞内的 IMP 生 物合成持续进行,总的效果都是在胞外积累 IMP。如果锰离子过量则 IMP 产量锐减,转换成次黄嘌呤发酵。 生产菌株的选育:一般应该选择核苷酸酶和磷酸酯酶活性较弱的菌株作为育种的出发菌株。常见的肌苷酸 生产菌株有枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、产氨短杆菌等。常用的产氨短杆菌、谷氨酸棒杆菌等菌株的磷酸酯酶 活性极低。而枯草杆菌的核苷酸分解酶系活力比较强,生成的核苷酸容易被酶分解为核苷,所以一般采用诱变后 W 核苷酸分解酶微弱(Nt )的突变株作为出发菌株。 解除 IMP 合成途径的反馈调节,可以采用以下几种突变株:①选育 Ade 、Ade +Xan 或者 Ade +Gu 突变株; L L L L ins r ②选育 Ade 、 +Xan 或者 Xan 、 +Mn 等突变株; Ade Ade ③选育抗类似物突变株, 8-AG(8-氮鸟嘌呤抗性株) 如 、 r r W 6-MG (6-巯基鸟嘌呤抗性株) 、8-AX (8-氮黄嘌呤抗性株)等;④以枯草芽孢杆菌为出发菌株,选育 Ade +Nt 、 VW Ade +Nt 突变株。 2+ 2+ ins 解决细胞膜渗透性问题可以通过限量添加 Mn 或者选育 Mn 不敏感突变株(Mn ), 或者核苷酸膜透过性强的 突变株。也可以通过选择抗生素、表面活性剂等调节细胞膜渗透性。 发酵条件的控制: 目前生产上一般普遍采用的都是缺陷型菌株, 因此在其培养基的组成上需要满足一定的条 件。日本有学者利用产氨短杆菌的腺嘌呤缺陷型 KY7208 菌株进行 IMP 发酵合成,对该菌株的培养基组成进行了 详细的研究。培养基中除了需要添加一定量的腺嘌呤外还有很多其他方面的特殊要求。其结果表明:①添加高浓 度(各 1%左右)的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾,同时相应添加高浓度硫酸镁,将有利于菌株生长及积累 IMP;②添 加高浓度磷酸盐、镁盐的时候,锰离子、硫胺素以及泛酸钙对菌株的生长和 IMP 积累是必须的;③在突出高磷、 高镁的培养基中,加入某些氨基酸如组氨酸、赖氨酸、高丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸等的混合物可以促进菌株生长 和 IMP 的积累;④对积累 IMP 来说,锰、锌、亚铁以及钙等金属离子是菌株必须的,尤其是锰离子的影响显著, 必须亚适量控制。 在 IMP 发酵过程中还应该考虑到温度的影响。在较高温度下,补救合成途径的酶系能够被激活,而残留的微 弱 IMP 分解酶系被钝化,从而能比低温培养过程积累更多的 IMP。最适温度的选择需要同时考虑菌株生长和 IMP 积累的要求。可以采用分段控制温度来优化整个过程。 培养基中需要添加一定量的玉米浆等富含生物素的组分。IMP 仅在生物素充分、腺嘌呤适量的时候才大量积 累。 锰离子的亚适量控制对于大规模发酵过程来说比较困难, 因为发酵过程中采用的工业原料以及工业用水都含 有较高的锰离子。 对此有两种解决方法: ①在发酵期间添加某些抗生素或者表面活性剂, 解除过量锰离子的影响。 有报道指出添加链霉素、环丝氨酸、丝裂霉素 C 以及青霉素等抗生素,或者聚氧化乙烯硬脂酰胺、羟乙基咪唑等 ins 表面活性剂,对积累 IMP 是有效的。②另一种方法是选育对锰离子有抗性的突变株,即 Mn 突变株,使得 IMP 积累不会受到过量锰离子的影响。

第十一章 微生物与现代生物制药
1. 世界上第一个有效抗菌物质—青霉素是怎样发现的? 答:在英国细菌学家弗莱明(Fleming)发现了点青霉能产生一种活性抗菌成分并命名为青霉素(Penicillin) 的 10 年后, 牛津大学病理学教授 Florey 和他的助手 Chain 组织了 20 多位不同学科的学者进行攻关。 经过一年多 时间的努力,首次制得青霉素结晶并在 1941 年应用于临床试验,奠定了青霉素的治疗学基础。1942 年,美国 Merck 制药公司在 Florey 和 Chain 的帮助下,开始工业化生产青霉素并大规模用于临床试验,为挽救在第二次世 界大战中战伤受细菌感染而濒临死亡的伤员生命, 发挥了奇特的决定性的重大作用。 1943 年又发现产黄青霉菌(P.chrysogenum), 经选育后表现出更高的青霉素产生能力,使青霉素的产量大 大提高。同年,Chain 又确定了青霉素的分子结构。至此,第一个利用微生物发酵制备抗生素的工业化获得了成 功,开创了抗生素黄金时代的到来,被誉为二次大战中三大发现之一,而 Fleming、Florey 和 Chain 三位科学家 同时获得了 1945 年度诺贝尔医学生理学奖。

2. 请说出下面这些主要天然抗生素的产生菌:青霉素、头孢菌素 C、链霉素、庆大霉素、红霉素、四环素、 螺旋霉素。 答:青 霉 素 产 黄青霉 ( Pencillnum chrysogenum )、 头 孢 菌 素 C 顶孢头 孢子菌( Cephalosporium

acremonium) 、链霉素 灰色链霉菌(S.griseus) 、庆大霉素 棘孢小单孢菌 ( M.echinospora )、红霉素 红 色链霉菌 . (S erythreus) 四环素 金霉素链霉菌 . 、 (S aureofaciens) 螺旋霉素 生二素链霉菌 . 、 (S ambofaciens) 。

3. 筛选新抗生素产生菌常用哪些方法? 微生物法测定抗生素生物效价常用哪些方法? 答:新抗生素产生菌的常用筛选方法有下列几种:琼脂块移置法、培养液扩散法、抗肿瘤抗生素的筛选法、 抗病毒抗生素的筛选法。 微生物检定法测定抗生素生物效价, 一般可分为稀释法、 比较法和琼脂扩散法。 以琼脂扩散法 (亦称管碟法) 应用最广泛。该法的一般操作步骤是:先将固体培养基融化并倒制平板,待凝固后,在上面再倒一层混有试验菌 的融化培养基。凝固后,在表面放置不锈钢管子,向管子中加入抗生素稀释液,适温培养一定时间。经培养后, 由于抗生素向培养基中扩散,凡抑菌浓度所达之处,试验菌不能生长而呈透明抑菌圈。量取抑菌圈直径并进行效 价计算。

4. 什么是半合成抗生素? 简述半合成法制新青霉素的步骤和半合成头孢菌素的酶促 生产方法。 答: 通过酶法或化学法修饰原抗生素的化学结构, 改进天然抗生素的性能, 包括克服耐药性、 增强抗菌活性、 扩展抗菌谱、改善药代动力学性能、降低毒副反应、增强稳定性以及适应制剂要求等诸方面,从而创制出具有新 特点的抗生素。 半合成法制新青霉素的步骤为: ① 由微生物发酵法获得青霉素 G 或 V;② 采用酶法水解青霉素 G 或 V 制备青霉素 6–APA 母核;③ 采用酶法将酰基侧链联结到 6–APA 母核上。 半合成头孢菌素的酶促生产方法: ① 7–ADCA 母核的制取 用化学扩环法可以将青霉素 G 或 V 转变为头孢菌素(五环扩展为六环) ,且酰

化酶更易催化此类头孢菌素水解。 水解产物为青霉素 G 或 V 的侧链产物苯乙酸或苯氯乙酸和母核 7–氨基–3– 去乙酰氧基-头孢菌素(简称 7–ADCA) 一般采用固定化酰化酶法进行水解反应,其过程大致为:培养巨大 。 芽孢杆菌 ?提取酰化酶 ? 次乙酰塑料或硅藻土吸附酶 ? 洗涤、装填柱式反应器 ? 底物上柱反应 ? 收 集流出液 ? 制取 7–ADCA 母核。 ② 半合成头孢菌素的酶促合成 以?-氨基苯乙酸甲酯酰基化到 7–ADCA 母核上,合成头孢氨苄(即先锋

霉素Ⅳ号) 为例: 将色素杆菌变种或巨大芽孢杆菌或大肠杆菌的活细胞与 DEAE 纤维素结合并吸附于羟基磷灰 石上,也可将活细胞包埋于三醋酸纤维素中实现固定化,反应底物与固定化细胞进行酶促合成反应,从而制得 头孢氨苄(先锋Ⅳ号) 。

5. 采用微生物发酵法和酶法可生产哪些生物药物? 答:微生物发酵法和酶法可生产药用氨基酸、核苷酸类药物、维生素类药物、辅酶类药物、药用酶等。

6. 用微生物发酵法进行生产的药用酶类有哪些? 答:用微生物发酵法进行生产的药用酶类有:L-天冬酰胺酶(L-asparaginase) 、链激酶(streptokinase, SK) 、 弹性蛋白酶(elastase) -半乳糖苷酶 (β -galactoridase)等。 、β

7. 微生物转化合成甾体药物一般可分为哪两个阶段进行? 答:微生物转化甾体一般可分为两个阶段进行: (1) 菌体生长期 为了获得较多的酶,首先保证菌体的充分生长,一方面供给菌体以丰富的营养,使其充分 繁殖与发育,另一方面依不同菌种的要求选择最适的培养条件。 (2) 甾体的转化反应 在微生物菌体生长的适当时间(一般为中后期)逐渐将待转化的 甾体基质(溶于有机溶剂或粉末)加到微生物的悬液中。基质加入的反应方式有:由生长培养进行反应;由静态 菌体悬浮进行反应;由固定化酶或固定化菌体进行反应;混合培养进行反应等。对于必须采用两种微生物进行的 转化反应,可用同一培养基将两菌种进行混合培养,再先后进行两种转化反应。

8. 利用微生物及其代谢产物制备的各种预防类生物制品主要有哪些? 请简述一般菌苗和疫苗的制备过程。 答:利用微生物及其代谢产物制备的各种预防类生物制品有: (1) 疫苗 由立克次氏体和病毒制成,包括减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗。 (2) 菌苗 由有关细菌、螺旋体制成,包括减毒活菌苗、死菌菌苗、 纯化菌苗。 (3) 类毒素 由有关细菌产生的外毒素经脱毒后制成。 (4) 混合制剂 由两种以上疫苗或菌苗或类毒素混合制成。 菌苗的制备过程包括:菌种的选择 、 培养条件的控制 、 死菌苗的制备 、 稀释分装和冻干。 疫苗的一般制备过程如下:毒种的选择和减毒、病毒的繁殖、疫苗的灭活、疫苗的纯化、疫苗的冻干。

9. 从微生物次级代谢产物中寻找各种生理活性物质可生产哪些新型微生物药物? 答:从微生物次级代谢产物中寻找各种生理活性物质生产的新微生物药物有:酶抑制剂、免疫调节剂、受体 拮抗剂等。

10.已商品化的以微生物为表达系统的基因工程药物主要有哪些?它们有何生理功能及 临床用途? 答:已商品化的以微生物为表达系统的基因工程药物主要有:人胰岛素、人生长激素、干扰素、白细胞介素、 集落刺激因子、红细胞生成素、肿瘤坏死因子、组织型纤溶酶原激活剂、人心钠素、乙型肝炎疫苗等。

11.基因工程药物无性繁殖系的构建过程通常包括哪些步骤? 答:基因工程药物无性繁殖系的构建过程通常包括:① 基因工程药物目的基因的制取;② 目的基因与

克隆载体的体外重组;③ 重组克隆载体引入宿主细胞的转化与转导(感染) ;④ 含目的基因重组体的筛选、鉴 定与分析,⑤ 目的基因在宿主细胞中的高效表达。


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