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第20届国际生物学奥林匹克竞赛(8)+实验考试


58

生物学通报

2011年第46卷第5期

第20届国际生物学奥林匹克竞赛(8)
实验考试
秦咏梅 佟向军 许崇任
北京

赵进东
l00871)

(北京大学生命科学学院

中国图书分类号:G634.915 实验考

试2生物化学 100分,90 介绍:
min。

文献标识码:E 任务1 酸性磷酸酶活性的测定(70分)

酸性磷酸酶的活力通过一个酶催化的反应来 测定。该反应将对硝基苯磷酸转变为对硝基苯酚 (pNP),同时释放磷酸。产物pNP在波长400
nm

在酸性条件下。酸性磷酸酶使磷酸化的分子 释放磷酸离子。本实验的目的是测定酸性磷酸酶 的比活力(性)。任务l,测定土豆粗提物中酸性磷 酸酶的活力。任务2,测定任务l粗提物中的蛋白 浓度。结合任务1和任务2,可获得酸性磷酸酶的 比活力(性),它的活力用每单位时间每单位蛋白 量表示。比活力(性)是蛋白纯度的指标,它的值 随蛋白纯度的提高而升高。 注意事项: 1.实验中将接触少量有毒物质(对硝基苯酚 和NaOH).可以带上一次性手套和护目镜。 2.对于计算问题,如果计算公式正确,即使结 果出现错误。也可获得部分分数。 材料和仪器 1.1台分光光度计 2.2支1 mL微量移液器 3.1支200斗L微量移液器 4.2盒枪头 5.1个塑料比色皿 6.1个试管架
6—1

吸收光,在极碱性pH条件下,pNP的吸收系数 (£40D。)为19 000 M—cm~。因为酸性磷酸酶显示 弱酸性,所以必须在碱化条件下进行pNP的定 量。在任务1中,你将测定该反应随时间变化的反 应进程。获得由1 mL粗提物引起的每分钟吸光 值的变化。利用8彻。吸光值的变化可转换为浓度 的变化。这样,将浓度的变化乘(×)测定样品的体 积,可计算出该反应产生pNP分子的摩尔数。 吸收系数:
A=sCL

C(M)

数量
l 2 ●}—————, 1 2 A,吸光值;8,吸收系数;C,浓度;L,光路径长度;Io,入射光 1 l 1 强度;I,透光强度 L(cm)
/o

酸性磷酸酶的粗提物

吸光值(A)是溶液的一个物理化学特性。表 示一个物质在特异波长下的吸光程度。吸光值与 浓度(C)及光路径长度(L)成正比。公式中常数的

(15 mL塑料试管中装有4 mL粗提物,标记

上“1×enzvme”)
6—2 0.5

mol醋酸钠缓冲液(pH 5.6)


取值是由溶质的性质决定,被定义为吸收系数 (8)。这样,吸光值与浓度的关系为A=£C(M=mol litre一1)L(cm)。在这个实验中,已知£,L为1
cm,

(15 mL塑料试管中装有2 mL)
6—3 5

mmol对硝基苯酚(15 mL塑料试


管中装有4 mL)
6—4 0.5 mol

吸光值可转换为浓度。因为吸光值是一个绝对数 值,没有单位,8的单位是M。1cm一。 任务l中给出2个不同浓度的蛋白样品。找 到标有“1×enzyme”的试管,里面装有酸性磷酸酶 粗提物。找到装有3%NaCl溶液,吸出1
mL 3%

NaOH(15 mL塑料试管中


装有8 mL)
6—5 10 mL) 6—6

3%NaCl(15 mL塑料试管中装有


6个玻璃试管



NaCl弃去(现在试管中3%NaCl变为9 mL),用

万方数据

2011年第46卷第5期


生物学通报

mL微量移液器加入l mL“1×enzyme”酶溶液。

Q.1.5.将Q.1.4得到吸光值的变化转换为浓 度的变化,假设pNP的吸光系数为19
000 M。

得到“0.1×enzvme”酶溶液,标记为“O.1×”。然后, 找到6个空的玻璃试管,按照以下所示。在每个试 管上。标记上酶的浓度和反应时间。
“0.1×",20 min;“l×",20 min;“0.1×”,10 min; “1×”1x,lO min;“0.1×",l min;“1×’’1×,l min。

cm一。将答案(用mol/mL?min表示)及计算过程写 在答题纸上。(5分) Q。1.6.将Q.1.5的浓度变化转变为pNP的摩 尔数变化。将答案(用mol/min?mL摩尔数的变化 表示)及计算过程写在答题纸上。(5分) Q.1.7.计算实验开始时所提供的4
IIIL“1×

Q.1.1.首先,为完成所有反应,你需要设计实 验,如答题纸上的表格所示,(O)表示反应开始, (●)表示反应结束。每一个起始反应之间至少要 有l min间隔。以“0.1×,20 min”为例,已在表格 中表示出来。(10分) Q.1.2.按照Q.1.1中制定的计划及下列实验 步骤进行酶的活力测定。每个操作需要更换一个 新枪头。每次加样后立即混匀。所有的反应完成 后,在400 nm测定样品吸光值(A枷),将A枷值记 录在答题纸Q1.2.的表中。利用这些数据作图。请 注意。由于蒸馏水被用作空白对照,所得到的线条 不通过Y一轴原点。 酸性磷酸酶活力测定步骤 1)在一个试管中混入O.12 钠缓冲液(pH5.6),O.24
mL mL 0.5

enzyme”酶溶液的总活性(用mol/mL?min表示)。(5 分)

任务2蛋白质的浓度测定(30分) 蛋白质的浓度测定通常利用牛血清白蛋白 (BSA)作为标准蛋白。在任务2中,将使用
B raIdfbrd方法测定BSA及任务1中“1×enzvme”酶

溶液的浓度。Bradfbrd方法基于考马斯亮蓝结合 蛋白在595 nm光吸收增强的原理而设计的。 用3%NaCl稀释BSA浓储液(0.4 mg/mL)得 到1/2一稀释倍数的系列浓度(O.4
mg,mL,0.2 mg/

mol醋酸

mL,O.1

mg/mL,及0.05 mg/mL)。将不同浓度的

5咖ol对硝基苯酚
min,20

BSA溶液及任务l中“0.1×enzyme”酶溶液分别用 染料处理。测定每个样品中595 nm的光密度 (OD锑),记录在下表中。

(pNPP)。加入0.24 mL酶溶液后记录反应开始。 2)分别在反应1
0.6 mL 0.5 mol min,10

min后,加

Na0H终止反应。NaOH将产物

pNP转变为黄色(A400一吸收)。 3)当所有的反应被终止后,测定每个样品的
A枷。

酸性磷酸酶活力实验:
O.5

n“醋酸钠缓冲液(pH5.6)

O.12mL 0.24mL O.24 nlL 0.6mL 1.2mL

5mml pNPP

0.5mol Na0H

光密度(OD),测定某一物质的透光程度或物 质颗粒分散的“吸光值”。 Q.2.1.在答题纸上,用OD饼对BSA浓度作 图,用近似(回归)直线表示。(10分) Q.2。2.从图上。估算“0.1×enzyme”酶溶液的浓 度,根据这一浓度,计算“l×enzyme”酶溶液的浓 度。(10分) Q.2.3.计算“1×enzyme”酶溶液的比活力(性)。 将答案(用mol/IIlin?mg蛋白摩尔数的变化表示) 及计算过程写在答题纸上。(10分) (待续)

终体积

Q.1.3.比较哪一种酶浓度给出较好的线性关 系(A枷对时间的关系),在答题纸上,圈出正确浓 度。计算Q.1.2图中使用该酶浓度所得到的直线 斜率是多少?(15分) Q.1.4.利用Q.1.3得到的斜率,计算酶活力。 使用酶浓度“l×enzyme”所用量,用A枷的变化表 示酶活力(用mol/min?mL表示)。光路径(L)为


cm。在答题纸上写出答案和计算过程,并写明

单位。

万方数据

第20届国际生物学奥林匹克竞赛(8) 实验考试
作者: 作者单位: 刊名: 英文刊名: 年,卷(期): 秦咏梅, 佟向军, 许崇任, 赵进东 北京大学生命科学学院,北京,100871 生物学通报 BULLETIN OF BIOLOGY 2011,46(5)

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引用本文格式:秦咏梅.佟向军.许崇任.赵进东 第20届国际生物学奥林匹克竞赛(8) 实验考试[期刊论文]-生物学 通报 2011(5)


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