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植物根际促生细菌(PGPR)研究进展及其应用


PGPR 研究进展及其应用
山东农业大学生命科学学院/ 山东农业大学生命科学学院/山东省农业微生物学重点实验室

1. 引 言
植物根际是细菌的良好生境,植物根为细菌提供了良好的生态位(niche)。能在植物 根际持续稳定地定植、受植物影响的细菌称为根际细菌(Rhizobacteria),植物根际细菌具 有丰富的遗传多样性, 根际细菌种群密度比非根际土壤高 100 倍, 多达 15%的根面可能被各 种细菌的微菌落(microcolonies)所覆盖。细菌利用植物释放的营养物质(根分泌物、裂解 物)进行生长繁殖,同时也合成代谢产物分泌到根际。有些代谢产物作为信号转导化合物 (signalling compounds )被相同微菌落的邻近细胞、其它细菌细胞或宿主植物细胞所感知(Van Loon, 2007) 。1978 年,美国奥本大学的 J.W. Kloepper 首次提出植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)的概念。PGPR 是一群定植于植物根际、与植物根密 切相关的根际细菌,当接种于植物种子、根系、块根、块茎或土壤时,能够促进植物的生长 (Kleopper & Schroth, 1978)。PGPR 是自生细菌,虽然某些菌株能够侵入植物组织,但不引起 明显的侵染症状。PGPR 不包括与植物形成共生结构的根瘤菌(rhizobia)和弗兰克氏菌 (Frankia) ,根瘤菌和弗兰克氏菌的共生固氮作用不属于 PGPR 的促生作用范畴。联合固氮 菌应该属于 PGPR 的范畴,某些根瘤菌在非豆科植物上具有促生作用的情况下也可看做 PGPR。PGPR 通过一种或多种促生机制直接或间接地促进植物的生长,这些促生机制包括: 对植物的直接刺激作用;增加植物对养分的吸收;抑制植物病害;诱导植物系统抗性等。直 接促生作用包括产生刺激性的植物激素、挥发性化合物(volatiles)以及 ACC 脱氨酶等,降 低植物体内的乙烯水平,改进植物营养状况(如促进难溶性磷、钾和微量元素的释放,非共 生固氮等) ,刺激植物产生诱导系统抗性(induced systemic resistance,ISR)。间接促生作用 包括产生抗生素、 抗菌蛋白或铁载体等减轻病害, 促进有益的共生作用 (根瘤和菌根的形成) , 降解农药等生物外源性物质。 在大多数研究中, 一种 PGPR 通常通过多种作用模式促进植物 的生长。 过去40年中,PGPR研究始终是农业微生物学、植物病理学的热点领域之一。3年举办一 次的PGPR国际学术研讨会反映了人们对这一研究领域的持续、广泛关注(1987,加拿大; 1990,瑞士;1994,澳大利亚;1997,日本;2000,阿根廷;2003,印度;2006,荷兰;2009, 美国)。多个学科领域的科学家、企业、政府加入其中,从不同角度和层面开展了范围广泛 的研究。 1.1 PGPR菌株模筛选及田间应用效果研究 菌株模筛选及田间应用效果研究 菌株模筛选 PGPR具有丰富的遗传多样性。已发现许多属种的PGPR,如芽孢杆菌属(Bacillus)、类 芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、
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伯克霍尔德氏菌属 (Burkholderia) 节杆菌属 、 (Arthrobacter) 不动杆菌属 、 (Acinetobacter) 、 农杆菌属(Agrobacterium)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、固氮螺菌属(Azospirillum)、 慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、弗兰克氏菌属(Frankia)、泛菌属(Pantoea)、根瘤 菌属 (Rhizobium) 沙雷氏菌属 、 (Serratia) 链霉菌属 、 (Streptomyces) 硫杆菌属 、 (Thiobacillus) 等。 芽孢杆菌(Bacilli)由于其产生芽孢,能够在诸多不利环境中生存,是研究最广泛、最深 入的植物根际促生细菌之一。 枯草芽孢杆菌 (B. subtilis) 普遍存在于多种植物的根际土壤中, 通过产生伊枯草菌素 A(iturin A ) 等抗生素抑制镰刀菌 (Fusarium ) 丝核菌 、 (Rhizoctonia ) 等引起的植物枯萎病、 猝倒病等土传真菌性病害 (Kinsella, et al., 2010) 解淀粉芽孢杆菌 。 (B. amyloliquefaciens )IN937a 和短小芽孢杆菌(B. pumilus )IN937b 的混合菌剂在田间条件 下能够使番茄(Lycopersicon esculentum)产生对小核菌(Sclerotium rolfsii)引起的根枯病的诱 导 系 统 抗 性 ; 辣 椒 (Capsicum annuum var. acuminatum) 产 生 对 炭 疽 病 ( Colletotrichum gloeosporioides) 的诱导系统抗性 (induced systemic resistance , ISR)以及黄瓜(Cucumis sativus) 。巨大芽孢杆菌(B. megaterium)KL39 对花叶病毒(CMV)的诱导系统抗性(Jetiyanon, 2007) 对 胡 椒 疫 病以 及 多 种作物 的 土 传 真菌 病 害 具有良 好 的 防 治效 果 。 地衣芽 孢 杆 菌 (B. licheniformis) 蜡样芽孢杆菌(B. cereus)、 B. lentimorbus 产生抑制性挥发性物质(volatile 、 substances)和多种水解酶类等,有效抑制马铃薯块茎的干腐病。B. vallismortis EXTN-1 使 马铃薯等植物产生诱导系统抗性,提高马铃薯抗病毒 PVY 和 PVX 能力,增加叶绿素含量。 B. koreensis BR030 是一株从柳树根际分离的 PGPR 菌株。短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis) 、Paenibacillus lautus、嗜热芽孢杆菌(B. stearothermophilus) 、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens) 、枯草芽孢杆菌(B. subtilis) 、B. firmus、B. mycoides、B. circulans、等促 进蓝桉树(Eucalyptus globulus)插条生根及细根的生长发育(Katy, et al., 2009) 。从水稻根 际分离筛选的一株植物根际促生细菌 CBMB205T,不同于已有的芽孢杆菌,经分类研究建 立了新种 B. methylotrophicus(Madhaiyan, et al., 2010) 。B. thioparus NII-0902 是从印度西部 森林分离的一株 PGPR,表现出多种植物促生活性,具有溶磷、产生吲哚乙酸(IAA)、铁载 体和氢氰酸(HCN)的能力(Deepa, et al., 2010)。B. simplex RC19 是一株产生吲哚乙酸的 植物根际促生细菌, 用于处理猕猴桃插条, 表现出显著地促进生根及根系生长的效果 (Erturk, et al., 2010) 。蜡样芽孢杆菌(B. cereus)L254、B. simplex L266 和 Bacillus sp.L272a 产生的 VOCs 能够促进拟南芥根生长、改变根构型(Gutiérrez-Luna, et al., 2010) 。 类芽孢杆菌(Paenibacillus)也是植物根际普遍存在的一类芽孢杆菌。报道最多的是多粘 类芽孢杆菌(P. polymyxa) ,已从玉米、小麦、大麦、白三叶、黑麦草、冰草、绿豆、大蒜、 辣椒、烟草、黑松、花旗松等多种植物根际,发现许多促进植物生长、抑制土传植物病害或 具有生物修复作用的多粘类芽孢杆菌 PGPR 菌株。某些多粘类芽孢杆菌 P. polymyxa 菌株具 有生物固氮能力; 有些菌株产生 IAA、 细胞分裂素等植物激素; 更多的菌株产生 fusaricidins、

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多粘菌素(polymyxin) 、polypeptin、jolipeptin、gavaserin、saltavalin 等抗生素;有些菌株能 够引起植物产生诱导系统抗性(induced system resistance,ISR) ;一些菌株能使植物产生诱导 系统耐受性(induced system tolerance, IST)等。Paenibacillus alvei K165 分离自番茄根际, 对黄萎病菌微菌核(Verticillium dahliae microsclerotia )有抑制作用(Antonopoulos, et al., 2008) 。Paenibacillus sp. B2 产生的抗真菌脂多肽 paenimyxin 能诱导蒺藜苜蓿( Medicago truncatula)对锐顶镰孢菌(Fusarium acuminatum)的系统抗性。用不同浓度的 paenimyxin 处理苜蓿根 24 小时,低浓度(ca. 1 ?M) 的 paenimyxin 即可诱导苜蓿的防卫反。用半定量 RT-PCR 检测蒺藜苜蓿根的基因应答情况发现,与植物抗毒素(phytoalexins) (phenylalanine ammonia-lyase, chalcone synthase , chalcone reductase)生物合成基因、抗真菌活性(发病相 关蛋白、几丁质酶)或细胞壁(转化酶) 相关基因的表达大幅上调(Selim, et al., 2010) 。新近 报道了一个类芽孢杆菌的新种 P. riograndensis sp. nov,其模式菌株 SBR5T 分离自小麦根际, 具有固氮能力、产生吲哚乙酸和铁载体(Beneduzi, et al., 2010) 。 假单胞菌 (Pseudomonads) 是植物根际普遍存在的一类革兰氏阴性细菌, 假单胞菌 PGPR 的研究最为广泛深入。 已经从各种植物根际分离筛选了大量的具有植物促生和生防作用的假 单胞菌。用荧光假单胞菌(P. fluorescens)和恶臭假单胞菌(P. putida)处理马铃薯(Solanum tuberosum L.) 种块,使土豆增产 14-33%。用荧光假单胞菌(fluorescent pseudomonads)对 萝卜种子(Raphanus sativus L.)浸种处理,使萝卜鲜重大福增加。用 7 株荧光假单胞菌接种甜 菜(Beta vulgaris L.)进行田间试验,甜菜幼苗、成熟跟种及总糖产量显著增加。在温室条件 下, 三种不同类型土壤上,均表现出玉米茎干重的显著增加。几个假单胞菌分离物表现出良 好的溶磷或解磷效果。恶臭假单胞菌(P. putida)和 P. mendocina 的某些菌株能够以肌醇六 磷酸作为唯一碳源和磷源。某些荧光假单胞菌产生高活性的植酸酶(phytase),对肌醇六磷酸 的分解率高达 81%。在田间试验中,用具有溶解过磷酸钙活性的 Pseudomonas sp.24 接种, 60 天后玉米株高显著增加,莴苣茎鲜重增加 18%。一些假单胞菌对植物的有益影响主要归 功于其促进植物生长、防治植物病害作用。恶臭假单胞菌(P. putida) GR12-2 产生的吲哚乙酸 (IAA)促进莴苣(Brassica rapa)根系发育, IAA 缺失突变株进行试验, 用 其莴苣根长度比野生 型处理降低了 35-50%。IAA 可能直接促进植物细胞的伸长和细胞分裂、或间接影响细菌自 身的氨基环丙烷 (ACC) 脱氨酶活性。ACC 是植物合成乙烯的直接前体物质,GR12-2 等菌 株能产生 ACC 脱氨酶, 分解 ACC、降低植物体内乙烯水平、解除乙烯对植物生长的抑制。 荧光假单胞菌(P. fluorescens)G20-18 菌株产生大量的细胞分裂素(包括异戊烯基腺苷、 反玉米素核苷和双氢玉米素核苷) 用细胞分裂素合成缺失突变株进行的试验证实了 G20-18 。 菌株产生的细胞分裂在其植物促生能力方面的重要作用。 许多假单胞菌具有良好的生物防治 效果。 荧光假单胞菌 P. fluorescens ) ( 和恶臭假单胞菌 (P. putida 是镰刀菌枯萎病 (fusarium wilts)生物防治的主要候选菌株。产生抗生素、铁载体和氢氰酸(HCN)等代谢产物是假单胞 菌主要的生防机制。铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)PAO1 产生的 HCN 能杀死秀丽杆线虫

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(Caenorhabditis elegans) 。铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)78 产生的一种热不稳、对 pH 高 度敏感的极性物质能杀死爪蛙根结线虫(Meloidogyne javanica)幼虫。一些铜绿假单胞菌在限 铁条件下产生铁载体(siderophore) ,有效抑制腐霉(Pythium spp. ) (许多作物猝倒病和根 腐病的病原菌) 。一些假单胞菌通过产生各种抗生素,抑制植物病害。荧光假单胞菌(P. fluorescens)CHAO 产生多种生物活性物质,如抗生素、铁载体、HCN、吲哚乙酸等。CHAO 菌株 产生 2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4diacetylphloroglucinol,DAPG)是其抑制小麦全蚀病 和烟草黑根腐病的重要机制。洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)产生一种新奇的 脂肽类抗生素(AFCBC11) 对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的棉花猝倒病具有显著防 治效果。许多假单胞菌刺激植物产生诱导系统抗性(ISR),提高植物抵抗各种病虫害能力。 在加拿大, 假单胞菌 (Pseudomonas spp.) 已经开发成用于温室水培系统控制腐霉病 (Pythium disease)的生防制剂。在春季黄瓜种植中,与对照相比,接种 P. corrugata 13 和荧光假单胞 菌(P. fluorescens) 15 菌株,可上市黄瓜产量提高 88% ;在秋天黄瓜种植中,由于高温导致 病害严重,用这两个菌株接种处理的可上市黄瓜产量比对照提高 600%。在未发病情况下, 荧光假单胞菌(P. fluorescens)15 菌株也能明显提高黄瓜产量。恶臭假单胞菌(P. putida)有效 抑制 Helminthosporium solani 引起的马铃薯银翘病(Siddiqui, 2006) 。 大量温室和大田试验结果表明,许多PGPR菌株在温室、大田条件下表现出明显的促进植 物生长、 防治土传病害、 提高植物对非生物胁迫的抗逆性、 促进土壤生物修复等效果。 PGPR 是根治作物连作障碍(重茬病)的有效途径之一。 1.2 PGPR在植物根面的定植 在植物根面的定植 位于根表皮上的细菌通常被一层粘液层(mucigel layer)所覆盖。采用改进的扫描电镜方 法,使这粘液层显现半透明状态,就可以观察到的根面上的细菌。采用不同颜色的荧光蛋白 (green fluorescent protein,GFP)基因标记,就可以使不同菌株的所有细胞可视化。一种 monoaxenic系统(monoaxenic system)的建立,推动了对于根面微生物定植机制的研究。以 一株具有很强根面定植能力的荧光假单胞菌(P . fluorescens)WCS365作为模式菌株,用一种 或两种细菌包被种子或幼苗, 然后种栽于monoaxenic系统的无菌沙子和无碳源的植物营养液 中,根分泌物作为唯一碳源,培养7d后分析不同根段表面细菌定植情况。发现不同根段表面 WCS365数量分布差异很大,靠近根基部的根面细菌达106 CFUs/ cm,而根尖附近的根面只 有102 - 103 CFUs/ cm。这一菌数变化的时间进程表明,WCS365首先在种皮表面进行增殖, 随着根的不断延伸,细菌随之逐渐定植于根面。由单个细胞生长繁殖形成小菌落 (microcolonies);许多小菌落构成生物膜 ,生物膜通常由多层细菌组成,而且被粘液层 (mucous layer)覆盖。 采用monoaxenic system 鉴定与细菌竞争性根尖定植相关的基因及特性。WCS365 野生 型菌株和非营养缺陷的Tn5随机转座突变株进行根尖定植对比试验。在沙培试验中表现定植 能力缺陷的突变株, 在盆栽试验中也表现出相同的特性。 对突变株进行遗传学和生理学分析

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发现,菌株在番茄根尖的主要竞争性定植特性似乎是其运动性(motility);对根的附着 (adhesion to the root);依赖根分泌物的高生长速率(high growth rate in root exudate); 氨 基酸、尿嘧啶和维生素B1合成;脂多糖O-抗原侧链的存在;ColR/ColS双组分感应系统;腐 胺吸收系统精细调节 (fine-tuning of putrescine uptake system) (突变株的pot操纵子缺损); 位 点专一性重组酶Sss或XerC;nuo操纵子(NADH:泛醌氧化还原酶缺陷);与蛋白分泌途径相 关的secB;以及III型分泌系统(TTSS)(Lugtenberg & Kamilova, 2009)。 运动性(Motility)和对根分泌物(root exudate) 的趋化性(chemotaxis)是细菌的重要定 植特性。 经鉴定, 番茄根分泌物中WCS365的主要化学引诱物 (chemoattractants) 是氨基酸(尤 其是L-亮氨酸) 和二羧酸(dicarboxylic acids)。糖没有化学引诱物活性。在番茄根际,苹 果酸和柠檬酸在一定程度上也可能是该菌株的重要化学引诱物。在拟南芥(Arabidopsis thaliana) 根分泌物中,苹果酸内酯(l-malate)似乎是生防枯草芽孢杆菌(B. subtilis) FB17 菌株的主要化学引诱物(chemoattractant)(Rudrappa, et al., 2008 )。当与野生型菌株同时培 养时,WCS365的ColR/ColS 双组分系统缺失的番茄根竞争性定植突变株在根分泌物中生长 速率受到明显影响。而且,该突变株对能与脂多糖(LPS)特异性结合的抗生素多粘菌素B高 度敏感;与野生型菌株相比,突变株对其他供试抗生素的耐药性则更高。colR/colS 基因对 位于下游的甲基转移酶/wapQ操纵子具有调控作用。甲基转移酶基因和磷酸酶基因的单个突 变均能引起竞争性定植能力受损;wapQ编码可能的庚糖磷酸酶。据此推测,甲基转移酶和 磷酸酶对LPS具有修饰作用,影响其与外膜空蛋白的相互作用。LPS甲基、磷酸基团的缺乏 导致膜孔径缩小。突变株LPS的修饰解释了其在根分泌物中低生长速率和竞争性定植能力受 损以及对polymyxin B更敏感的原因。荧光假单胞菌(P. fluorescens) SBW25 的TTSS hrcD 和 hrcR 双突变株在番茄根尖定植能力方面受损,而单个突变则不受影响。由于突变株在种子 和根上的吸附能力并没有受到影响,据此推测,SBW25的TTSS可能将其针状物推进植物根 皮层细胞的细胞质中吸取植物汁液。事实上,中空针状物的注射可能是TTSS的第一功能。 TTSS 在根际竞争中发挥作用这一结论与其它研究结果是一致的,如当hrcC 发生突变时, 恶臭假单胞菌(P. putida)KD对番茄Fusarium 和黄瓜Pythium的生防能力就会丧失。鉴于许 多基因似乎与细菌在根系的竞争性定植有关, 对于竞争性定植基因及特性的研究是十分艰巨 的,这就要求采用基因组学的方法,以对细菌在植物根系定植进程有更加全面深入的理解。 1.3 PGPR的直接促生机制 的直接促生机制 1.3. 1 提供植物营养物质 1) 生物固氮作用:在氮素贫瘠的土壤上,根际联合固氮菌提供植物氮素营养。在非豆科 作物根际, 普遍存在联合固氮菌, 如固氮螺菌 (Azospirillum sp.) 固氮弓菌 、 (Azoarcus sp.) 、 固氮菌(Azotobacter sp.)、多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa)、伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)、 蓝细菌(Cyanobacteria)、Gluconacetobacter diazotrophicu、草螺菌(Herbaspirillum sp.)等。 值得注意的是,大量研究证实,联合固氮菌对植物生长的促进作用,主要是由于这些固氮菌

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能够促进植物根系发育,促进植物对水分和矿质养分的吸收利用所致。 2 ) 提高植物根际养分的可利用性:(1)促进可溶性磷的释放。虽然土壤中含有丰富的 磷元素,但主要以难溶性的形式存在,能被植物吸收利用的可溶性磷是非常有限的,植物只 能吸收H2PO4?和HPO42?。植物根际普遍存在溶磷、解磷细菌,能够溶解土壤中的无机磷酸 盐或分解有机磷化合物,释放可溶性磷,促进植物生长。非特异性的磷酸酶、植酸酶、 phosphonatases和C-P 裂解酶分解土壤中的相应有机磷化合物,释放可溶性磷。C-P裂解酶催 化organophosphonates C-P键的断裂。无机磷酸盐中可溶性磷的释放与有机酸(如葡萄糖酸) 的形成有关。(2)促进植物对铁离子的吸收。土壤中的铁主要以难溶性的Fe3+形式存在,很 难被作物吸收利用。有研究表明,某些PGPR产生的铁载体(siderophores)能够螯合三价铁 离子,形成Fe3+-siderophore复合物;许多植物具有吸收Fe3+-siderophore复合物的能力;在石 灰性土壤上,细菌铁载体螯合铁对于植物的铁营养是至关重要的。(3)锌及其他微量元素的 吸收。 3) 增强其它有益的共生作用。 在许多情况下, PGPR 作为 “助手” ( 细菌 “helper”bacteira) , 协同其它有益的共生关系。 (1)促进豆科植物-根瘤菌之间的共生;(2) 促进植物-菌根真菌 之间的共生。 4) 复合促生作用(combination of modes of action) 。绝大多数情况下,一个 PGPR 菌株同 时具有几种促生作用;在相同植物根际也同时存在多种具有不同促生作用的 PGPR。 1.3. 2 产生植物生长调节物质(Phytostimulators) 产生植物生长调节物质( ) 研究表明,多种 PGPR 通过产生植物激素、ACC 脱氨酶、挥发性物质(volatiles)等促 进植物生长。许多 PGPR 菌株能够促进植物根生长、改变根形态,增加根长度、根毛数、侧 根数、重量及表面积,对于植物吸收养分和水分具有显著影响。 1) 生长素(Indole-3-acetic acid,IAA) :维罗纳气单胞菌(Aeromonas veronii)、农杆菌 (Agrobacterium sp.)、巴西固氮螺菌(A. brasilense)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)、 食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、豌豆根 瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、Alcaligenes piechaudii等通过产生生长素,促进根生长、 增加根长度及根表面积。PGPR生长素通常是以根分泌物中的色氨酸为底物进行合成的。不 同植物根分泌物中色氨酸浓度具有很大差异,因此当用一种PGPR菌株接种不同植物时,促 生效果也表现出明显的差异。 如用产生生长素的荧光假单胞菌 (P. fluorescens ) WCS365 分 别接种黄瓜、甜椒、番茄和萝卜,并不能带来黄瓜、甜椒、番茄根和芽重量的增加,但使萝 卜根重量显著增加。 每棵萝卜幼苗根分泌物色氨酸浓度至少9倍于黄瓜、 甜椒、 番茄(Kamilova, et al., 2006 )。 2) 细胞分裂素(Cytokinin):多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa)、 荧光假单胞菌(P. fluorescens)、豌豆根瘤菌(R. leguminosarum)等通过产生细胞分裂素(Cytokinin),促进 根细胞分裂及增大和组织膨大,增加根表面积。

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3) 赤霉素 (Gibberellin, GA) 某些芽孢杆菌 : (Bacillus sp.) 如短小芽孢杆菌 , (B. pumilus) 、 地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)等通过产生赤霉素(Gibberellin,GA) ,促进植物形态的改 变。 4) ACC 脱氨酶:许多 PGPR,如产碱杆菌(Alcaligenes sp.)、短小芽孢杆菌(B. pumilus)、 阴沟肠杆菌(E. cloacae)、洋葱假单胞菌(P. cepacia)、恶臭假单胞菌( P. putida )、 Variovorax paradoxus 等能够产生 ACC 脱氨酶(1-氨基环丙烷-1-羧酸酯脱氨酶),裂解植物 体内乙烯合成的直接前体物质—1-氨基环丙烷-1-羧酸酯(ACC),降低植物根乙烯的合成, 解除乙烯对根的抑制作用;进一步研究发现,在淹水、干旱、重金属污染等逆境条件下, ACC 脱氨酶的促生作用尤其明显。 5)挥发性物质 (volatiles) 许多PGPR, : 如枯草芽孢杆菌 (B. subtilis) ,解淀粉芽孢杆菌 (B. amyloliquefaciens)和 阴沟肠杆菌(E. cloacae)等, 通过释放挥发性物质促进植物生长(Ryu, et al., 2003 )。2,3-丁二醇(2,3-butanediol)和3-羟基-2-丁酮(乙偶姻) (acetoin)是最有代表 性的两种挥发性物质。如果枯草芽孢杆菌(B. subtilis),解淀粉芽孢杆菌 (B. amyloliquefaciens)的2,3-丁二醇和3-羟基-2-丁酮生物合成被阻断,则失去植物促生活性。枯 草芽孢杆菌(B. subtilis)GB03 产生的挥发性物质具有植物能量捕获调节物的作用,通过抑 制植物内源葡萄糖感应信号和降低脱落酸水平,提高拟南芥(A. thaliana)光合作用效率和 叶绿素含量(Zhang, et al., 2008)。 6)辅因子pyrrolquinoline quinone (PQQ):PQQ 是一种植物生长促进剂。在植物体内PQQ 作为 作为一种抗氧化剂。但是也不能排除其间接促生效果,因为PQQ 一些酶的辅因子,如 与抗真菌活性和诱导系统抗性有关酶的辅因子。 7)其它生长调节物质:此外,某些PGPR菌株通过增加根呼吸速率促进根系生长。 1.3. 3 植物根际生物修复剂(Rhizoremediators) 植物根际生物修复剂( ) 细菌对土壤污染物的降解面临的问题是其很难适应非根际土壤环境, 因为当应用于非根 际环境时,降解菌初级代谢依赖污染物的降解获取能量,很快就会处于饥饿状态而死亡,进 而对污染物降解效率很低。 一种很有前景的解决问题策略就是把细菌初级代谢所需能量和污 染物降解所需能量分开。为此目的,Kuiper等开发了一种根际生物修复系统 (rhizoremediation)。他们的策略是筛选降解污染物根际细菌,以便其利用植物根际分泌物 作为主要营养源。 他们开发了一种有效富集这类根际细菌的系统, 以草根粗混合物作为接种 源开始, 然后进行利用污染物生长和根际有效根际定植之间的交替筛选。 获得了一株有效利 用根际分泌物、又能降解根际污染物naphthalene的恶臭假单胞菌(P. putida)PCL1444, 保 护植物免受naphthalene的杀伤。 1.3. 4 环境胁迫调节剂 胁迫调节剂(Stress Controllers) 调节剂 PGPR产生的ACC脱氨酶通过裂解乙烯前体、转化为2-氧丁酸(2-oxobutanoate)和NH3, 降低植物体内乙烯水平。ACC脱氨酶还可解除植物病原细菌、多环芳烃碳氢化合物、重金

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属Ni2+ 和Ca2+ 、盐、干旱及淹水等生物和非生物压力对植物的危害(Glick, et al., 2007 )。 1.4 PGPR生防机制 生防机制 植物生产中,由各种病害引起的经济损失达 2000 亿美元/年以上。通常,利用抗病品种 和化学农药来控制植物病害。抗病品种一般都具有针对性、并不能防治所有病害;而且抗病 品种的选育过程一般需要多年时间。 此外, 人们对遗传工程抗性品种的接受仍然是一个十分 敏感的问题。 消费者对化学农药使用带来的负面作用越来越关注, 逐渐受到政府政策的限制。 利用微生物防治植物病害是生物防治(biological control、biocontrol)的重要形式之一,是 一种环境友好型的防治方法。 许多微生物是植物病原菌的天敌, 而且其产生的拮抗性次级代 谢产物等能够非常容易接近其作用位点,如植物表面等。与之相反,绝大多数化学农药分子 不易到达其植物相应的作用部位。此外,与许多化学农药相比,生物源分子是生物可降解性 的。 生物防治不仅用于控制植物生产过程中的病害而且用于控制农产品采后病害。 有关根际 细菌防治植物病害的研究主要集中于植物病原菌的控制, 值得关注的是, 也有一些利用根际 细菌防治杂草和害虫的报道(P?echy-Tarr, et al., 2008 )。 微生物在土壤健康的恢复和维持方面具有至关重要的作用, 根据病原菌是否引起植物病 害,将土壤分为两种类型:(1) 利病性土壤 (disease-conducive soils, conducive soils),又称 “感病土壤”或“无效土壤”。是指病原菌能够正常存活、生长繁殖、不断扩散,并引起植 物发生严重病害的土壤。(2) 抑制性土壤(disease-suppressive soils,suppressive soils),“抑 病土壤”、“抑菌土壤”、“抗病土壤”或“衰退土壤”等。是指尽管存在致病性病原菌,但一些 土著性微生物保护易感作物免受病源危害的土壤(Kyselkova?, et al., 2009 )。目前在世界各地 已发现一些自然发生的细菌控制植物病害的土壤, 通常是在土质、 作物品种等条件相似的地 块, 抑制性土壤和利病性土壤并存的情况。 将少量的抑制性土壤与大量得利病性土壤混合后, 可以使利病性土壤转变为抑制性土壤。植物病害的微生物防治(Microbial control)是一个复 杂的过程,不仅涉及生防微生物、病原菌和植物,而且还与土著性微生物区系(indigenous microflora)、大型生物区系(macrobiota)(线虫、原生动物等)和植物栽培基质(土壤、蛭 石等)有关。为使 PGPR 更有效地发挥作用,必须理解其各种作用机制。 1.4.1 拮抗作用(Antagonism) 拮抗作用( ) 植物根际促生细菌通过产生抗生素抑制或杀死植物病原菌。 如果抗生素合成结构基因 发生缺失突变, 突变株的生防效果就会丧失。 拮抗性的生防 PGPR 要想获得良好的生防效果, 不仅必须合成并释放抗生素, 而且要与根际环境中的其他生物在营养和生态位等方面具有竞 争优势、以便使抗生素扩散到整个根系。PGPR 还应尽量逃避植物根际食细菌原生动物的捕 食。此外,PGPR 应该能够在根面相应的微生态位(microniche) 产生抗生素。目前,在拮抗 性的革兰氏阴性生防细菌中已经鉴定的抗生素包括:氢氰酸(HCN)、吩嗪(phenazines) [ 主 要 是 吩 嗪 -1- 羧 酸 ( phenazine-1-carboxylic acid ) 和 吩 嗪 -1- 甲 酰 胺

(phenazine-1-carboxamide)]、2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol,DAPG) 、

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藤黄绿脓菌素( pyoluteorin, PLT)、 硝吡咯菌素 (pyrrolnitrin) D-葡萄糖酸 、 (D-gluconic acid )、 2-己基-5-丙基间苯二酚(2-hexyl-5-propylresorcinol)、环脂肽(cyclic lipopeptide,CLP)等。 枯草芽孢杆菌(B. subtilis)产生的脂肽类生物表面活性剂(lipopeptide biosurfactants )[表面活 性素(Surfactin) 、伊枯草菌素 A(iturin A)、杆菌霉素 D(bacillomycin D) 、抗霉菌枯草杆菌 素 (mycosubtilin) 丰原菌素 、 (Fengycin) 二肽芽孢菌溶素(Bacilysin)、 、 Rhizocticins]( Ongena, et al., 2007;Kim, et al., 2010)、肽类硫醚抗生素[枯草菌素(Subtilin)、Ericin、Mersacidin、 Sublancin、Subtilosin A]、聚酮类抗生素 bacillaene)(Butcher, et al., 2007 )、氨基糖苷类抗生 素 3, 3'-neotrehalosadiamine、磷脂类抗生素 Bacilysocin、Amicoumacin。解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens) 产生的抗生素主要有: Surfactin、 Bacillomycin D、 Fengycin、 Bacillibactin、 Bacilysin/anticapsin、Macrolactin、Bacillaene、Difficidin 等(Chen, et al., 2007 )。蜡样芽孢杆 菌(B. cereus)产生 Zwittermicin A 和卡糖胺(kanosamine)。短小芽孢杆菌(B. pumilus)产 生 pumilacidin 等。 短短芽孢杆菌 (B. brevis ) 主要产生两种类型的抗生素, 分别为 tyrocidine 和 gramicidin 。 多 粘 类 芽 孢 杆 菌 ( Paenibacillus polymyxa ) 产 生 的 抗 生 素 主 要 有 fusarisardins(Choi, et al., 2008)、polymyxin(Choi, et al., 2009)等。芽孢杆菌(Bacillus spp.)产 生的某些挥发性物质(Volatiles),如 2,3-丁二醇(2,3-butanediol)等也与生防菌的拮抗作 用有关(Ryu, et al., 2003 )。 已经从假单胞菌(Pseudomonas) 、芽孢杆菌(Bacillus)等属的 PGPR 菌株中克隆了 许多与生防(拮抗)相关的基因,部分基因的功能已经阐明。克隆了荧光假单胞菌(P. fluorescens ) DAPG 生物合成基因簇 phlABCD、 的 Pyoluteorin 生物合成基因簇 pltLABCDEFG 和 Pyrrolnitrin 生物合成基因簇 prnABCD 等。DAPG 生物合成基因簇包括 phlABCD;在其下 游有一个 phlE,编码可能的跨膜渗透酶,与 DAPG 抗性有关。phlA 附近,phlF 和 phlH 编 码两个与 DAPG 生物合成有关的类四环素抗性阻遏蛋白(TetR) PhlF 与 phlA 启动子特异 。 性结合位点相互作用;DAPG 是 PhlF 与 phlA 启动子解离的信号,因此自诱导其自身合成; 在荧光假单胞菌(P. fluorescens )CHA0 中, phlH 与 DAPG 生物合成的途径特异性控制有 关,但尚不清楚其具体机制。 除上述特异性调节蛋白基因外,在 phlF 和 phlH 之间还有一 个 phlG, 编码 DAPG 水解酶,可能是控制 DAPG 水平的一个有效替代。作为对环境信号和 其自身细胞生理状况的应答,许多全局调控因子也直接或间接地影响 DAPG 的生物合成。 双组分调控系统 GacS/GacA 可能直接或间接地对 DAPG 生物合成进行政调控。细胞内持家 因子 RpoD、 胁迫应答因子 RpoS 以及 RpoN 也可能影响 DAPG 的生物合成。此外,许多 生物和非生物环境因素也可能调节 DAPG 合成水平,包括碳氮源、过渡金属离子和其他矿 物质、以及细菌、真菌和植物释放的代谢物。例如,在荧光假单胞菌(P. fluorescens )CHA0 和 Pf-5 菌株中,DAPG 生物合成受到另一种抗真菌抗生素 pyoluteorin 的负调控。细菌和植 物代谢物水杨酸(salicylate) 、以及真菌致病因子萎蔫酸(fusaric acid) 强烈地抑制 DAPG 的 合 成 。 从 铜 绿 假 单 胞 菌 ( P. aeruginosa ) 中 克 隆 鉴 定 了 Phenazine 生 物 合 成 基 因 簇

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phzABCDEFG 和 phzO。从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中克隆鉴定了 IturinA 生物合成 基因簇 ituDABC、 Mycosubtilin 生物合成基因簇 mycABC、 surfactin srfA 操纵子 (srfAA, srfAB, 、 、 srfAC 和 srfAD)等。从解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)中克隆鉴定了 Bacillomycin D 生物合成基因簇 bmyDABC(Koumoutsi, et al., 2007) 。新近,克隆鉴定了多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa) FusaricidinA 生物合成基因 fusA((Choi, et al., 2008; & Jensen, 2008)和 Polymyxin Li 生物合成基因簇 pmxABCDE((Choi, et al., 2009)。 1.4.2 产生水解酶 许多 PGPR 菌株通过分泌水解酶,破坏病原真菌的细胞壁。如 Streptomyces plymuthica C48 产生的几丁质酶抑制番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea )孢子萌发及芽管的延伸。粘质沙 雷氏菌产生几丁质酶(Serratia marcescens)是其抑制 Sclerotium rolfsii 的关键。类芽孢杆菌 (Paenibacillus sp. )300 菌株和链霉菌(Streptomyces sp.)385 菌株也是通过产生几丁质酶 抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum) 。斯氏假单胞菌(P. stutzeri)产生 几丁质酶和昆布多糖酶消化裂解枯萎病菌(F. solani)的菌丝。S. plymutica IC14 产生的蛋 白酶与其对 S. sclerotiorum 和 B. cinerea 的抑制有关。类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)300 菌 株和链霉菌(Streptomyces sp.)385 菌株产生的β-1,3-葡聚糖酶裂解 F. oxysporum f. sp. Cucumerinum 的细胞壁。 这些水解酶的合成受到 GacA/GacS 或 GrrA/GrrS 的调节 (Compant, et al., 2005) 。 1.4.3 信号干扰(Signal interference) 号干扰( ) 许多细菌只有在高细胞密度时才表达致病性/毒力因子。细胞密度变化被群体感应分子 (quorum-sensing molecules),如酰基-同型高丝氨酸内酯(Acyl-homoserine lactones,AHLs) 所感知,随着细胞密度增高,群体感应分子不断积累,当积累到一定水平时,通过信号传递 调控有关基因的表达。信号干扰是基于AHL降解的一种生防机制, 例如,B. thuringiensis 通 过AHL内酯酶(lactonases)水解AHL的内酯环,或通过AHL酰化酶(acylases)打开酰胺键。 近期研究表明,AHL酰化酶影响生物膜的形成(Shephard & Lindow, 2008)。病原菌生物膜 形成的缺陷可能使生防更容易些。 1.4.4 诱导系统抗性(Induced systemic resistance,ISR) 诱导系统抗性( , ) 某些PGPR与植物根相互作用能够使植物产生对病原细菌、真菌和病毒的抗性,这种现 象称为诱导系统抗性。ISR 与人的自然免疫有许多相似的特点。ISR 的产生依赖于植物体 内茉莉酸(jasmonic acid )和乙烯信号传导。 许多细菌代谢物及其组分,如脂多糖(LPS)、 水杨酸(salicylic acid)、铁载体(siderophores)、环脂肽(cyclic lipopeptides)、2,4-二乙 酰基间苯三酚(DAPG)、酰基同型高丝氨酸内酯(AHLs)、某些挥发性物质(volatile) 以及鞭毛蛋白等能够诱导植物植物产生ISR。与其他多数生防机制需要生防细菌具备根际竞 争优势不同, ISR 并不需要生防细菌在根系广泛定植。一个定植能力很差的生防细菌不可能 通过拮抗机制防治病害, 因为生防细菌在根际的定植过程实际上就是沿着根系进行的抗生素

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分配运输系统。因此,一株定植能力很差的拮抗性生防蜡样芽孢杆菌(B. cereus)却表现出 良好的生防效果是令人疑惑的。然而,近期研究发现,某些抗真菌代谢物(antifungal metabolites,AFMs) 能够诱导ISR解释了上述现象。据此推测,许多生防芽孢杆菌具有良好 的生防效果可能是通过ISR机制而不是拮抗机制发挥作用。 如枯草芽孢杆菌 (B. subtilis) FB17 生防作用既是通过ISR机制。 Weert等报道, De 一株通过ISR机制防治病害的荧光假单胞菌 (P. fluorescens)WCS365对番茄根分泌物主要成分柠檬酸表现出很强的趋化性(Van Loon, 2007)。 1.4.5 竞争营养和生态位(Competition for nutrients and niches,CNN) 竞争营养和生态位( , ) 生防根际细菌与病原菌竞争植物根际营养物质和生态位作为一种可能的生防机制已经 提出了数十年,但尚缺乏足够的实验证据。Kamilova 等认为,如果这种机制确实存在,那 么这类生防细菌就能筛选出来(Kamilova, et al., 2005)。为此目的,他们将植物根际细菌的 混合物接种于表面消毒的种子上,然后在一个无菌系统中进行培养催芽;1周后,将幼苗根 尖上的细菌洗下来,然后接种于新鲜的种子上进行下一轮的富集循环;三次循环后,分离出 来的细菌具有与模式菌株荧光假单胞菌(P. fluorescens )WCS365 相同的、甚至更好的竞 争性定植能力。结果表明,绝大多数分离物都能控制TFRR(tomato foot and root rot);突变研 究进一步证实了这种生防机制的正确性。然而,Kamilova et al.观察到一株具有很强根尖竞 争性定植能力的细菌对TFRR并没有表现出生防效果,这意味着对于生防细菌,仅仅在根上 定植是不充分的。Pliego等的研究解释了这一现象,他们分离了3株具有相似根际定植能力 的细菌, 其中只有一株表现出对鳄梨根腐病具有生防效果; 研究发现两个菌株定植于根的不 同部位,生防细菌必须准确地定植于根上相应的微生态位(mininiche)才能发挥其生防效果 (Pliego, et al., 2008)。 1.4.6 竞争Fe3+铁离子(Competition for ferric iron) 竞争 铁离子 在Fe3+较低的环境中,某些根际细菌产生大量的高亲和性铁载体,螯合环境中的Fe3+形成 siderophore-Fe3+复合物,造成真菌病原菌铁饥饿,抑制其生长。 1.4.7 捕食和寄生(Predation and parasitism) 捕食和寄生( ) 捕食和寄生是木霉(Trichoderma sp.)等生防真菌的主要生防机制,基于对真菌病原菌 细胞壁的酶解破坏。目前还没有在细菌中发现该类机制。即使食真菌的Collimonas fungivorans可能也是利用营养和生态为竞争(Competition for nutrients and niches、CNN)而 不是捕食和寄生作为其对TFRR的防治机制。 1.4.8 解毒作用(Detoxification and degradation of virulence factors) 解毒作用( ) 解毒作用也是 PGPR 的重要生防机制(Compant, et al., 2005)。如某些 PGPR 菌株能够 解除 Xanthomonas albilineans 产生的 albicidin 毒素。解毒机制包括: (1)产生与病原菌毒素 可逆结合的蛋白质; (2)产生酶类降解病原菌毒素。 1.4.9 干扰病原菌的活性、生存、萌发及孢子形成 干扰病原菌的活性、生存、

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病原真菌 Forl 菌丝分泌的萎蔫酸(fusaric acid)对生防荧光假单胞菌(P. fluorescens ) WCS365 细胞具有化学引诱剂作用。在对 TFRR 进行的生防试验中, WCS365 大量地定植于 Forl 菌丝上,形成微菌落(microcolonies)。 生防细菌在病原真菌菌丝上的定植可能减弱 了病原菌的毒力。扫描电镜观察发现,当用根分泌物进行培养时 WCS365 也定植于 Forl 菌 丝上。采用不同培养基进行试验,结果表明,培养基越贫瘠,生防菌在病原菌丝上的定植量 越大。这一研究结果支持了早期提出的观点:生防菌定植于病原菌丝以作为营养源。当利用 根分泌物进行培养时,Forl 小分生孢子萌发;同时接种 WCS365,孢子萌发过程受到抑制, 可能由于生防菌争夺营养所致。在根分泌物中,Forl 菌丝生长发育形成小分生孢子, 小分生 孢子随环境传播扩散;WCS365 减少孢子的形成,进而降低病原菌的传播。总之,生防荧光 假单胞菌 WCS365 抑制病原真菌活性、生存和孢子萌发;在菌丝上定植,抑制新孢子的形 成(Lugtenberg & Kamilova, 2009)。 1.5 PGPR 功能基因组学和生物信息学研究 2005 年美国完成了第一个 PGPR 菌株 Pseudomonas fluorescens Pf-5 的基因组测序工作 (Paulsen, et al., 2005) 。近年来,美国、德国、英国、韩国、中国等国家相继开展了几个具 有良好研究基础的 PGPR 菌株的基因组测序工作, 这些菌株包括: 枯草芽孢杆菌 (B.subtilis) 168 、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)FZB42、荧光假单胞菌(P. fluorescens) Pf-5、 荧光假单胞菌(P. fluorescens) SBW25、荧光假单胞菌(P. fluorescens)PfO-1、多粘类芽孢杆 菌(P. polymyxa)E681、多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa)SC2、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)AMMD、放射土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)K84 、巴西固氮螺菌(A. brasilense) 、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis) Herbaspirillum seropedicae 等。这些基因 、 组数据为揭示 PGPR 作用机制、 寻找新的生物活性化合物等提供了强有力的支持。 2009 年, 加拿大 Glick B.、韩国 KimY.C.相继开展了 PGPR 菌株的蛋白质学研究。 1.6 PGPR 制剂的开发及产业化 制剂的开发及 目前,已在美国、加拿大等北美地区和印度、中国等亚洲地区开发出了一些 PGPR 制剂, 并进行了大规模生产、 注册登记及推广应用。 在重组 PGPR 的构建和风险评估方面也取得了 重要进展。

2 PGPR 主要研究进展
2.1 根际微生物生态学新进展 2.1.1 自诱导信号化合物介导的根际微生物相互作用

N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)是许多革兰氏阴性根际细菌产生的自诱导信号化合物, 诱导植物做出各种不同应答,提高植物细胞生理适应效率。AHLs 是微生物之间、以及 微生物与植物之间进行信号通信的分子基础。 C6-和C8-酰基高丝氨酸内酯能够诱导番茄 产生系统抗性,而对于拟南芥则具有调节植株体内激素平衡、刺激根系生长的作用。有 趣的是,C8-和C10-AHLs 能被某些植物(拟南芥、玉米和大麦)根吸收、甚至可以运
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输到植物茎内;然而,却不能进入大多数豆科植物的茎内,因为在植物根内就被内酯酶 有效降解。某些植物产生和分泌AHL类似物,干扰根际细菌的AHLs信号,因为许多病 原细菌也是利用自诱导剂或群体感应信号化合物对植物进行攻击。最近发现,革兰氏阴 性细菌中含有经过修饰的AHL信号物质,其酰基侧链被源自植物的香豆酸所取代。发现 放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)产生coumaroyl-AHLs, 与植物促生真菌Piriformospora indica.密切相关。目前为止,尚不清楚根际细菌是否普遍产生coumaroyl-AHLs、 以及能诱导伴生根瘤菌和植物产生哪种应答(Schuhegger, et al., 2006)。
2.1.2 焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)在细菌群落结构分析中的应用 焦磷酸测序技术( ) 焦磷酸测序技术能够从分离自土壤的 DNA 产生数以千计的短 DNA 序列, 这些序列提供 了细菌群落结构的分类学信息。Yin 等利用该方法研究了耕作制度和轮作对土壤细菌群落结 构的影响,设计 2×2 因子试验,包括 2 个轮作处理(小麦-小麦和小麦-大豆) 个耕作处 、2 理(常规和免耕) ,每个处理 4 个重复。分别采集土壤样品,提取土壤 DNA,扩增 16s rDNA。 通过焦磷酸测序, 获得了 20,180 个 16S rDNA 序列, 97%相似性水平上, 在 产生了 2337 个 运筹分类单位 (OTUs) 。其中最丰富的分类群(Acidobacteria)是酸杆菌门;丰富的分类群 还包括芽单胞菌门(Gemmatimonadetes) 、放线菌目(Actinomycetales)和α-变形细菌 (Alphaproteobacteria) 。绝大多数酸杆菌存在于所有处理土壤中;不同处理土壤中还有其差 异性类群,例如,群 1 主要出现在小麦连作土壤,而群 4 主要出现在小麦-大豆轮作土壤。 这些结果通过群特异性引物进行的实时 PCR 得到验证。这种高通量的测序方法提供了全部 细菌群落分类学信息,能够检测栽培措施等人为因素引起的细菌群落结构变化(Yin, et al., 2010) 。 2.1.3 蛋白质组学方法在 蛋白质组学方法在PGPR-根际相互作用研究中的应用 根际相互作用研究中的应用 蛋白质组学是生物学研究中快速发展的领域之一,可用于研究植物根际各种环境因素, 如根分泌物中的植物信号、盐等,对 PGPR 蛋白质组表达的影响。采用双向凝胶电泳技术检 测了植物根际信号分子、镍和盐对 PGPR 菌株 P. putida UW4 及其突变株 UW4/AcdS (ACC 脱氨酶基因缺失)蛋白质组的影响,结果表明,植物根分泌物信号分子、镍和盐等因子引起 蛋白质组表达发生很大变化。 采用质谱技术对差显蛋白进行鉴定发现, 这些差显蛋白中许多 蛋白与养分运输和利用、细胞荚膜合成、环境胁迫适应、抗氧化过程、重金属外排和转录或 翻译调控有关;在 PGPR-根际相互作用中可能具有重要重用。从 P. putida UW4 中克隆几个 表达水平发生极大变化的差显蛋白基因, 构建差显蛋白基因超表达或完全缺失突变株。 对这 些突变株进行的功能研究发现,与野生型菌株相比,其植物促生能力发生了很大变化。上述 结果证实,这些差显蛋白与 PGPR-根际相互作用有关(Cheng, et al., 2009a, 2009b, 2009c, 2010) 。 2.2 PGPR 功能基因组学 2.2.1 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)Pf-5抗真菌代谢物合成的基因组学分析 荧光假单胞菌( 抗真菌代谢物合成的基因组 ) 抗真菌代谢物合成的基因组学分析

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目前已经完成了几个PGPR假单胞菌(Pseudomonas spp.)测序工作,为通过基因组学方 法揭示PGPR作用机制提供了新的机会。荧光假单胞菌(P. fluorescens) Pf-5是一株具有良好生 防功能的PGPR,2005年完成测序工作,其基因组大小为7.07 Mb(Paulsen, et al., 2005) 。 荧光假单胞菌(P. fluorescens) Pf-5的环状基因组图谱见图1。 该菌株基因组中, 约6%的基因 与次级代谢物合成有关,包括抑制土传病原真菌和卵菌(Oomycetes)的抗生素和与铁离子 。荧光假 吸收有关的2种铁载体;还鉴定出3个功能未知的孤儿基因簇(Loper& Gross, 2007) 单胞菌(P. fluorescens )Pf-5基因组含有的抗生素合成基因簇见图2。

图1

Pseudomonas fluorescens Pf-5 的环状基因组

图 2 P. fluorescens Pf-5 基因组中抗生素合成基因簇

采用一种新的“基因组-同位素组合方法” (genomisotopic approach) ,即基因组分析和同 位素引导的分级分离相结合,发现了其中 1 个孤儿基因簇的产物为 orfamide A ,可能与植

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物病害控制有关的一类新的环脂肽。利用 RT-PCR 检测技术,优化有利于 Pf-5 菌株 ofaA、 ofaB 和 ofaC 基因表达的培养条件。对预测的 orfamide A 中的 1 个亮氨酸进行同位素标记, 然后添加到培养基中,采用 NMR 技术对培养液中的多肽进行分级分离,获得了 orfamide A 的结构(图 3) 。

基因组-同位素组合方法 同位素组合方法” 图 3 “基因组 同位素组合方法”从 Pf-5 培养物中分离 Orfamide A 的原理图 (a) orfamide A 生物合成基因:ofaA、ofaB 和 ofaC,编码非核糖体肽合成酶(NRPS); (b) 在 OfaA、OfaB 和 OfaC 中有 10 个模块 (M1–M10) ,每个模块包含 1 个缩合结构域 (C)、腺苷酰化结 构域 (A)和硫醇化结构域 (T) 。OfaC 的 3’末端含有 2 个硫酯酶结构域(TE) 。

2.2. 2 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )FZB42 基因组比较分析 解淀粉芽孢杆菌(
解淀粉芽孢杆菌 (B. amyloliquefaciens) FZB42 是一株革兰氏阳性的植物根际促生细菌, 促进植物生长, 产生次级代谢产物、 抑制植物土传病害。 其基因组大小为 3,918kb, 含有 3,693 个蛋白编码基因。缺乏噬菌体插入序列,而这在枯草芽孢杆菌 168 菌株基因组中存在较多。 FZB42 基因组分析表明,该菌株具有产生多种次级代谢产物的潜力,包括聚酮化合物 bacillaene 和 difficidin。8.5% 以上的基因与抗生素和铁载体的非核糖体肽合成有关。除含有 5 个在枯草芽孢杆菌(B. subtilis)168 菌株中已知的非核糖体肽合成基因簇外,还含有 4 个 168 菌株所缺乏的 4 个大基因簇。pks2 基因簇编码合成 macrolactin 核心骨架的组件。 与细菌-植物相互作用有关的基因: FZB42 有效定植于植物根际是其促进植物生长的先 决条件。细菌根际竞争与其形成生物膜的能力有关。FZB42基因组含有丰富的生物膜形成相 关基因。包括胞外多糖合成操纵子epsA-O。RBAM00750, RBAM00751和 RBAM00754基因编 码具有胶原蛋白GXT结构基序的蛋白质,可能与表面附着和生物膜形成有关。swrA编码的 蛋白质和surfactin是FZB42群体移动所必需的,也与其在根面定植和营养捕获有关。FZB42 基因组含有262个可能具有分泌信号功能的蛋白质, 被信号肽酶I型(150个基因产物)、 II型(98 个基因产物)和Tat系统(14个基因产物)所识别。FZB42碱性丝氨酸蛋白酶AprE与角质降解胞 外蛋白酶具有很高的同源性(98%) ,可以杀死植物病原线虫。FZB42基因组含有大量的胞

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外大分子水解酶基因, 使其在植物表面生长。 FZB42还产生植酸酶, 在植物根分泌物存在时, 其合成高水平提高;磷饥饿诱导PhoP/R双组分系统的合成,进而调节植酸酶的合成。根分 泌物还刺激与氧化胁迫应答相关酶合成上调; 植物根际氧化胁迫是由硫醇过氧化物酶或分解 植物根分泌物的酶 (如bacillopeptidase F、g-谷酰基转肽酶、磷酸转乙酰酶)催化反应过程中 产生的。蛋白质组学分析表明,鞭毛钩相关蛋白HAP1、HAP2和鞭毛蛋白HAG合成受植物 根分泌物的影响。 尽管在根分泌物存在时, flgK基因产物HAP1水平降低, fliD表达水平和hag 基因产物 (HAP2、HAG) 水平上调。鞭毛蛋白诱导植物对病原菌的防卫反应;在FZB42在 植物根表面定植过程中, 鞭毛蛋白及其他表面蛋白合成水平的变化可能提高了FZB42对不利 的植物应答的耐受性,进而提高了其根际竞争能力。研究表明,枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢 杆菌产生的挥发性化合物3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)和2,3-丁二醇等促进植物的生长;这些挥 发性化合物也与引发植物系统诱导抗性有关。 乙酰乳酸合成酶催化两分子丙酮酸缩合形成乙 酰乳酸, AlsD催化乙酰乳酸脱羧基产生3-羟基-2-丁酮。 FZB42 也含有催化2,3-丁二醇合成途 径的基因。芽孢杆菌(Bacillus spp. )通过产生吲哚乙酸(IAA) 、赤霉酸等植物激素促进植 物生长。在喂养色氨酸情况下,FZB42能够合成IAA。FZB42基因组中含有3个与IAA代谢相 关基因具有明显同源性的候选基因:ysnE (编码蛋白与巴西固氮螺菌的IAA乙酰转移酶相 似)、dhaS (与Ustilago maydalis的吲哚-3-乙醛 乙醛脱氢酶相似)和yhcX(可能的睛水解酶, 与拟南芥的睛水解酶相似) 。YsnE和YhcX 参与 IAA 生物合成。 与生防有关的基因簇:解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)FZB42 基因组中,含有 9 个生物活性肽和聚酮化合物合成基因簇;编码具有模块化组织的非核糖体肽合成酶 (NRPSs)和聚酮合成酶(PKS),指导多肽和聚酮化合物的生物合成。在枯草芽孢杆菌(B. subtilis)168 基因组未发现 bmy、mln、dfn 和 nrs 基因簇。除溶杆菌素(bacilysin)生物合 成基因簇外,其他基因簇的活性均依赖于 Sfp, 将 4’-磷酸泛酰巯基乙胺从辅酶 A 转移到初

生肽或聚酮链的载体蛋白上。表 1 概括了 FZB42 基因组所含的各种非核糖体肽和聚酮合成 基因簇(Chen, et al., 2007,2009) 。
表 1. B. amyloliquefaciens FZB42 和 B. subtilis 168 基因组中 NRPS 和 PKS 基因簇 Compound Surfactin BacillomycinD Fengycin Putative peptide Bacillibactin Bacilysin/ anticapsin Macrolactin Bacillaene Difficidin Enzyme NRPS NRPS/ PKS NRPS NRPS NRPS NRPS PKS PKS/ NRPS PKS FZB42 srfABCD 、 aat 、 ycxC 、 ycxD、sfp、yczE bmyCBAD fenABCDE nrsABCDEF dhbABCDEF bacABCDE、ywfG mlnABCDEFGHI baeBCDE、acpK、 baeGHIJLMNRS dfnAYXBCDEFGHIJKLM B. subtilis 168 srfAA、AB、AC、AD、 ycxA、ycxB、ycxC、ycxD Not present ppsABCDE Not present dhbABCDEF ywfBCDEFG Not present pksBCDE、acpK、 pksGHIJLMNRS Not present Identity% 73–83 0 60–65 0 60–80 84–93 0 52–83 0

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2.2.3 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)基因组测序 多粘类芽孢杆菌( ) 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)已有 110 多个种,但其基因组信息是极其缺乏的。类芽孢 杆菌 (Paenibacillus spp.) 是土壤、 植物生态系统的重要成员; 多粘类芽孢杆菌 (P. polymyxa ) 是其模式种,广泛应用于农业、医药、工业、环境修复等领域。多粘类芽孢杆菌的一些菌株 是十分重要的植物根际促生细菌,能够促进植物生长、抑制土传病害。 新近已经陆续完成了 2 株多粘类芽孢杆菌的基因组测序工作。多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa) E681 只含有一条环状染色体,基因组大小为 5,394,884 bp,G+C 含量为 45.8%,12 个 rRNA 操纵子,4,805 个编码基因,蛋白编码基因主要分布于正链上。基因组中含有至少 13 种胞外 功能 σ 因子。 有 19 个插入序列元件,但几乎没有噬菌体相关基因。对其产生的一些抗生素 合成机制进行了研究,多粘菌素(Polymyxin)是一类抗革兰氏阴性细菌的抗生素,其生物 合成与运输主要由 pmxABCDE 基因簇控制。杀镰刀菌素(Fusaricidin)是一类抗真菌抗生 素,其生物合成由 fus 基因簇所控制。E681 可能还合成聚酮化合物、 类 tridecaptin 非核 糖体肽、lantibiotic 等。生长素生物合成可能是通过吲哚-3-丙酮酸途径进行的。该菌株还产 生挥发性化合物,促进植物生长、诱导植物系统抗生。在其基因组中也发现了 N-乙酰-L-高 丝氨酸内酯酶基因 。基因组分析发现,E681 产生多种分解植物多糖的胞外水解酶,包括木 聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和淀粉酶等(Kim, et al., 2010) 。 多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa )SC2 是分离自辣椒根际的一株植物根际促生细菌,已 广泛用于植物土传病害的生物防治。SC2 菌株基因组由一个 5,731,683 bp 的环状染色体和 一个 510,115 bp 的质粒组成,G+C 含量分别为 45.24% 和 37.61%。染色体含有 5401 编码 基因, 个 rRNA 操纵子和 154 个 tRNAs 基因; 12 质粒 pSC2 含有 649 编码基因, 个 tRNAs 44 基因。 在质粒上含有许多必须基因, 如嘌呤、嘧啶和脂类代谢, 核糖体蛋白,翻译延伸因子、 各种类型的 DNA 甲基的转移酶等,表明质粒对该菌株生命活动的重要性。SC2 染色体上含 有许多与抗生素合成有关的基因,如 fusaricidin、polymyxin、lantibiotic 和 polyketide 生物合 成基因簇, bacitracin 合成酶 1、 iturin A 合成酶和 bacillorin 合成酶 B 等基因 (Ma, et al., 2011) 。 2.2.4 荧光假单胞菌 荧光假单胞菌Pf-5和丁香假单胞菌 和丁香假单胞菌B728a 基因组生物活性小分子发掘 基因组生物活性小分子发掘 和丁香假单胞菌 -基因组发掘策略(Genomic Mining Strategy) 基因组发掘策略( 基因组发掘策略 ) 通过基因组序列分析发现,假单胞菌(Pseudomonads)具有远高于预期的产生次级代谢 产物的遗传能力, 许多次级代谢途径的产物尚不清楚。 由于大量的微生物次级代谢物具有重 要的生物活性, 对这些未知次级代谢物进行发掘和利用具有广阔的前景, 有可能发现独特的 具有医药或农业应用潜力的天然产物。荧光假单胞菌(P. fluorescens)Pf-5 是一株有效的土 传病害生防菌株;丁香假单胞菌丁香致病变种(P. syringae pv. Syringae)B728a(Pss B728a) 是一株植物病原菌,引起菜豆褐斑病。2005 年,已经完成了这两个菌株的基因组测序。对 其基因组序列进行的生物信息学分析发现, 除含有已知的生物合成基因簇外, 还含有大量的 编码次级代谢物孤儿途径(orphan pathways) 采用不同的基因组学方法,使得人们能够将 。

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这些途径与天然产物联系起来,如 Pf-5 产生的抗真菌天然产物 orfamides A-C 和细胞毒素 rhizoxin 衍 生 物 ; Pss B728a 产 生 的 兼 容 性 溶 质 N- 乙 酰 - 谷 氨 酰 胺 酰 基 - 谷 氨 酸 铵 (N-acetyl-glutaminyl-glutamine-amide) 。 基因组发掘策略(Genomic Mining Strategy )是建立在基因组测序及注释基础上,以基 因组学方法为指导, 与插入突变和代谢物分析相结合, 从基因组中寻找新天然化合物的策略。 首先对基因组中的孤儿基因簇(orphan gene cluster)进行序列、结构和功能等分析,然后进 行插入突变,获得缺失突变株,对突变株和野生型菌株的代谢产物进行比较分析,最后分离 目标化合物、并进行结构及生物活性等研究。利用基因组发掘策略,从荧光假单胞菌(P. fluorescens )Pf-5 中分离到 5 个大环内酯类的 rhizoxin 类似物,表现出抗真菌、细胞毒素 和植物性毒素特性。这些化合物是通过一个杂合的聚酮合成酶/非核糖体肽合成酶 (PKS/NRPS)基因簇进行合成的(Loper, et al., 2008) 。 2.2.5 绿针假单胞菌 O6 菌株 gacS 和 rpoS 突变株蛋白组特性研究 突变株蛋白组特性 特性研究 革兰氏阴性细菌中,GacS/GacA 双组份调控系统是许多生物学过程的全局调控因子,稳 态特异性 σ 因子 RpoS 是胁迫应答反应的主要调控因子。绿针假单胞菌(P. chlororaphis) O6 产生吩嗪(phenazines)和吡咯尼林(pyrrolnitrin)等具有抑菌活性的次级代谢产物,引 起植物产生对病原菌的系统诱导抗性和对氧化胁迫的耐受性。为鉴定受 GacS 感受蛋白激酶 和 RpoS 调节的蛋白质, 采用双向凝胶电泳技术对该菌株野生型、GacS 或 RpoS 突变株进 行了蛋白质组分析,采用 MALDI-TOF 对下调蛋白进行鉴定。通过 PCR 克隆下调蛋白编码 基因。利用实时 RT-PCR 分析不同菌株这些下调蛋白的转录水平,结果表明,14 个下调蛋 白基因在转录水平上受 GacS 感应蛋白激酶的调节。与野生型菌株相比,rpoS 突变株有 11 个蛋白下调。受 RpoS 调节的蛋白包括色氨酸代谢相关蛋白(色氨酸卤化酶 PrnA 和色氨酸 单加氧酶) ,氧化胁迫相关蛋白(过氧化物酶 AhpC 和谷胱甘肽过氧化物酶 Gpx),分泌相关 蛋白(多胺 ABC 运输蛋白 PotA、TonB 依赖的外膜血红素受体 CirA 和 I 型分泌外膜蛋白 TolC),全局调控因子(丝氨酸蛋白激酶 PrkA)和一般代谢有关蛋白(血红素氧化酶 HemeO 和 S-腺苷-甲基转移酶 MraW)。 为确定受 GacS 调节的蛋白质作用, 构建了 ascI 突变株 (ascI 是邻氨基苯甲酸和对氨基苯甲酸生物合成组分 I 基因,与从分支酸生物合成色氨酸有关) 和 prnA 突变株 (色氨酸卤化酶,与吡咯尼林的生物合成有关) 。这两个突变株均丧失了诱 导系统抗性能力。根际定植试验和扫描电镜观察发现,上述突变株不能在烟草根际定植。 2.2. 6 基于基因组cpn60 Marker和高通量测序的植物根际微生物群落分析 基于基因组 基因组 和高通量测序的植物根际微生物群落分析 植物根际微生物群落的高度复杂性是辨别不同植物根际微生物群落结构差异的主要限 制因素。 采用传统的微生物学方法和分子生物学方法描述根际微生物群落, 在规模和精度上 都存在严重不足。基因组学技术提供了更全面深入研究微生物群落特性的有效手段。Hill 等 建立了一种基于 cpn60 序列(伴侣蛋白 60 基因)和 DNA 高通量测序相结合的复杂微生物 群落分子诊断技术:首先提取植物根际 DNA,PCR 扩增 cpn60 ,构建 cpn60 扩增子文库;

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用 454 sequencer 测定 20,000-50,000 cpn60 扩增子序列; 基于 cpn60 序列产生的 taxonomic origins 包括大量的尚未确定分类地位的微生物、也有许多确定到属水平、部分微生物确定 到种水平。基因组 cpn60 Marker 和 454 Sequencer 将会成为植物根际微生物群落特征研究 的强有力工具。但是,目前 cpn60 数据库是相当小的,约有 7000 个细菌(Hill, et al., 2002) 。 2.2.7 荧光假单胞菌 荧光假单胞菌SBW25菌株 菌株fleQ基因突变对菌体运动、基因及表型表达的影响 基因突变对菌体运动 菌株 基因突变对菌体运动、 荧光假单胞菌(P. fluorescens)SBW25 是分离自甜菜根际的 PGPR 菌株。已完成其基因 组的测序,SBW25 基因组含有许多在植物表面进行特异性表达的基因,这些基因的功能是 其在植物根际完成运动、竞争、定植等生态学过程的关键。然而,对于这些基因功能及表达 调控的研究面临巨大困难,因为这些基因的表达没有明显的可辨别的表型。在甜菜根际, SBW25 约 150 个基因系统进行表达。也发现了一些控制这些基因表达的调控因子。FleQ 是 鞭毛生物合成的主要调控因子, 同时也对其他多个基因系统的表达具有调控作用, 包括游动 和群体迁移、氧化胁迫等相关基因系统。 采用抑制筛选(suppressor screen) 、微阵列(microarray)分析和 phenoarray 分析组合研 究方法,鉴定 FleQ 对基因组全局表达的影响。FleQ 控制着鞭毛依赖的群体迁移,但对非鞭 毛依赖的滑行运动没有影响。FleQ 还影响多个基因系统的表达,包括调控蛋白、酶和转运 蛋白等基因的表达。Phenoarray 分析发现,fleQ 突变株的渗透压和 pH 耐受性、二肽运输和 抗生素抗性均发生了明显改变。上述结果表明,FleQ 是一个全局调控因子,控制着多种基 因系统的表达;在荧光假单胞菌根际定植过程中具有重要的生态学功能(Giddens, et al., 2007) 。 2.2. 8 种子表面荧光假单胞菌Pf-5菌株生防机制的微阵列分析 种子表面荧光假单胞菌 菌株生防机制的微阵列分析 假单胞菌 菌株生防机制 生防菌株(P. fluorescens)Pf-5 有效抑制真菌和卵菌引起的幼苗病害;种子表面 Pf-5 的 基因表达决定了其在种际(spermosphere)与病原菌相互作用的结果。种子分泌物为生防菌 株 Pf-5 和病原菌提供营养和能量, 引发病原菌繁殖体的萌发和生长;种子分泌物影响生防 菌株 Pf-5 的次生代谢物合成及功效。为进步揭示 Pf-5 在植物种际( spermosphere)的生防 机制, 对生长在豌豆种际的 Pf-5 进行微阵列分析;比较了野生型 Pf-5 及其调节基因 gacA 或 rpoS 突变株的基因表达情况; gacS/gacA 双组份调控系统是 Pf-5 次生代谢物合成所必需 的;gacS 或 gacA 突变将导致其生防效果降低;rpoS 突变提高其对 Pythium ultimumde 的 生防效果;在 gacA 突变株中,表达下调的基因包括次生代谢物合成基因、2,4-二乙酰基间 苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol,DAPG)合成基因、吡咯尼林(pyrrolnitrin)合成基因、 orfamide A 合成基因、细胞毒素 rhizoxin 类似物合成基因和 VI-型分泌系统编码基因;与铁 捕获有关的基因表达下调。在 rpoS 突变株中,吡咯尼林(pyrrolnitrin)合成基因、rhizoxin 类似物合成基因表达下调;2,4-二乙酰基间苯三酚(DAPG) 和 pyoluteorin 合成基因表达下 调(Kidarsa & Loper, 2009) 。

2.2.9 荧光假单胞菌 SS101 菌株植物促生机制的微阵列分析
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荧光假单胞菌(P. fluorescens )SS101 菌株促进拟南芥发芽、根系发育、叶色变深、侧 根增加,地上部生物量增加 35%。为从转录组水平揭示其促生分子机制,对 SS101 处理的 拟南芥进行微阵列分析。结果表明,拟南芥根部有 1179 个差显表达基因,其中 556 个基因 表达上调,623 基因表达下调。拟南芥叶部有 920 个差显表达基因,其中 687 基因表达上 调,233 基因表达下调。进一步进行生物信息学分析 (Gene Trail) 发现,根部许多上调基因 与侧根形成、一维细胞生长、激素响应和细胞壁修饰有关,许多下调基因与铁离子平衡、生 长素响应、细胞附着和一维细胞生长有关。 叶部上调基因包括与防卫反应、细胞死亡、水 杨酸响应、素馨酮酸( jasmonic acid )响应和乙烯响应有关基因;许多下调基因与铁离子 平衡、生长素响应、脱落酸响应有关。 2.2.10 TaqMan qRT-PCR Assays 研究土壤条件下 PGPR 基因表达 在复杂根际土壤条件下,PGPR 促生、生防相关基因的表达尚不清楚;RNA 提取和逆转 录定量-PCR(qRT-PCR)技术的发展, 使土壤条件下定量研究微生物基因你表达成为可能; 以 含有 2,4-二 乙酰基间苯 三酚 (DAPG)和 氢氰酸 (HCN)合成基因 的 Pseudomonas spp. LBUM300 作为模式生物, 进行土壤条件下 PGPR 基因表达研究。 在土壤中接种不同浓 度的 Pseudomonas spp. LBUM300, 分别在 7d、14d 提取土壤 RNA ,设计特异性 real-time PCR 引物和 TaqMan 探针, 进行 qRT-PCR , 检测 phlD (coding for DAPG) 和 hcnC (coding for HCN) 的表达;在 14d 的土壤中,均可以检测到 phlD 、 hcnC 的表达,细菌稀释度是 影响检测结果的重要因素(DeCoste, et al., 2010) 。 2.3 PGPR 促生、生防机制研究进展 促生、生防机制研究进展 2.3.1 三羧酸循环中间代谢物和温度对荧光假单胞菌(P. fluorescens)Gac-依赖生防因子 三羧酸循环中间代谢物和温度对荧光假单胞菌 依赖生防因子 表达的调节 表达的调节 荧光假单胞菌(P. fluorescens)CHA0 是一株有效抑制作物土传真菌病害的拮抗菌;合成并 分泌具有抗生素特性的次级代谢产物、胞外酶等生防因子;其生物合成依赖于 3 个小 RNAs(RsmX, RsmY 和 RsmZ)。在高细胞群体密度时,RsmX、RsmY 和 RsmZ 的表达受到 GacS-GacA 双组分系统的正调节。为揭示荧光假单胞菌初级代谢与次级代谢之间的调节联 系,利用中心碳代谢受影响的无效突变(null mutantion) 、rsmY-gfp 和 rsmZ-gfp,但在丰富 培养基上正常生长的重组菌株进行研究发现,在营养缺乏时,丙酮酸羧化酶基因 pycAB 突 变导致 rsmXYZ 和次级代谢表达下调;而延胡索酸酶同工酶基因 fumA 突变则引起 rsmXYZ 和次级代谢表达上调。这些调节效应需要 GacS 传感蛋白激酶而不需要辅助传感蛋白 RetS 和 LadS。对胞内代谢物分析结果表明,RsmX, RsmY 和 RsmZ 的表达与 2-酮戊二酸、琥珀 酸和延胡索酸池(pool)之间存在高度正相关。据此可知,三羧酸循环中间代谢物,通过 GacA-依赖的小 RNAs(RsmX, RsmY 和 RsmZ)的表达对次级代谢进行调节。 P. fluorescens CHA0 中, Gac/Rsm 信号转导途径是通过 3 个非编码小 RNAs(RsmX, RsmY 和 RsmZ)的表达,对次级代谢、胞外酶合成和生防特性进行正调节。对 rsmY 和 rsmZ 启动

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子结构和功能进行研究发现, 一个保守的回文上游激活序列(UAS) 是 rsmY 和 rsmZ 表达所 必须但不充分的;受应答调节蛋白 GacA 的激活。位于 UAS 和-10 启动子序列之间的低保 守性的连接区(linker region)对于 GacA-依赖的 rsmY 和 rsmZ 表达也是必须的;这意味着 需要一个辅助转录因子的参与。与 rsmZ 启动子激活有关的辅助转录因子为 PsrA 蛋白,该 因子以前被认为是 rpoS 的激活物和脂肪酸降解的阻遏物。进一步研究发现,整合宿主因子 (integration host factor,IHF)蛋白与 rsmZ 启动子进行高亲和性结合,这表明 DNA 弯曲有助 于 rsmZ 表达。在一个 rsmXYZ 三突变株中, rsmY 和 rsmZ 表达水平提高,在野生型之上。 这一负反馈环(negative feedback loop)似乎涉及翻译调控蛋白 RsmA 和 RsmE,这两个调 节蛋白活性受 RsmXYZ 和几个假设 DNA 结合蛋白的的拮抗。 这一高度复杂网络对细胞生 理细胞群体密度作出应答,控制着 3 个小 RNAs 表达。 概括起来讲,Gac/Rsm信号转导途径是通过对RsmX, RsmY 和 RsmZ 表达的上调,对 抗真菌生防因子(次级代谢产物和胞外酶)的合成进行正调节。这些小RNAs se阻隔RNA结合蛋白RsmA和RsmE, 解除或减弱其对生防相关基因翻译的阻遏。在分批培养条件下,这 一调节过程发生在对数生长期之后、细胞群体达到高密度、生长速度变慢(即稳定期)时。 胞内外信号分子均能引起细胞生长速度减慢, 使细胞生长进入稳定期。 三羧酸循环失衡影响 RsmXYZ表达,进而影响生防因子的表达。尤其是RsmXYZ 表达似乎受高水平延胡索酸的 激活; 受高水平异柠檬酸的阻遏。 高培养温度 (>30°C) 增强RetS 感受蛋白的作用 (GacS 感 受蛋白的拮抗物) ,抑制GacS/GacA 双组分系统的功能(Takeuchi, et al., 2009; Humair, et al., 2010) 。 2.3.2 荧光假单胞菌 fluorescens )环脂肽生物合成的全局和特异性调控 荧光假单胞菌(P. 环脂肽生物合成的全局和特异性调控 环脂肽 许多微生物都产生环脂肽(Cyclic lipopeptides,CLPs),具有几个十分重要的生物学功 能,与菌体运动、定植、生物膜形成、毒力及抗菌活性等密切相关。CLPs 是通过非核糖体 肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases,NRPS)催化合成的。在 PGPR 菌株荧光假单胞 菌(P. fluorescens) SS101 中, 环脂肽 massetolide 的生物合成由 3 个 NRPS 基因参与,分别为 massA、 massB 和 massC。与其他的 CLP 基因簇位于同一个操纵子不同,massA 和 massBC 不处在同一个操纵子,分别进行转录。为鉴定 P. fluorescens CLP 生物合成调节网,采用了 多种方法,包括随机突变和定点突变、克隆、测序和功能分析。确定了与全局和途径特异性 调节有关的基因,包括 GacA/GacS 双组分系统和 LuxR-型转录调控因子。luxR 基因的超表 达引起 mass 基因表达上调、提高 massetolide 合成水平。 与其他几株产 CLP 的假单胞菌 (Pseudomonas)不同,在荧光假单胞菌 SS101 菌株中没有发现 N-AHL 介导的群体感应 (quorum sensing ) 。除这些全局和途径特异性调节基因外,还发现了几个新的调节基因, 如 ClpP(环脂肽蛋白酶)基因。通过定点突变、遗传互补和表达分析,证实了 ClpP 这一丝 氨酸蛋白酶在 CLP 生物合成中的调节作用。ClpP 影响 massABC 的转录调节基因 luxR(mA) 的表达,从而调控 SS101 菌株生物膜的形成及群体运动。在 clpP 突变株中,luxR(mA) 的转

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录受到严重阻遏;而引入 luxR(mA) 基因可以部分地恢复 clpP 突变株的 massetolide 生物合 成和群体运动能力。添加酪蛋白氨基酸能够提高 clpP 突变株 luxR(mA) 和 massABC 基因的 转录,使 massetolide 合成能力和群体运动能力部分恢复。这些结果表明,在转录水平上, ClpP 介导的对 massetolide 生物合成的调节是独立进行的。 不同假单胞菌具有复杂、多样性的 CLP 生物合成调节网,尤其是荧光假单胞菌(P. fluorescens) SBW25 菌株 viscosin 生物合成的调控。系统发育分析发现,假单胞菌 CLP 生物 合成基因侧翼含有 LuxR-型转录调控因子基因, 具有一个 DNA 结合 helix-turn-helix 结构域, 但没有 N-酰基高丝氨酸内酯结合或应答调节因子结构域。在 SBW25 菌株中,对 LuxR-型转 录调控因子基因 viscAR 和 viscBCR 进行定点突变,其中任何基因突变都会导致 viscosin 生 物合成基因 viscABC 的转录水平显著下降、 viscosin 生物合成水平大幅降低。 表达分析显示, viscAR 或 viscBCR 突变对其他调节基因的转录影响不大。用来自 SS101 菌株的 LuxR-型调 节基因转化 SBW25 的 viscAR 突变株,使其 viscABC 基因的转录和 viscosin 生物合成得以 恢复。进一步研究表明,viscAR 基因是 SS101 菌株 massetolide 生物合成基因在 SBW25 菌 株中进行异源表达所必须的。总之,假单胞菌中,位于 CLP 生物合成基因侧翼的转录调节 基因表达产物代表了一个独特的 LuxR 蛋白质子家族,SBW25 菌株 viscosin 生物合成的受 到两个 LuxR-型转录调控因子 ViscAR 和 ViscBCR 的控制(Bruijn & Raaijmakers, 2009a, 2009b )。 2.3.3 PGPR产生的挥发性化合物(VOCs)是植物促生和防卫反应的诱导因子 产生的挥发性化合物( 生和防卫反应的诱导因子 产生的挥发性化合物 )是植物促生和防卫反应 有些 PGPR 菌株, 在与植物没有直接接触的情况下, 通过其产生的挥发性化合物 (volatile organic compounds ,VOCs)刺激植物生长、引起植物产生诱导系统抗性(induced systemic resistance,ISR)。拟南芥细胞分裂素受体缺失突变体 (cre1)、细胞分裂素及乙烯不敏感突变 体(ein2)的生长对 GB03 volatile 不敏感, 而乙烯不敏感突变体 (etr1), 生长素转运蛋白缺失 及乙烯不敏感突变体(eir1), 赤霉酸不敏感突变体 (gai2),和油菜素甾醇(brassinosteroid)不 敏感突变体 (cbb1) 的生长均 对 GB03 VOCs 敏感。这些结果表明,在 VOC 诱导的植物促 生过程中, 拟南芥细胞分裂素水平起关键作用。 利用拟南芥突变体和 Erwinia carotovora subsp. carotovora 进行诱导系统抗性试验,用 GB03 挥发性化合物处理的突变体中,只有乙烯不敏 感突变体(ein2)没有表现出病症的改善。为确定 ISR 是否在转录水平上受 VOCs 的调控,利 用 3 个植物防卫信号转导相关基因-GUS(β-葡萄糖醛酸酶)融合转基因拟南芥进行试验。 在供试的转基因拟南芥中,只有茉莉酸(jasmonic acid)和乙烯应答基因 PDF 1.2-GUS 转基 因拟南芥的 GUS 酶活性大幅提高,比对照高出 1000 多倍。用解淀粉芽孢杆菌( B. amyloliquefaciens )IN937a VOCs 进行类似的研究,将拟南芥暴露于 IN937 VOCs,E. carotovora subsp. Carotovora 引起的拟南芥发病程度显著降低。将不同拟南芥突变体暴露于 IN937 VOCs ,包括茉莉酸不敏感突变体 (coi1)、乙烯不敏感突变体 (ein2), 水杨酸水解突 变体 (NahG)和调节基因缺失突变体 (npr1),IN937a VOCs 引起所有突变体对 E. carotovora

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subsp. Carotovora 的系统诱导抗性(ISR) 。结果表明,IN937a VOCs 引起的植物 ISR 不依赖 于茉莉酸、乙烯、水杨酸和 npr1。因此,IN937a VOCs 可能通过一个新的信号转导途径诱 导拟南芥的 ISR。通过对枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis)GB03 和解淀粉芽孢杆菌( B. amyloliquefaciens )IN937a 产生的 VOCs 进行气相色谱分析发现,GB03 和 IN937a 菌株 产生的 VOCs 中,两个最主要的成分是 2,3-丁二醇(2,3-butanediol)和 3-羟基-2-丁酮 (3-hydroxy-2-butanone)(也称乙偶姻,acetoin)。在芽孢杆菌(Bacillus sp.)中, 2,3-丁二醇 和 3-羟基-2-丁酮是在低 O2 分压下产生。 VOCs 即能够诱导细菌自身植物生长调节物质(如生长素等)的合成,也能诱导植物生 长素的生物。此外,转录分析发现,暴露于 GB03 VOC 的拟南芥细胞壁松散 (cell wall loosening) 意味着一个可能的植物细胞快速膨胀和叶片生长促进机制。 , 2,3-丁二醇也可能参 与 PGPR 在植物根际的定植过程。2,3-butanediol 合成缺失突变株在植物根际的存活能力显 著降低,这表明,VOCs 除促进植物生长和诱导植物系统抗性外,通过植物体内化学信号转 导对 PGPR 自身也提供了保护。枯草芽孢杆菌(B. subtilis)产生的 2,3-丁二醇可能间接引起 植物叶部产生 ISR,直接诱导植物根部合成抗菌物质,同时保护 PGPR 自身细胞免受植物抗 菌物质的损害。 GB03 VOCs 还通过植物内源糖/ ABA 信号转导调整对光合作用进行调节, 提高光合作用效率和叶绿素含量; 由此确立 VOCs 在植物能量捕获过程中的调节作用(Ryu, et al., 2003, 2004, 2008; Farag, et al., 2006; Zhang, et al., 2007 )。 2.3.4 PGPR介导的植物生长素再循环(Turnover) 介导的植物生长素再循环( 介导的植物生长素再循环 ) 一些 PGPR 菌株可能通过合成或分解植物激素, 调控植物的生长发育。 尽管有许多 PGPR 产生植物激素的报道, PGPR 还可以通过分解植物激素来调节植物激素状况。 但 植物激素状 况的 PGPR 介导调节不仅影响植物根延伸和构型, 进而调节植物对水和养分的捕获吸收; 而 且还影响植物根-茎激素信号转导,以调节植物叶的生长和气体交换(Dodd1, et al., 2010)。 采用培养和非培养方法对与吲哚乙酸再循环(IAA recycling)相关的细菌丰度和多样性进 行研究发现,不同来源根际和非根际土壤以及植物材料所含有的大量细菌均能利用 IAA 做 为唯一碳源和能源,这表明 IAA 再循环是许多土壤及植物相关细菌所具有的普遍特性。通 过 PCR 方法证实, 这些具有 IAA 分解能力的细菌都含有 与 P putida 1290 iac 基因簇相似

的 DNA 序列。从已完成基因组测序的许多菌株也鉴定出 iac 基因;对几株碳源利用进行测 定证实能在 IAA 作为唯一碳源和能源, 这表明 β- 和 γ-Proteobacteria 以及高 G+C 含量的革 兰氏阳性菌中均含有 IAA 分解细菌。有趣的是具有 IAA 分解能力的细菌并不都是来自土壤 和植物环境。 基于假单胞菌 iac 基因缺失突变株互补试验, 建立了一个培养方法用于分离 编码 IAA turnover 的 DNA 片段 ,对这些 DNA 片段进行测序,用于揭示 IAA 分解细菌的 遗传多样性。这些数据信息是利用遗传和分子方法研究细菌 IAA turnover 对植物功能、植 物促生和植物-细菌相互作用影响的基础。 从植物表面分离到几株具有吲哚乙酸(IAA)分解能 力的细菌。恶臭假单胞菌(P putida )1290 能利用 IAA 做为唯一碳源、氮源和能源;其儿

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茶酚 1,2-双加氧酶(1,2-dioxygenase)活性受 IAA 的诱导; 这表明儿茶酚是 IAA 分解途径的 中间产物。 在这一结果与在 IAA 培养基中添加儿茶酚时, 恶臭假单胞菌 (P. putida ) 1290 细 胞对的氧吸收增加相一致; catR 突变株失去 IAA 分解能力也表明 是 IAA 代谢的一个重 其 要中间产物。除具有 IAA 分解能力外,1290 菌株在添加色氨酸的培养基上也能合成 IAA 。 观察萝卜根延伸情况,P. putida 1290 彻底解除了外源 IAA 对萝卜根延伸的抑制。事实上, 用恶臭假单胞菌 1290 和 1 mM 的 IAA 同时处理萝卜根具有促进根系发育的效果。 在对萝卜 根进行协同接种试验中, 1290 菌株只能部分减轻过量产生 IAA 的细菌对根发育的抑制作用。 上述结果暗示,在植物-细菌以及植物相关细菌之间,恶臭假单胞菌 1290 菌株具有 IAA 槽 (sink)或再循环器(recycler)的生物作用(Leveau & Lindow, 2005 )。 将分离自恶臭假单胞菌 1290 的一个 8994-bp DNA 片段转化恶臭假单胞菌(P. putida) KT2440 菌株,使后者获得了利用吲哚乙酸(IAA)作为唯一碳源和能源的能力。 利用转座质 粒 (plasposon) 1290 菌株进行突变, 对 筛选到一个 IAA 或吲哚 3-乙醛 (indole 3-acetaldehyde) 分解缺失突变株,该突变株同时也失去了保护萝卜根免受外源 IAA 抑制的能力;鉴定出一 个负责吲哚乙酸(IAA)分解代谢的 iac 基因座。该 iac 基因座由 10 个基因组成;分布于 3 个 不同的转录单元:(1)操纵子 iacABCDEFG,(2)操纵子 iacHI ,(3) iacR,位于上游,反向 转录。 这些基因与吲哚或酰胺化芳香族化合物分解相关酶基因以及调节蛋白或未知功能蛋白 具有很高的相似性。恶臭假单胞菌 1290 菌株 iac 基因簇与其他 22 种细菌基因组中已鉴定的 Marinomonas sp. MWYL1、 Burkholderia sp. iac 基因簇也具有高度相似性; 其中 P. putida GB-1、 383、Sphingomonas wittichii RW1 和 Rhodococcus sp. RHA1 被证实具有 IAA 分解能力,分属 于α-、β-、γ-变形细菌和放线菌。恶臭假单胞菌 1290 菌株还含有 IAA 分解所必须的 cat 和 pca 基因,意味着 IAA 分解以儿茶酚作为中心代谢物、沿儿茶酚到 b-ketoadipate 途径进 行的。 其他一些与三羧酸循环、 糖异生及碳/氮感受信号相关基因, 如也 cbrAB 等, 也是 IAA 分解所需要的(Leveau & Gerards, 2008 )。 2.3.5 PGPR 吲哚乙酸生物合成及信号转导 吲哚乙酸生物合成及 生物合成及信号转导 已有大量关于各种植物根际细菌产生吲哚乙酸(IAA)的报道, 以产生吲哚乙酸作为其一个 可能的植物促生机制。 对固氮螺菌以及其他根际细菌 IAA 合成及调控的深入研究表明, IAA 的形成通过不同的合成途径, 甚至同一菌株具有不止一种生物合成途径。 IAA 生物合成受到 复杂的调节,包括 IAA 自身的正反馈调节。近期研究发现,细菌及其他微生物以 IAA 作为 信号分子。这些研究结果意味着 PGPR 合成的 IAA 具有多种功能(Spaepen, et al., 2007 )。 2.3.5.1 细菌 IAA 生物合成途径 已经在多种细菌中鉴定了多种 IAA 生物合成途径,与植物 IAA 生物合成途径具有很高的 相似性。色氨酸是细菌 IAA 生物合成的主要前体物质,以色氨酸为前体至少具有 5 种 IAA 生物合成途径。 吲哚-3-乙酰胺途径(Indole-3-acetamide pathway,IAM 途径) :吲哚-3-乙酰胺途径是细菌

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中研究最清楚的 IAA 生物合成途径。该途径由两步完成,色氨酸首先在 iaaM 基因编码的色 氨酸 2-单氧酶(IaaM)催化下转化为吲哚-3-乙酰胺; 第二步由 iaaH 编码的 IAM 水解酶 (IaaH) 催化由 IAM 转化为 IAA。从几种不同的细菌中克隆了 iaaM 和 iaaH,位于染色体或质粒上。 吲哚-3-丙酮酸途径(Indole-3-pyruvate pathway,IPyA 途径) :吲哚-3-丙酮酸途径被认为是 植 物 合 成 IAA 生 物 合 成 的 重 要 途 径 。 已 在 慢 生 根 瘤 菌 ( Bradyrhizobium ) 根 瘤 菌 、 (Rhizobium) 、固氮螺菌(Azospirillum) 、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) 、蓝细菌 (cyanobacteria)以及 P. agglomerans 中鉴定了该合成途径的关键酶基因。IAA 生物合成的 第一步是在氨基转移酶的转氨作用下由色氨酸转化为 IpyA;在限速步骤中,吲哚-3-丙酮酸 脱羧酶(IPDC)催化 IPyA 脱羧转化为吲哚-3-乙醛(IAAld) ;最后,IAAld 氧化为 IAA。编码 限速步骤关键酶基因已从多种细菌中得到鉴定,如 Azospirillum brasilense, En. cloacae, Pseudomonas putida and Pa. Agglomerans。 在产脂固氮螺菌 (Azospirillum lipoferum) ipdC 中, 基因位于染色体上(Blaha et al., 2005) 。在巴西固氮螺菌(A. brasilense)中,该途径的插入 失活导致 IAA 生物合成降低多大 90%,显示了 IPyA 途径重要性;然而,没有获得 IAA 合 成完全缺失突变株,意味着同时还存在其他低水平 IAA 合成途径。 色胺途径(Tryptamine pathway,TAM 途径) :早已在蜡样芽孢杆菌(B.cereus)鉴定出 色氨酸脱羧酶;在固氮螺菌(Azospirillum)中,能使外源色胺转化为 IAA。胺氧化酶直接 催化 TAM 转化为吲哚-3-乙醛(IAAld) 色氨酸侧链氧化酶途径(Tryptophan side-chain oxidase pathway ,TSO 途径) :目前仅在 荧光假单胞菌(P. fluorescens CHA0)中检测到色氨酸侧链氧化酶,该酶绕过 IPyA 支路,将色 氨酸直接氧化成 IAAld,而后氧化为 IAA。 吲哚-3-乙腈途径(Indole-3-acetonitrile pathway,IAN 途径) :在细菌中,如 Alcaligenes faecalis,检测到睛水解酶(nitrilases) ,具有吲哚-3-乙腈(indole-3-acetonitrile)底物特异性。 在根癌农杆菌 (A.tumefaciens 和根瘤菌 (Rhizobium spp.) 检测到睛水合酶 中, (nitrile hydratase) 和酰胺酶(amidase)活性,表明 IAN 经 IAM 转化为 IAA。 非色氨酸途径(Tryptophan-independent pathway) :在巴西固氮螺菌(A. brasilense)中, 通过标记前体进行喂养试验,发现存在独立于色氨酸的 IAA 生物合成途径。在缺乏色氨酸 时,非色氨酸途径是 IAA 生物合成的主要途径;而通过 IAM 途径合成的 IAA 只有 0.1%。 值得注意的是,在某些细菌中存在不止一种途径。在 P. agglomerans 中,同时含有 IAM 途径基因和 IPyA 途径基因。 IAA 结合和储藏(IAA conjugation and storage) :在植物中,绝大多数 IAA 以结合态形式 存在,仅有少量的 IAA 以游离态形式存在。 结合态形式的 IAA 具有多种作用,如运输、 储藏、 保护 IAA 免受酶水解以及控制细胞内游离态 IAA 水平等。 在 Pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi 发现了一个与结合态 IAA 形成有关的基因吲哚乙酸-赖氨酸合成酶基因(iaaL), 该酶催化 ATP 依赖的 IAA 羧基与赖氨酸 ε-氨基之间形成酰胺键,将 IAA 转化成 IAA-赖氨

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酸。在细菌中,IAA 生物合成途径中的一些中间代谢物也可以转变为储藏形式的化合物,如 吲哚-3-乙酸和吲哚-3-乙醛分别还原为吲哚-3-乳酸(ILA)和吲哚-3-乙醇或色醇; 这些化合物的 功能目前尚未知。ILA 没有植物激素活性,但可以与 IAA 竞争植物体上的生长素结合位点。 2.3.5.2 基因组范围的 IAA 生物合成关键基因的筛选 目前很少有关于 IAA 生物合成关键基因或关键酶的鉴定及性质研究; 而且绝大多数研究 只涉及一个生物合成途径的某个特异性基因或特异性酶。尽管已筛选出大量产生 IAA 的菌 株,但有关 IAA 生物合成相关基因或酶方面的研究一般仅限于少量模型微生物,如根癌农 杆菌 (A. tumefaciens) 固氮螺菌 、 (Azospirillum) 阴沟肠杆菌 、 (En. Cloacae) P. Agglomerans。 和 即使在模型微生物中,由于同一菌株存在多种 IAA 生物合成途径,要想获得 IAA 合成完全 缺失突变株也是很困难的。 为全面了解细菌的 IAA 生物合成机制,对已测序的基因组进行分析。首先,选择已知 的与 IAA 合成相关的基因或酶进行 BLAST 比对。第二步,这些基因的核酸序列或蛋白质序 列用于鉴定已知基因组中的相似性蛋白。在 369 个已测序基因组中,57 个基因组 (15.4%) 含有从色氨酸前体合成 IAA 所必须的基因。基因组中存在 IAA 生物合成基因并不意味着就 能产生 IAA;仍然需要进一步的功能分析证实这些基因在 IAA 生物合成过程中的作用。固 氮弓菌(Azoarcus sp.)EbN1 基因组含有 IPyA 途径的苯丙酮酸脱羧酶基因及其他基因;然 而,该菌株并不产生 IAA 。在已测序的可能产 IAA 的细菌基因组中,编码 IPyA 途径的基 因是最丰富的(89.5%) 。在植物相关细菌基因组中,含有 IAM 和 IpyA 途径相关基因;植 物病原菌倾向于利用 IAM 途径合成 IAA 。在植物相关细菌中,IAA 生物合成并不像预期 的那样普遍:只有 19.2% 菌株含有一种或多种 IAA 生物合成途径。 2.3.5.3 细菌 IAA 生物合成的影响因素 IAA 生物合成的环境调节因子:影响 IAA 生物合成的第一类环境因子包括 pH、渗透压、 基质及碳源等。 在碳源限制、 生长速率降低或酸性 pH 条件下, 巴西固氮螺菌 (A. brasilense) IAA 生物合成关键基因 ipdC 的表达水平和 IAA 合成水平提高。 有趣的是, 碳源限制和生长 速率降低与细菌生长进入稳定期有关, 意味着细菌群体生长状态对 IAA 生物合成的重要 性,反之亦然。碳源限制和生长速率降低这两个影响因子的协同作用与以下研究结果一致: 环境胁迫相关稳态 σ 因子 RpoS 过渡产生提高了阴沟肠杆菌(E. Cloacae)和恶臭假单胞菌 (P. putida)的 IAA 生物合成水平。在巴西固氮螺菌中,pH 对 ipdC 基因表达的诱导似乎 不依赖于其他环境调控因子,对 ipdC 启动子进行的敲除和突变分析说明了这一结论。一个 受酸性调节的 σ 因子可能对 ipdC 表达的 pH 调节具有辅助作用。与固氮螺菌相反,P. agglomerans 的 ipdC 基因的表达不受 pH 调节;ipdC 受到其他环境调节因子的控制:在低 溶质或基质势条件下, ipdC 的表达水平提高 18 倍。 尽管不同细菌中环境胁迫因子对 IAA 合 成的调节具有多样性, 但有一个共同的特点,IAA 生物合成相关基因的表达受到土壤和植 物环境因子的精细调节。由于植物根细胞的质子排出,酸性 pH 是植物根际环境的一个显著

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特点。基质势可能是植物表面附着细菌遇到的另一个重要环境因子。影响 IAA 生物合成的 第二类环境因子包括植物表面的分泌物或特异性化合物。 植物分泌的类黄酮在根际积累, 刺 激根瘤菌(Rhizobium sp.)NGR234 菌株 NodD1、NodD2 和 SyrM2 依赖的 IAA 生物合成。 NodD1、NodD2 和 SyrM2 形成一个调节级联,协调基因的表达。Citrus cinensis 的叶分泌物 诱导 Xanthomonas axonopodis 的 IAA 生物合成。P. agglomerans 在植物表面生长时,IAA 合成水平显著提高, 意味着来自植物的信号与 IAA 生物合成的转录调节有关。 色氨酸是 IAA 的前体,是 IAA 生物合成水平的一个重要调节因子。在多种细菌中,添加外源色氨酸显著 提高 ipdC 表达和 IAA 生物合成水平。在植物根际,色氨酸有 2 个来源:1)植物根和微生 物细胞的降解;2)根分泌物。IAA 生物合成还受到终产物 IAA 和 中间代谢物的调节。P. savastanoi pv. savastanoi IAM 途径催化第一步的 IaaM 酶活性受到 IAM 和 IAA 的反馈抑制。 奇怪的是,在固氮螺菌中,色氨酸诱导 IAA 的生物合成;而其前体物质邻氨基苯甲酸却降 低 IAA 生物合成水平。IAA 的生物合成还受到小信号分子介导的细胞密度依赖诱导。在巴 西固氮螺菌 Sp245 中,IAA 自身能通过诱导 ipdC 基因的表达,提高 IAA 的生物合成水平。 在生物合成的反馈调节中,IAA 生物合成的自诱导或正反馈调节是非常罕见的。 IAA 生物合成的遗传调节因子:细菌 IAA 生物合成受多个遗传因子的调节。首先,IAA 合成基因在基因组中的位置。一般来讲,质粒是多拷贝的,因此位于质粒上的 IAA 生物合 成基因比染色体上的 IAA 基因具有更高的表达水平。第二,基因表达方式。根癌农杆菌(A. tumefaciens)和发根农杆菌(A. rhizogenes )的 iaaM 和 iaaH 基因位于 Ti 质粒上,转化、 整合到植物基因组中,其表达受到强组成型启动子的控制, 在植物组织中高水平地合成 IAA。 荧光假单胞菌 (P. fluorescens) CHA0 菌株的 IPyA 途径 可能是组成型表达, TSO 而 途径则是诱导性表达。 IAA 合成还受转录调控因子 RpoS 和 GacS/GacA 的调节, 控制着 IAA 生物合成基因的表达水平。ipdC 是一个典型的稳态依赖基因,IAA 生物合成起始于指数期 后期和稳定期早期,ipdC 基因的启动子区包含一个被 RpoS 识别的一致序列。固氮螺菌 (Azospirillum sp.)没有 RpoS,但有另外的 σ 因子 RpoN 和 RpoH 对 IAA 生物合成进行调 节。绿针假单胞菌(P. chlororaphis)中,GacS/GacA 对色氨酸以来的 IAA 生物合成进行负 调控。 2.3.5.4 植物-PGPR 相互作用中细菌源 IAA 的功能 研究表明, 许多 PGPR 促进植物根的生长发育与其 IAA 生物合成有关。 IAA 刺激植物根 生长发育, 进而促进其对营养物质的吸收和根分泌物的释放; 这反过来又刺激细菌在根际的 定植。 然而, 在许多情况下, IAA 对植物的刺激作用并不是独立进行的。 在恶臭假单胞菌 (P. putida)GR12-2 中,IAA 与 ACC 合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase)相互 作用,IAA 激活 ACC 合成酶,促进乙烯前体物质 ACC 的合成,而乙烯是植根生长的抑制 者;同时 GR12-2 还产生 ACC 脱氨酶,降解 ACC,使降低了根际环境 ACC 浓度,进而降 低了乙烯的量,解除其对根生长的抑制作用。

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2.3.6 PGPR 产生的挥发性化合物对拟南芥根构型的调节 产生的挥发性化合物对拟南芥根构型的调节 采用二室培养皿(divided Petri dishes)研究了PGPR产生的挥发性化合物(VOCs)对拟 南芥幼苗的促生效果。 供试菌株不同程度地刺激拟南芥生物量的形成; 与未接种的对照相比, L254, L265a, L265b 和L266 促生效果最明显,拟南芥幼苗鲜重增加了1倍。这表明VOCs与 PGPR的植物促生作用有关(Gutiérrez-Luna, et al., 2010 )。研究了接种PGPR对拟南芥根构型 的影响。分别接种4个菌株L254、 L265a、L270 和 L272a ,以未接种的作为对照,分别测 定不同处理拟南芥幼苗的初生根生长、根毛和侧根发育情况。结果表明,供试菌株既能促进 根毛的生长又能促进侧根的发育;有趣的是L254 和 L270 处理的拟南芥根分生组织尺寸减 小、而初生根直径增加。但在利用巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)进行的类似试验中, 分生组织尺寸减小与初生根生长抑制相关连。 为定量化地描述不同菌株对根构型的差异性影 响,对供试的12个菌株进一步进行接种试验,测定不同处理拟南芥初生根长度 (PRL)、 侧 根数 (LRN)、侧根长度 (LRL)和侧根密度 (LRD)。L263、 L266和L272a 明显促进初生根 的生长和侧根数的增加;与此相反,L254、L265a和 L265b 主要促进侧根的伸长,而初生 根的生长和侧根数并没有明显变化。 于根参数(PRL、LRN、LRL 和 LRD)欧氏距离(Euclidean distances)的聚类分析,所 有供试的菌株对根构型都有不同水平的影响,分为 3 个主要类群。第一群包括绝大 多数的菌株,L265b 的表现与对照处理率相似,其次是 L254 和 L270 ,这 3 个菌株主要是 增加拟南芥侧根长度(LRL) 。第二群菌株 L255 和 L272b 处理的拟南芥具有最高的侧根密 度 (LRD) 第三群菌株包括 L263、 。 L266 和 L272a, 其共同特点是显著促进初生根的生长 (PRL 值高)和侧根数目的增加(LRN 值高) ;然而其 LRD 值与未接种对照类似。拟南芥生物量 与根参数的相关性分析发现,PRL、LRN 和 LRD 与拟南芥鲜重相关性不显著,LRL 与拟 南芥鲜重相具有显著相关性。 采用 SPME-GC-MS 对 6 株 PGPR VOCs 进行分析,L254 和 L270 聚在未接种植物对照 附近;L255 和 L265a 聚在中间但对拟南芥根构型具有显著影响;L266 和 L272a 显著改变 了根的形态。 分析发现, 每个菌株都产生多种 VOCs ,醛类、酮类和醇类是最丰富的化 合物。 共鉴定出 22 种不同的 VOCs , 分别为乙酰苯 (acetophenone) 十三碳醛 、 (tridecanal) 、 十四碳醛(tetradecanal)和 6,10,14-三甲基-2-十五烷酮(6,10,14-trimethyl -2-pentadecanone) 是最丰富的的挥发性化合物(volatiles) 。L265a 产生的挥发性化合物种类最多,L265a 和 L254 产生的醛类化合物分别占总挥发性化合物的 45 %和 52%, 强烈刺激侧根的生长。 L266, 产生的挥发性化合物中几乎含有相同含量的醛类和酮类,分别为 44%和 41%,促进初生根 的伸长、侧根的形成和生物量的增加。L272a 产生不同比例的醛类和酮类化合物,分别为 50%和 39%,促进初生根的伸长。L270 产生的醇类化合物最多,占总挥发性化合物的 11% 适度影响根构型。供试的 6 个菌株中,只有 L255 产生 1-辛烯-3-醇(1-octen-3-ol) ,L265a 则 产 生 丁 内 酯 (butyrolactone) 和 2- 吗 啉 代 甲 基 1,3- 二 苯 基 - 丙 醇

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(2-morpholinomethyl-1,3-diphenyl-2-propanol) 。上述分析结果表明,各菌株对拟南芥根构型 的影响是与其产生的挥发性化合物的类型和含量相对应的。 植物根系对于水分和养分吸收具有至关重要的作用; 也是许多代谢物合成的部位, 如细胞分 裂素 (cytokinins) 和生长素(auxins), 对于植物的生长发育十分重要(Ortíz-Castro, et al., 2009)。 ) 根系在形态和生理方面具有很大的可塑性,以适应环境条件的变化。本研究发现,分离自柠 檬根际的 12 个 PGPR 菌株的植物促生特性与拟南芥根构型的调节有关,这些菌株产生的挥 发性化合物(VOCs )可能与促进植物生长和根构型的重塑相关。值得注意的是并不是所有 的菌株都能刺激拟南芥生物量的形成。例如,接种 L255、 L264、L268 和 L272b 的拟南芥 幼苗鲜重与未接种的对照并没有显著差异。PGPR 的促生效果是有菌株特异性的。在所有生 物中,挥发性化合物(VOCs)作为引诱剂(attractant) 、防护剂(repellent)或警报信号分 子(warning signals) ,是生物间化学通信的有效介体(mediators) 微生物根据不同的目的 。 产生挥发性物质(volatiles) ,如信息交流、防卫反应等(Schulz & Dickschat, 2007; Kai, et al., 2009 )。由于这些化合物的挥发性特点,植物,尤其是根系可以快速、有效地感知 PGPR 释 放的挥发性化合物(VOCs) 。采用二隔室平板测定法(divided Petri plate assay) ,发现 L254、 L265a、 L265b 和 L266 菌株强烈地促进拟南芥幼苗生物量的形成, 显著调节根的形态发生 。 尤其是生物量形成与侧根的生长之间存在显著相关性, 这意味着在 PGPR 筛选中, 侧根长度 (LRL)可能是一个很有价值的参数。植物借助于改变根构型对植物根际促生细菌 VOCs 做出 应答可能具有生态相关性,以强化根的定植、加强植物和 PGPR 之间的互惠互利关系。如果 植物向根际释放更多的碳水化合物,微生物的生物量也随之增加。从生物技术前景看,通过 这种化学信息交流,微生物促进植物根系生长发育、提高植物免疫力、提供土壤养分的可利 用性,进而影响植物的生产性能(López-Bucio, et al., 2007; Ortíz-Castro, et al.,2008)。 现已证实,细菌和真菌产生的某些分子影响植物的根构型。 巨大芽孢杆菌 (B.megaterium)UMCV1能够引起拟南芥根构型的改变。UMCV1通过降低根分生组织细胞 伸长和细胞增殖,抑制初生根的生长、增加侧根数量(LRN) 、侧根长度(LRL )以及根毛 长度。SPME-GC-MS分析发现, UMCV1产生挥发性的3-羟基-2-丁酮(乙偶姻) (acetoin) , 促进拟南芥生长。 与植物应答VOCs有关的信号机制的差异突显了这类信号传导途径的复杂性。 枯草芽孢杆 菌(B. subtilis)GB03 产生的挥发性物质通过cytokinin-ethylene 信号传导,触发植物促生过 程,解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)IN937a挥发性物质的促生作用似乎与细胞分裂 素和乙烯无关(Farag, et al., 2006),这意味着可能是其他挥发性物质与植物促进作用有关 (phytostimulation) 。尽管分离自柠檬根际的L254, L263, L265a, L265b, L266, L270, L271和

L272a 产生的VOCs促进拟南芥生物量的形成,但并没有检测到3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇。 这一结果表明, 除3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇以外, 其他的VOCs 也可以触发植物促生作用。 这些分离自柠檬根际的PGPR菌株产生的最重要的挥挥发性化合物是醛类和酮类。据文献报

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道, 其中的某些化合物具有抗微生物特性, 如2-壬烯醛 (2-nonenal ) 苯甲醛 、 (benzaldehyde) 、 乙酰苯 (acetophenone) (Sivakumar, et al., 2008)、 十三碳醛 (tridecanal) (Matasyoh, et al., 2009) 和6,10,14-三甲基-2-十五烷酮 (6,10,14-trimethyl-2-pentadecanone) (Aboaba, et al., 2009)。 L266, L270和L272a 产生1-丁醇(1-butanol)与2,3-丁二醇具有类似的化学结构。在绝大多数菌株 中还检测到长链酮类化合物包括4-癸酮(4-decanone), 6-甲基壬基甲酮, 5-tridecanone, 3-tetradecanone, 和 2-十五烷酮。L265a 还产生丁内酯,是细菌群体感应信号传导 [quorum-sensing (QS) signaling]的自诱导剂(autoinducer ) 植物根能接受QS信号,改变根 。 构型。不能排除以下可能性,在植物-微生物相互作用过程中,QS信号有可能作为VOC pool 的一部分。 2.3.7 PGPR 使植物产生诱导系统耐受性(induced systemic tolerance,IST) 植物产生诱导系统耐受性( 产生诱导系统耐受性 , ) 近年来,陆续有一些关于 PGPR 提高植物对非生物胁迫(如干旱、盐害、养分亏缺或肥 害等)耐受性的报道。新近,Yang J.和 Kloepper J.W.等建议用诱导系统耐受性(induced systemic tolerance,IST) 这一术语,表述 PGPR 诱导的植物体内物理和化学变化,增强植物 对非生物胁迫的耐受性 ( Yang , et al., 2009) (图 4)。 2.3.7.1 诱导植物对干旱的耐受性 干旱胁迫妨碍植物的生长、降低作物产量,这一现象在干旱和半干旱地区尤为常见。用 PGPR Paenibacillus polymyxa接种拟南芥,可以提高拟南芥对干旱的IST;RNA差显分析发现, 接种处理的拟南芥干旱应答基因ERD15(EARLY RESPONSIVE TO DEHYDRATION 15)的 转录水平明显提高。用产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase, ACC deaminase)的PGPR Achromobacter piechaudii ARV8接种辣椒(Capsicum annuum L.)和西红柿(Solanum lycopersicum L.),同样提高了辣椒和西红柿对干旱的耐受性。 在环境胁迫条件下,植物内源性乙烯通过调节体内平衡,降低根、茎(shoot)的生长。 PGPR产生的ACC脱氨酶可以通过分解乙烯合成的前体物质1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶,降 低植物乙烯水平,缓解环境胁迫对植物的影响,使其恢复正常生长。 近年来,人们将这些 研究成果应用到温室及大田生产中, 如采用根瘤菌和PGPR、 菌根真菌和PGPR进行协同接种 (co-inoculation) 。根瘤菌对干旱胁迫是非常敏感的,在干旱胁迫条件下,其固氮能力显著 下降。 用Rhizobium tropici 和2株P. polymyxa协同接种菜豆(Phaseolus vulgaris L.) , 提高了菜 豆根瘤数、株高和茎干重(shoot dry weight) 。有趣的是,2株P. polymyxa与根瘤菌协同接种 对菜豆IST和结瘤作用的效果要好于单一P. polymyxa与根瘤菌协同接种, 意味着PGPR菌株之 间存在协同效应。进一步研究发现,干旱胁迫影响植物体内激素平衡,植物叶片的脱落酸 (ABA)含量增加,内源细胞分裂素含量降低,诱发气孔关闭。细胞分裂素-ABA含量上的对 立可能是代谢相互作用的结果,因为他们有一个共同的生物合成前体物质。尚不确定P. polymyxa 产生的细胞分裂素是否影响植物的ABA信号转导或诱导根瘤菌的结瘤作用。在严 重干旱胁迫条件下, 用PGPR Pseudomonas mendocina 和丛枝状菌根真菌(Glomus intraradices

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或 G. mosseae) 协同接种莴苣(Lactuca sativa L.),提高了莴苣的抗氧化剂-过氧化氢酶活性, 表明PGPR Pseudomonas mendocina 能够减轻干旱引发的氧化损伤。 2.3.7.2 诱导植物对盐害的耐受性 在干旱地区,土壤盐害是农作物生产的重要限制因素。研究表明,在高盐条件下,用 Achromobacter piechaudii进行接种,番茄幼苗的乙烯含量降低,促进番茄幼苗生长,表明该 菌株产生的ACC脱氨酶发挥了作用。用已商业化的枯草芽孢杆菌(B. subtilis)GB03 接种拟 南芥也取得了相似的结果,提高了拟南芥对盐胁迫的IST。有趣的是,GB03产生的一些挥发 性有机化合物(volatile organic compounds ,VOCs)是与IST 相关的决定因子。拟南芥的高亲 和性K+运输蛋白基因(HIGH-AFFINITY K+ TRANSPORTER 1,HKT1)控制根对Na+的吸收; HKT1的转录表达是组织依赖性,以调节Na+和K+在不同组织中的水平。拟南芥athkt1突变体 暴露于GB03产生的VOCs时,不仅表现出典型的盐胁迫症状,如萎缩, 幼苗生长受到抑制。 转录分析发现,GB03产生的VOCs使根组织HKT1的转录表达下调,而使茎组织HKT1的转录 进一步研究发现, +-输出突变体 Na (salt 表达上调, 进而使整个植株的Na+ 维持在较低水平。 overly sensitive3 , sos3)暴露于GB03产生的VOCs时, 其盐胁迫的IST与野生型拟南芥无差异, 这表明茎组织里HKT1的功能是负责茎从根木质部获获取Na+,从而有利于茎-根Na+的再循 环。概言之,在盐胁迫条件下,植物感知PGPR的VOCs信号,对HKT1进行组织特异性表达 调控,控制Na+的体内平衡,减轻盐胁迫对植物的伤害。

示意图 图 4 PGPR 诱导植物产生 IST 示意图 注:虚箭头表示 PGPR 分泌的生物活性化合物(细胞分裂素、吲哚乙酸 IAA、抗氧化剂、ACC 脱氨酶、挥 发性物质) ;实箭头表示受 PGPR 生物活性化合物影响的植物体内化合物(脱落酸 ABA、活性氧 ROS、1氨基环丙烷 1-羧酸 ACC、乙烯、高亲和性 K+运输蛋白 HKT1) 。

2.3.7.3 诱导植物对养分亏缺或肥害的耐受性 植物所面临的另一个非生物胁迫是土壤养分供应。尽管化学肥料的施用是植物生产所必 须的,但也带来严重的环境问题,硝酸和磷酸盐的积累是水体和面源污染的重要污染源。施

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肥对环境的危害部分地归咎于作物对养分的低吸收效率。 PGPR 通过产生生长素、 细胞分裂 素等促进跟的生长发育、改变根构型,增加根表面积和根尖数量。PGPR 对植物根的这种刺 激作用也与诱导系统耐受性(IST)有关。根尖和根面是植物吸收养分的部位,刺激根的生 长发育及构型改变可能是 PGPR 促进养分吸收的一个机制。也有研究者提出,PGPR 通过刺 激质子泵 ATP 酶(proton pump ATPase)促进植物对矿物质离子的吸收,尽管尚缺乏实验证 据。 有研究表明, PGPR 的应用能够在减少化学肥料使用量的情况下维持作物的正常生产力, 初步研究结果是令人乐观的。例如,在田间条件下,接种 PGPR、化学肥料为 75%正常量的 处理小麦产量与不接种 PGPR、正常施肥处理的相当。在温室条件下,接种 2 株 PGPR、化 学肥料为 75%正常量的处理番茄幼株干重比不接种 PGPR、正常施肥处理的还要高;移栽到 大田后,协同接种 PGPR 和菌根真菌、50%正常量的处理番茄产量高于不接种的正常施肥 量对照。这些研究结果表明,在不降低作物产量的前提下,PGPR 的应用完全可以实现化学 肥料的减量化。 2.4 PGPR 产品的商业化应用进展 美国拜耳作物科学(Bayer CropScience)公司经过多年研究,利用 PGPR 菌株开发出两 个新型生物农药 Kodiak? Concentrate 和 Yield Shield? Concentrate Biological Fungicides, 获 得 EPA 登记,投放市场。Kodiak? Concentrate 和 Yield Shield? Concentrate 生物农药用于 商品化种子的处理。将基于芽孢杆菌(Bacillus)PGPR 与传统的化学农药对作物种子进行组 合处理取得成功,与传统的单一化学农药相比,防病效果更好,防效时间大大延长。 加拿大BrettYoung 公司从事PGPR研发已有10多年历史。目前,主要有两个PGPR产品投 放市场。BioBoost?由分离自植物根际的代尔夫特氏菌(Delftia)发酵而成的PGPR接种剂, 适用于处理油菜种子,促进油菜生长。BioBoost? Plus 是由食酸代尔夫特氏菌(Delftia acidovorans)和大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)组合而成,用于大豆种子的接 种处理,促进大豆生长发育、提高产量。这两个 PGPR 产品已获得专利保护。目前,该公司 正在开发具有硫氧化作用的 PGPR 制剂,用作油菜、大豆、苜蓿和玉米接种剂,促进作物生 长、改进品质、提高产量。田间效果评价表明,由食酸代尔夫特氏菌(Delftia acidovorans) 和苜蓿中华根瘤菌(Shinorhizobium meliloti)组合而成的 AlfaBoost 以及由 Achromobacter piechaudii 生产的 CornBoost 具有良好的推广应价值。 Becker Underwood(加拿大)有限公司利用 PGPR 菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) MBI 600 生产的 Subtilex?产品是获得 EPA 注册登记的生物农药,对镰刀菌(Fusarium) 、 丝核菌(Rhizoctonia) 、链格孢(Alternaria)等土传真菌病原菌具有很强的抑制作用。该产 品为固体剂型,有效活菌数不少于 5 x 1010 cfu/g。可以用于拌种(棉花、花生、蔬菜、大豆、 苜蓿、牧草等) ,也可以与泥炭等混合稀释后进行沟施。利用 MBI 600 菌株生产注册登记的 Integral?产品为液体剂型,可用于浸种、灌根等。2004 年,Becker Underwood 公司利用 “BioStacked? Technology” , PGPR 菌株与根瘤菌进行有效组合, 将 开发出第一个 BioStacked

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产品 VAULT?,用于大豆、花生接种,激活根瘤菌结瘤过程、提高根瘤菌在大豆、花生种 子表面的存活能力。 绝大多数商品化的 PGPR 产品是在无菌条件下单一菌株或几个菌株的组合生产的。 美国 Advanced Microbial Solutions(AMS)利用一个复杂微生物群落发酵过程,生产制造出一种 土壤改良剂 (soil amendment) 这类产品除含有有益的微生物菌群外, 。 还含有微生物副产物。 通过微生物群落发酵过程生产的农用微生物制剂具有复杂的生理生化和生物学特性, 不仅具 有促进植物生能力, 而且具有改善土壤的功能。 该发酵技术比传统的土壤改良剂发酵技术具 有显著的优点。AMS 产品最突出的特点就是多功能性,主要包括 4 个方面: (1)降低土壤 盐渍度; (2)改善土壤结构,降低土壤容重和密实度; (3)提高土壤湿度; (4)促进植物营 养吸收。 在世界范围内, 提高肥料利用率和改善土壤水分供给是农业生产中尤其重要的方面。 应用效果试验结果表明,AMS 产品能够提高植物耐盐性,提高土壤透水性和保水能力,在 化学肥料用量减少 10–20%情况下,仍具有增产效果。这些有益的作用已经超出了我们目前 对微生物肥料的认识,尤其是高度定向 PGPR 的应用方面。

3 前瞻性展望与应用前景
3.1 前瞻性展望 3.1.1 PGPR菌株的大规模筛选与应用研究 菌株的大规模筛选与应用 菌株的大规模筛选与应用研究 植物具有丰富的遗传多样性,尽管几十年来进行了许多植物PGPR的筛选鉴定研究,但仍 有大量的植物尚未涉及。因此,PGPR菌株筛选鉴定以及温室和田间条件下的促生、生防效 果仍然是今后一段时期十分重要的研究内容。 3.1.2 PGPR分子生态学 分子生态学 PGPR在植物根际的生态学规律是其能否发挥作用的关键。 从分子水平, 着重开展以下几 各方面的研究工作:1)PGPR在植物根际定植规律;2)PGPR与植物根际微生物群落相互关 系;3) PGPR-植物相互作用规律。 3.1.3 PGPR功能基因组学 功能基因组学 功能 PGPR功能基因组学是近年来以及今后很长时期重点研究的内容之一。 主要包括以下几个 方面:1) PGPR基因组测序及注释;2)PGPR转录组分析;3) PGPR蛋白质组分析;4) PGPR代谢组分析;5)生物活性物质的基因组发掘;6)生物活性物质的代谢调控。 3.1.4 PGPR作用机制 作用机制 重点开展以下几个方面的研究:1)PGPR植物促生分子机制;2) PGPR生防分子机制; 3) PGPR诱导植物系统耐受性机制(证明PGPR诱导不同作物对各种非生物胁迫的耐受性; 阐明非生物胁迫条件下,PGPR诱导植物产生ISI的信号转导途径) 。 3.2 PGPR应用前景 应用前景 大量研究与生产实践表明,在农业可持续发展中,PGPR 展示出广阔的的应用前景。 3.3.1 PGPR 在克服作物连作障碍中的应用
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我国现有作物种植模式及农业生产措施,导致作物连作障碍普遍发生,并日益严重,已 经成为制约我国农业可持续发展的瓶颈问题之一。 人们普遍认为土传病害的积累、 营养不平 衡以及植物产生自毒物质是引起作物连作障碍的关键因素。 生产实践表明, 单纯依赖化学肥 料、化学农药不能从根本上解决作物的连作障碍问题;PGPR的应用是根治作物连作障碍的 最行之有效的途径。PGPR来自于作物根际环境,制造成PGPR制剂施用到作物根际环境,具 有良好的环境适应性,在作物根际长期稳定地定植,进行各种代谢过程,发挥多种功能。在 生长繁殖过程中,持续不断地产生抗生素、抗菌蛋白、病原菌细胞壁水解酶、抑制性VOCs 等生物活性物质,抑制或杀死植物病原菌;PGPR还能够诱导作物产生系统抗性,提高作物 的抗病性。PGPR能够产生水解酶,降解植物产生的自毒物质,解除其对作物自身的危害; PGPR还能通过各种代谢活动,促进土壤养分释放;通过产生生长素、细胞分裂素、VOCs 等,促进作物根系生长发育,提高作物对养分的吸收能力,有效缓解作物的营养平衡问题。 3.3.2 PGPR 在作物逆境生产中的应用 作物生产过程中,经常遭遇干旱、积水、盐害、养分亏缺或肥害等恶劣环境条件的影响。 PGPR 能够诱导作物产生对非生物胁迫的耐受性,有助于作物在逆境条件下的生长。深入研 究 PGPR 诱导植物 IST 形成机制,筛选产生不同特异性 IST 决定因子的 PGPR(如细胞分裂 素、IAA、ACC 脱氨酶、VOCs 和抗氧化剂等产生菌),进行菌株组合优化,在解决作物生 产中经常遇到的非生物胁迫方面具有广阔的应用前景。 3.3.3 PGPR 在豆科作物生产中的应用 PGPR 在大豆、花生、苜蓿等豆科作物生产中应用,除具有防病、促生效果外,可以作 为根瘤菌的“助手”细菌,与根瘤菌协同接种,提高根瘤菌在种子表面的存活能力,激活根瘤 菌结瘤过程,显著提高根瘤菌接种剂的效果。 3.3.4 PGPR 在土壤修复中的应用 近年来,利用 PGPR 对污染土壤进行生物修复方面的研究受到持续关注。PGPR 能够降 解各种化学农药,减少农药对环境及农产品的污染。利用 PGPR 对重金属进行钝化;PGPR 促进具有生物修复功能的植物生长,显著提高重金属清除效果。

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4株根际促生菌对核桃生长及生理特性的影响
作者:王君等 来源:《山东农业科学》2014 年第 04 期 摘要:采用盆栽试验,研究了 4 株核桃根际促生菌 (PGPR) X12、X65、X95、X128 对 核桃苗的促生作用。...
NDF培养基
植物根际存在各种微生物,2-5%的细菌能促进植物生长,增加作物产量,被称为根际 促生细菌(PGPR),植物根际促生细菌的研究对开发植物专化型微生物菌剂,促进农作物增...
植物病害生防菌的主要类群
生防真菌研究较多的有木霉、粘帚霉、拟青霉等。已知的木霉 9 个主要种中有...6%~14.4%和 16.5%~28.1%;着名的植物根际促生细菌(PGPR)亦主要为荧光 假...
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