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血清骨钙素N端中分子片段的测定及临床应用


# 216 # 文章编号 : 1001 -2087( 2003) 04 -0216 - 03

上海医学检验杂志 2003 年第 18 卷第 4 期 中图分类号 : Q 446. 1 文献标识码 : A

Shanghai J of M ed Lab S ci 2003, V ol 18. N o 4.

血清骨钙素 N 端中分子片段的测定及临床应用
甘洁民 , 张月丽 , 施 泓, 汪家愉, 缪应新 ( 上海市华东医院 , 上海 200040)
摘要 : 目的 研究各 年龄组血清 骨钙素 N 端中分子 ( N - M ID ) 片 段的含量 , 了解其 稳定性 , 并探讨 与各种骨 用电化学发光免疫测定法 ( ECLIA ) 测定血清骨 钙素 N - M ID 片段 , 其中对照组 183 例 ,

代谢疾病的关系。 方法 骨钙 素。结果

各种骨代谢疾病患者 99 例。将样品放置于室温和 4 e 中 , 于不同时间分别测定血清骨钙素 N - M ID 片 段和全段 女性绝经后含量显著升高 , 男性各年龄组差异无统 计学意义 , 女性高于男性 , 各类疾病 组与对照 组比较差异均有显著性。样品在室温和 4 e 冷藏 , 骨钙素 N - M ID 片段很稳定 , 而全段骨钙素逐渐下 降。 结论 用 ECLIA 法测定血清骨钙素 N - M ID 片段 , 灵敏度高 , 稳定 性 , 能很好 地反映 骨转换的 变化 , 是骨 代谢疾 病研究 非常有价值的敏感指标。 关键词 : 骨钙素 ; 电化学发光免疫法 Quantitative determination of serum N - MID osteocalcin and its clinical application Abstract: Objective

GA N J iemin, ZH A N G

Yueli, SH I H ong , WA N G J iay ou , M IA O Yinx in. H uadong H osp ital, S hanghai 200040, China T o study the N - M ID osteocalcin in different ag es, investigate the stability o f osteocalcin, N - M ID osteocalcin in and study the relat ionship betw een N - M ID osteocalcin and bone metabolic disease. Methods

human serum w as determined by electro chemiluminescence immunoassay ( ECL IA) . Blood samples w ere collected from 183 healthy subjects and 99 patients w ith bo ne metabolic disease. T he stability o f the N - M ID osteocalcin w as observed by comparison of storing samples in room temperatur e and 4 e . Results A sig nificant increase of N - M ID osteocaltin w as found in postmenopausal women. T he serum N - M ID osteocalcin in w omen is hig her then in men. A significant in crease of N - M ID osteocalcin was found in bo ne metabolic disease. T he N - M ID osteocalcin is stable in room temperature and 4 e , but the intact osteocalcin decreases significantly. Conclusions ECL IA for quantitative determination o f N M ID osteocalcin can improve the clinical utility and be useful to assess bone metabolic disease. Key words: N - M ID osteocalcin; Electrochemiluminescence immunoassay

骨钙素是成熟成骨细胞分泌的一种非胶原骨 基质蛋白 , 占骨基质中非胶原蛋白成分的 25% , 骨 总蛋白的 2% 。完 整的骨 钙素有 49 个氨 基酸组 成, 相对分子质量为 5 800 。血清中的骨钙素具有 多样性, 约 1/ 3 为完整骨钙素 ( 即全段骨钙素 ) , 1/ 3 为骨钙素 N 端中分子( N- MID) 片段, 1/ 3 为氨基酸 短肽。骨钙素是成骨细胞功能和骨质矿化的特殊 标志物 , 作为骨转换标志物逐渐被临床应用 [ 1, 2] 。 目前国内大多用酶联免疫法测定全段骨钙素 , 由于 全段骨钙素自身稳定性较差, 标本存放温度和时间 会影响 实验结 果。我 们采 用电 化学 发光 免疫法 ( ECL IA) 测定血清骨钙素 N- MID 片段 , 并作初步 的临床评价。 一、 对象 1. 对照组

材料和方法

183 例, 年龄 35~ 79 岁 , 体格检查

均无肝肾及内分泌疾患和其他骨矿代谢性疾病, 未 服用影响骨矿代谢的药物。其中男性 85 例, 分成 4 组。女性 98 例, 也分成 4 组 : 绝经前妇女 29 例 ( 35~ 49 岁) ; 绝经后妇女 26 例 ( 50~ 59 岁 ) , 自然 绝经至少 1 年以上 ; 老年妇女 43 例 ( 60~ 69 岁 23 例, 70~ 79 岁 20 例) 。 2. 疾病组 均系明确诊断为各种疾病的本院 住院患者 99 例, 其中骨质疏松症组 39 例, 年龄 40 ~ 78 岁; 甲状腺 功能亢 进组 20 例, 年龄 35~ 70

作者简介 : 甘洁民 , 1964 年生 , 女 , 学士 , 副主任技师 , 主要从事骨代谢实验室指标研究。

上海医学检验杂志 2003 年第 18 卷第 4 期

Shanghai J of M ed Lab S ci 2003, V ol 18. N o 4.

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岁; 肾功能不全组 20 例, 年龄 40~ 69 岁 ; 肿瘤骨转 移组 18 例 , 年龄 42~ 68 岁; 变形性骨炎组 2 例, 年 龄 50~ 60 岁。 二、 试剂和仪器 ECL IA 法测定骨钙素 N- MID 片段, 仪器为罗 氏公司 Elecsys 2010 全自动免疫测定仪 , 试剂由罗 氏公司提供。酶联免疫法测定全段骨钙素, 仪器为 芬兰 L absystems 公司的 洗板机和酶标 比色仪, 试 剂由美国 Met ra Biosyst em 公司提供。 三、 方法 1. 测定方法 采用 ECLIA, 其 原理是双抗体

表1

样品放置不同温 度和时 间骨钙 素 N - M ID、 全段 骨钙 素的测定值及变化率
骨钙素 N - M ID 片段 ? x ? s 变化率 ( % ) 14. 8 ? 1. 6 14. 9 ? 1. 8 14. 5 ? 1. 8 14. 7 ? 1. 9 14. 6 ? 1. 7 0. 6 2. 0 0. 6 1. 4 全段骨钙素 x ? ? s 变化率 ( % ) 8. 3 ? 1. 1 7. 5 ? 1. 0 6. 4 ? 1. 2 7. 6 ? 1. 3 6. 8 ? 1. 2 9. 6 22. 9 8. 4 18. 6

项目 初始值 22 e 室温 3 h 8 h 4 e 冷藏 8 h 24 h

四、 对照组骨钙素 N - M ID 片段的测定 男女各年龄组血清骨钙素 N-M ID 片段的测定 结果表明 : 男性组中 , 随着年龄增高, 略 有升高趋 势, 但各年龄组间差异无统计学意义。女性组中 , 绝经前后有非常显著的差异 , 绝经前组与老年妇女 组差异也有统计学意义 , 绝经后各组间无差异。男 女比较女性高于男性 , 特别在绝经后 , 女性显著高 于男性, 见表 2。
表2 男女各年龄组骨钙素 N - M ID 片段测定值
男 组号 1 2 3 4 年龄 35~ 49 50~ 59 60~ 69 70~ 79 例数 25 20 20 20 x? s ? 13. 1 ? 4. 1 13. 9 ? 4. 3 14. 5 ? 5. 1 14. 7 ? 4. 8 例数 29 26 23 20 女 x? s ? 14. 8 ? 3. 2 18. 2 ? 5. 5* 17. 5 ? 5. 9
* *

夹心法: 待测样品中骨钙素 N- MID 片段、 钌标记的 单克隆 N-M ID 骨钙素抗体和包被抗体的酸性微珠 充分 反应 , 形 成钌 -抗体 -抗原 -抗体 - 微 珠复 合物。 被酸性微珠捕获的钌在磁铁的作用下被吸附 , 并被 激发电压激发, 发生电化学发光反应, 最后产生的 光强度与钌的浓度呈线性关系 , 据此测出骨钙素的 含量。 2. 保存期间的稳定性实验 选取 10 例样品 ,

采血后1 h 内分离血 清, 每 份血分 2 组, 一组置室 温, 另一组保存于 4 e 。在室温放置 3 、 8 h 和4 e 放置 8、 24 h时 , 分别测定骨钙素 N - M ID 片段和全 段骨钙素。每个时段 , 每一样品检测 1 次, 然后计 算 10 个标本检测结果的均值和标准差。 3. 统计方法 所有数据采用 ? x ? s 表示, 用 t 检验比较各组差异。 结 果

17. 2 ? 5. 6*

注 : 与 1 相比 , * P < 0. 05、 * * P < 0. 01

五、 各疾病组骨钙素 N- M ID 片段的测定 各疾病组与对照组比均有显著差异。升高最 明显的是变形性骨炎组 , 与其他各疾病组有非常显 著的差异。其次是肾功能不全组 , 与其他各疾病组 有非常显著的差异 , 见表 3。
表3
组别 对照组 疾病组 骨质疏松症 甲状腺功能亢进 肾功能不全 肿瘤骨转移 变形性骨炎 39 20 20 18 2 25. 4 ? 7. 2* 34. 9 ? 8. 2* 59. 5 ? 10. 7* 30. 2 ? 8. 9* 48. 1 ? 38. 5*

一、 骨钙素 N- MID 片段的精密度试验 批内变异: x ? = 18. 5 Lg/ L , C V = 1. 5% ; 批间 变异 : x ? = 18. 3 Lg/ L , C V = 2. 1% 。 二、 全段骨钙素的精密度试验 批内变异: x ? = 8. 5 L g/ L, CV = 6. 8% ; 批间变 异: x ? = 8. 1 Lg/ L, C V = 7. 8% 。 三、 保存条件的影响 采血后 1 h 测得的含量为初始值, 室温放置 3 、 8 h后 , N - M ID 骨钙素 与初始浓度比无 差异, 而全 段骨钙素与初始浓度比 有明显差异 , 分别下降了 9. 6% 和22. 9% 。血清 4 e 冷藏保存 8、 24 h 后, NM ID 骨钙素与初始浓度 比无差异, 而全段骨钙素 与初始浓度比有明显差异 , 全段骨钙素逐渐下降 , 分别下降了8. 4% 和 18. 6% , 见表 1。

各疾病组骨钙素 N - M ID 片段测定值
例数 183 x? s ? 15. 4 ? 5. 8

注 : 与对照组比较 , * P < 0. 001





女性在绝经后, 由于雌激素水平迅速降低 , 骨

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上海医学检验杂志 2003 年第 18 卷第 4 期

Shanghai J of M ed Lab S ci 2003, V ol 18. N o 4.

转换率升高, 骨吸收显著增加的同时成骨细胞的数 量和功能增加, 而骨钙素是成骨细胞分泌的骨基质 蛋白, 是反映成骨细胞功能的敏感指标, 因此绝经 后妇女 骨钙 素显著 升高 [ 3] 。而男 性随 着年 龄增 高, 同样面临雄激素的减少 , 虽然没有女性更年期 那么强烈, 但也影响成骨细胞的功能, 使骨钙素有 所升高。 各种骨代谢疾病 , 由于骨转换率不同 , 骨钙素 有不同程度的升高。由于骨钙素片段由肾脏排泄 , 故肾功能不全组骨钙素的升高是因为肾脏清除能 力下 降所致。有文献报道 , 如果肾小球滤过率 < 30 ml/ min, 骨钙素浓度将超过参考范围 [ 4] 。 完整骨钙素及大的骨钙素 N - M ID 片段均存在 于血液中, 完整的骨钙素在外周血液中不稳定 , 羧 基端 43 - 44 间的氨基酸最易被蛋白酶水解 , 使大多 数多价抗体不能识别而不起免疫反应, 因而完整骨 钙素的测定值随样本放置时间延长而下降, 而裂解 下来的骨钙素 N - M ID 片段则稳定得多。因此应用 针对 N - M ID 片段的单抗既能测定完整骨钙素的 N 端片段又能测定裂解下来的骨钙素 N- MID 片段 , 因而测定值各时段较稳定。目前国内较多采用酶 联免疫法测定全段骨钙素 , 但是由于全段骨钙素在 分析前的变异很大 , 稳定性极差, 在室温下很容易
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解裂成骨钙素的片段, 因此血清标本应在抽血后迅 速处理, 否则严重影响测定结果 , 造成测定结果假 性偏低。我们应用先进的 ECL IA 法测定血清骨钙 素N - M ID 片段, 灵敏度高, 稳定性好 , 可克服上述 缺点 , 能很好地反映骨转换的变化 , 对骨代谢疾病 的诊断、 监测、 治疗效果的观察有较高价值。 参 考 文 献
[ 1] Garnero P , Gr imaux M , Seguin P, et al . Characater isation of immuno reactive forms of human osteocalcin generated in vivo and vitro [ J] . J Bone M iner Res, 1994, 9: 255 - 264. [ 2] Delmas PD, Christiansen C, M ann K G. Bone gla pro tein assay standardization report [ J] . J Bone M iner Res, 1990, 5: 5 - 11. [ 3] Chen JT , Hosoda K , Hasumi K, et al . Serum N - ter minal osteocalcin is a good indicator fo r estimating re sponders to hor mo ne replacement therapy in postmeno pausal w omen [ J] . J Bone M iner Res, 1996, 11: 1784 - 1792. [ 4] Delmas PD, Wilson DM , M ann K G. Effect of renal function on plasma lev els of bone Gla protein [ J] . J Clin Endocr inol M etab, 1983, 57: 1028 -1030. ( 收稿日期 : 2003 - 03 - 18) ( 本文编辑 : 龚晓霖 )
文献标识码 : B

海洛因依赖者 T 细胞亚群及血清 IL - 2 的测定
刘 仿, 何 德, 郭 震 ( 广东医学院微生物学教研室, 广东 湛江 524023)
关键词 : T 细胞亚 群 ; IL - 2; 海洛因依赖者 海洛因依赖者绝大多数体质虚弱 , 抵抗力 低下 , 对各种 传染病的易感性增高。有报道海洛因可降低人体红细胞免 疫功能和 N K 细 胞活 性 一、 材料和方法 1. 检测对 象 海洛 因 依赖 者 50 例 , 符 合 DSM - ?- R 阿片类药物依赖诊断标准 , 无 重要脏器 合并症 , HIV 1/ 2 抗 体阴性。平均年龄 26. 4 岁。平均吸 毒时间 为 ( 4. 5 ? 1. 2)
[ 1 , 2]

年 , 海洛因使用量 为 0. 8~ 7. 2 g / d, 日平均量为 ( 1. 1 ? 0. 6) g。对照组 40 例 , 平均年龄 ( 30. 2 ? 5. 8) 岁 , 无吸烟史 , 未接 触过阿片类药物。 2. 检 测 方 法 采 用 APAAP 法 检 测 外 周 血 CD3 、
+

。我 们对 50 例海 洛因 依赖 者

的 T 细胞亚群及血清 IL -2 水平进行了检测。

CD4 + 、 CD8 + 细 胞。 血 清 IL -2 检 测 采 用 双 抗 体 夹 心 EL ISA。试剂盒均购自军事医学科学 院。所得实 验结果用 x ? s 表示 , 组间比较采用 t 检验。 ? ( 下转第 250 页 )

基金项目 : 湛江市科技攻关基金资助项目 ( 200114) 作者简介 : 刘仿 , 1958 年生 , 男 , 硕士 , 副教授 , 主要从事免疫调节研究。


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