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植物学实验基本技能


普通光学显微镜的构造和使用
一、显微镜构造 显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成(图 1-1)。

光学显微镜的构造(图 1-1) 1. 物镜转换器 2. 接物镜 3.游标卡尺 4.载物台 5.聚光器 6. 彩虹光阑 7.光源 8. 镜座 9. 电源开关 10. 光源滑动变阻器 11. 粗调螺旋 12. 微调螺旋 13. 镜臂 14.镜筒 15.目镜 16.标本移动螺旋

1.机械装置 镜座(base)和镜臂(arm)镜座位于显微镜底部,呈马蹄形,它支持全镜。 镜臂有固定式和活动式两种,活动式的镜臂可改变角度。镜臂支持镜筒。 镜筒(body tube)是由金属制成的圆筒,上接目镜,下接转换器。镜筒有 单筒和双筒两种,单筒又可分为直立式和后倾式两种。而双筒则都是倾斜式的, 倾斜式镜筒倾斜 45°。双筒中的一个目镜有屈光度调节装置,以备在两眼视力 不同的情况下调节使用。 转换器(no sepiece)为两个金属碟所合成的一个转盘,其上装 3—4 个物 镜,可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。 载物台(stage)又称镜台,为方形或圆形的盘,用以载放被检物体,中心 有一个通光孔。在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹,用以固定标本;有 的装有标本推动器, 将标本固定后, 能向前后左右推动。 有的推动器上还有刻度, 能确定标本的位置,便于找到变换的视野。

调焦装置 是调节物镜和标本间距离的机件,有粗动螺旋(coarse adjustment)即粗调节器和微动螺旋(fine adjustment)即细调节器,利用它 们使镜筒或镜台上下移动,当物体在物镜和目镜焦点上时,则得到清晰的图像。 2.光学系统 物镜(objective)物镜安装在镜筒下端的转换器上,因接近被观察的物体, 故又称接物镜。 其作用是将物体作第一次放大,是决定成像质量和分辨能力的重 要部件。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如: NA0.30;10×;160/0.17;16mm。其中“NA0.30”表示数值孔径(numerical aperture,简写为 NA),“10×”表示放大倍数,“160/0.17”分别表示镜筒 长度和所需盖玻片厚度(mm),16mm 表示焦距。 目镜(ocular lens)装于镜筒上端,由两块透镜组成。 镜把物镜造成的像 再次放大,不增加分辨力,上面一般标有 7×、10×、15×等放大倍数,可根据 需要选用。一般可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的 500—700 倍,最 大也不能超过 1000 倍的选择。目镜的放大倍数过大,反而影响观察效果。 聚光器(condenser)光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射标本,增 强照明度和造成适宜的光锥角度,提高物镜的分辨力。聚光器由聚光镜和虹彩光 圈(iris diaphragm)组成,聚光镜由透镜组成,其数值孔径可大于 1,当使用 大于 1 的聚光镜时,需在聚光镜和载玻片之间加香柏油,否则只能达到 1.0。 虹彩光圈由簿金属片组成,中心形成圆孔,推动把手可随意调整透进光的强弱。 调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小,可得到适当的光照和清晰的图像。 光源 (light source) 较新式的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内, 通过按钮开关来控制; 老式的显微镜大多是采用附着在镜臂上的反光镜,反光镜 是一个两面镜子,一面是平面,另一面是凹面。在使用低倍和高倍镜观察时,用 平面反光镜;使用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。 滤光片 (filter) 可见光是各种颜色的光组成的, 不同颜色的光线波长不同。 如只需某一波长的光线时, 就要用滤光片。 选用适当的滤光片, 可以提高分辨力, 增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色的, 分别透过不同波长的可见光, 可根据标本本身的颜色,在聚光器下加相应的滤光 片。

3.油镜物镜的基本原理
微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜(16mm,10×)、高倍物镜 (4mm,40—45×)和油镜(1.8 mm,95—100×)三种。油镜通常标有黑圈或 红圈,也有的以“OI(oil immer-sion)字样表示,它是三者中放大倍数最大的。 根据使用不同放大倍数的目镜,可使被检物体放大 1000—2 000 多倍。从图Ⅲ-3 中可看出油镜的焦距和工作距离 (标本在焦点上看得最清晰时,物镜与样品之间 的距离)最短,光圈则开得最大,因此,在使用油镜观察时,镜头离标本十分近, 需特别小心。 使用时, 油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气,而是 隔一层油质,称为油浸系。这种油常选用香柏油,因香柏油的折射率 n=1.52, 与玻璃相同。当光线通过载玻片后,可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。 如果玻片与物镜之间的介质为空气,则称为干燥系,当光线通过玻片后,受到折

射发生散射现象,进入物镜的光线显然减少,这样就减低了视野的照明度(图 1-2)。

(图 1-1)

利用油镜不但能增加照明度,更主要的是能增加数值孔径,因为显微镜的放 大效能是由其数值孔径决定的。 所谓数值孔径,即光线投射到物镜上的最大角度 (称为镜口角)的一半正弦,乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积,可用 下列公式表示: NA=n·sinα 式中 NA=数值孔径;n=介质折射率;α =最大入射角的半数,即镜口角的半数。 因此,光线投射到物镜的角度愈大,显微镜的效能就愈大(图Ⅲ-5),该角 度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时,α 的理论限度为 90°,sin90°=1, 故以空气为介质时(n=1),数值孔径不能超过 1,如以香柏油为介质时,则 n 增大, 其数值孔径也随之增大。 如光线入射角为 120°, 其半数的正弦为 sin60° =0.87,则: 以空气为介质时: NA=1×0.87=0.87 以水为介质时: NA=1.33×0.87=1.15 以香柏油为介质时: NA=1.52×0.87=1.32 显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。 它与物镜的 数值孔径成正比,与光波长度成反比。因此,物镜的数值孔径愈大,光波波长越 短, 则显微镜的分辨力愈大, 被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。 因此, 一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离,这两个因素是成反比关系的,通常

有人把分辨力说成是多少微米或纳米, 这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆 起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。

式中λ =光波波长。 我们肉眼所能感受的光波平均长度为 0.55μ m,假如数值孔径为 0.65 的 高倍物镜,它能辨别两点之间的距离为 0.42μ m。而在 0.42μ m 以下的两点之 间的距离就分辨不出,即使用倍数更大的目镜,使显微镜的总放大率增加,也仍 然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜,增加其分辨力才行。例如用数值孔 径为 1.25 的油镜时,能辨别两点之间的

因此,我们可以看出,假如采用放大率为 40 倍的高倍物镜(NA=0.65), 和放大率为 24 倍的目镜, 虽然总放大率为 960 倍, 但其分辨的最小距离只有 0. 42 μ m。假如采用放大率为 90 倍的油镜(NA=1.25),和放大率为 9 倍的目镜,虽 然总的放大率为 810 倍,但却能分辨出 0.22μ m 间的距离。

二、显微镜使用步骤
1.观察前的准备 (1)显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时,要用右手紧握镜臂,左手托住镜 座,平稳地将显微镜搬运到实验桌上。 (2) 将显微镜放在自己身体的左前方,离桌子边缘约 10cm 左右,右侧可 放记录本或绘图纸。 (3) 调节光照:不带光源的显微镜,可利用灯光或自然光通过反光镜来调 节光照, 光线较强的天然光源宜用平面镜;光线较弱的天然光源或人工光源宜用 凹面镜,但不能用直射阳光,直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将 10× 物镜转入光孔, 将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置,用左眼观察目镜中视野 的亮度, 转动反光镜, 使视野的光照达到最明亮最均匀为止。 自带光源的显微镜, 可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。凡检查染色标本时,光线应强;检查未染 色标本时,光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调 节光线。 2.低倍镜观察 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大, 易于发现目标和确定检查的位置。 将标本片放置在载物台上,用标本夹夹住,移动推动器,使被观察的标本处 在物镜正下方,转动粗调节旋钮,使物镜调至接近标本处,用目镜观察并同时用 粗调节旋钮慢慢下降载物台,直至物像出现,再用细调节旋钮使物像清晰为止。 用推动器移动标本片,找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。 3.高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜,低倍、高倍镜头是 同焦的,在转换物镜时要从侧面观察,避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察, 调节光照,使亮度适中,缓慢调节粗调节旋钮,慢慢下降载物台直至物像出现,

再用细调节旋钮调至物像清晰为止,找到需观察的部位,并移至视野中央进行观 察,并准备用油镜观察。 4.油镜观察 (1)用粗调节器将镜筒提起约 2cm,将油镜转至正下方。 (2)在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 (3)从侧面注视,用粗调节器将镜筒小心地降下,使油镜浸在香柏油中,其镜 头几乎与标本相接,应特别注意不能压在标本上,更不可用力过猛,否则不仅压 碎玻片,也会损坏镜头。 (4)从接目镜内观察,进一步调节光线,使光线明亮,再用粗调节器将镜筒徐 徐上升,直至视野出现物像为止,然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面 而仍未见物像,必须再从侧面观察,将油镜降下,重复操作至物像看清为止。 5. 观察完后复原 下降载物台,将油镜头转出,先用擦镜纸擦去镜头上的油,再用擦镜纸蘸少 许乙醚乙醇混合液擦去镜头上残留油迹, 最后再用擦镜纸擦拭 2—3 下即可, (注 意向一个方向擦拭)。 将各部分还原,转动物镜转换器,使物镜头不与载物台通光孔相对,而是成 八字形位置,再将载物台下降至最低,降下聚光器,反光镜与聚光器垂直,最后 用柔软纱布清洁载物台等机械部分,然后将显微镜放回柜内或镜箱中。

6.注意事项
1.学生使用显微镜固定镜号、位置,填写使用卡,本学期一直使用本台显微镜。 2.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏 3.镜面只能用擦镜纸擦,不能用手指或粗布,以保证光洁度。 4.观察标本时,必须依次用低、高倍镜,最后用油镜。当目视接目镜时,特别在 使用油镜时,切不可使用粗调节器,以免压碎玻片或损伤镜面。 5.观察时,两眼睁开,养成两眼能够轮换观察的习惯,以免眼睛疲劳,并且能够 在左眼观察时,右眼注视绘图。
6.拿显微镜时,一定要右手拿镜臂,左手托镜座,不可单手拿,更不可倾斜拿。

徒手切片的制作
一、实验材料及器材的准备 1、锋利的刀片。 2、洁净的载玻片、盖玻片。 3、盛清水的培养皿。 4、毛笔、镊子等。 二、实验材料的处理 1、软硬适中、便于手持的材料,一般截成小块(长 2~3cm,切片断面不超过 3~5mm2) 。

2、过于柔嫩的器官,可选用胡萝卜根或土豆块茎作为夹持物。夹持物截成规范的小块,再 用刀从一端的中线纵向劈开(不要劈到底) ,以夹住材料。 如新鲜蚕豆叶片,切去叶柄、叶尖和叶缘后,切成长度和宽度都小于夹持物劈缝的长方 块,再放入夹持物劈缝中。 3、有些叶片可以卷成圆筒再进行切片。 三、握夹持物和持刀 用左手的拇指和食指捏紧夹有叶片的夹持物, 并使其劈缝与自己本身平行, 拇指要稍低 于食指,以免被刀割破。夹持物上端要略握夹持物和持刀低于食指,以免被刀割破。夹持物 上端要略高于手指,但勿过高,以防切割时夹持物和刀摇动。 右手拿刀将刀片平稳地放在左手食指上,与材料切面平行。 四、拉切 这是切片的关键阶段。 沾水的刀口保持水平对着夹持物,自左前方向右后方,以均匀、快捷的动作,斜着向后 进行连续拉切。切时用臂力而不用腕力。如此循环多次,切下许多薄片后,把切下的薄片, 迅速用毛笔刷入清水中备用。 五、制片 用毛笔挑选透明的薄片,制临时装片。 六、注意事项实验器材的准备 1、在切片前,要不断地用水湿润材料和刀片。 2、夹持物上端要保持表面平整。 3、切片时,双手应该保持活动状态,不要使它们紧靠身体或实验台。 4、用力不要过猛,不能用刀片挤压材料或来回切割材料。 5、动作要敏捷,材料要一次切下,不要追求切片形状的完整。速度要快,才能切得又薄又 平。

临时装片法
植物学实验中常需借助显微镜来观察、 研究一些新鲜植物材料的细胞、 组织和器官的微 细结构。 对于这些只要求临时观察的内容, 通常是先以徒手切片法将这些植物材料切成薄片, 再用临时装片标本法制成临时装片, 以便在显微镜下观察。 而对于一些小的或扁平的材料 (如 单细胞、丝状或叶状的藻类、菌类、蕨类的原叶体和孢子囊、纤细的苔藓植物等等) ,则可 以直接制成临时玻片标本加以贯彻。以上方法的使用,既简单又快捷,同时可以保持材料的 生活状态和天 然的色彩。 1. 清洁玻片 将载玻片和盖玻片用清水洗净, 再用纱布擦干。 擦玻片时用左手食指和拇指夹住玻片的 两边,右手食指和拇指包住纱布,同时擦到的玻片的两面,用力要均匀。 注意:盖玻片薄脆易碎,擦拭时要特别小心,用力要轻而均匀。

2. 放置材料 将载玻片平放在桌面上, 中央加一滴蒸馏水或稀甘油, 然后用镊子镊取或吸管吸取少量 植物材料,放在水滴或甘油中,再用镊子和解剖针将材料小心的展平或分散开,避免材料折 叠或干燥。 3. 盖片 大拇指和食指拿着盖玻片的两个角或用镊子夹住其一端, 使盖玻片的一边先与载玻片上 的水滴边缘接触 ,而后徐徐放下另一边,当盖玻片被夹持的一边将贴近载玻片时,则可放 手或抽出镊子,使其自然轻轻复盖,这样可以挤出盖玻片下的空气,避免产生气泡。 注意:载玻片中央的液滴量要适中,使其恰好充满盖玻片下方。盖玻片的上面及载玻片的 其他区域必须保持干燥。液滴量如果不够,易产生气泡,可用吸管小心地从盖玻片的边上再 滴入一小滴水,使它和盖玻片下面的水相接触;如果水太多,溢出盖玻片,会使盖玻片浮动 或从盖片下外溢,此时可用吸水纸吸去。 4. 染色 如需染色, 临时水装片做好后直接在盖玻片的一侧加一滴染液, 用吸水纸条在盖玻片的 另一侧吸水,引入染液,静置片刻,以使盖片下的材料均匀着色。 5. 镜检 注意:用以临时观察,不欲久留的装片均可用水封片,制成水装片;需要提前半天或一 天就备出的装片或者观察后须保留一定时间的装片, 则适宜制成甘油装片, 以防止水分蒸发, 出现材料收缩现象。用甘油封片时,保留时间短者,可用 10%甘油水溶液,保留时间长者则 须从 10%甘油中再转入 50%甘油水溶液中, 或浸后再转入纯甘油中封片。 甘油装片的不仅可 使封片保留较长的时间,且有加强材料透明的作用。 如装片效果理想, 也可根据需要选择适宜的染料染色, 制成永久制片或用某些化学试剂 作组织化学反应。

植物学绘图方法
在实验报告中, 或是在将来的科学研究报告中,都需要用一些细胞结构图或 轮廓图来表些组织或器官的结构。尽管目前显微摄影已很普遍,但有时也要衬以 简洁的线条图以使所显示结构更加清晰。因此,在学习过程中有必要掌握正确的 绘图方法和技巧,现简要说明植物学绘图方法。 1. 首先要注意科学性和准确性。必须认真观察要画的对象,学习有关的文 字记载、 实验指导等, 正确理解各部特征, 才能在绘图时保证形态结构的准确性, 并说明某一科学问题。绘图前先要把你所需要画的对象观察仔细,各部分的结构 都要看清楚,同时要把正常的结构与偶然的、人为的一些“结构”区分开,然后 选那些有代表性的典型的部位进行绘图。 2. 画图前还要确定你所要画的图在报告纸上的位置和大小,然后才能开始

画。不能任意地、毫无计划地在纸上画图,这样常常会使所画的图在纸上的位置 不当, 或过大过小都会影响注字和说明。一般根据在报告纸上要画几个图来确定 位置,如果要画两个图,那么先要在报告纸上方留下一部分空档,以便写本次实 验名称,余下部分可一分为二,作为画两个图的地方,一定要在报告纸上方规定 位置上写上班级、专业、姓名、学号、日期。 3. 当画图的位置确定以后,就要确定图的大小,一般要尽可能地把图画大 一些。如果画的是细胞图,为了清楚地表明细胞内部结构,所画细胞不宜过多, 只画1-2个即可。如画器官的结构图,也不一定把全部切面(如根或茎的横切面) 画出,只画1/4-1/8部分即可。 4. 画图时先用HB铅笔起草,如果画细胞结构图,要把细胞的轮廓轻轻描出。 描图时要不断地观察显微镜, 注意细胞轮廓的大小宽窄、长短等是否与观察的细 胞相符合,同时也要主意细胞的内部结构。当草图与实物基本相符合后,用3H? 或4H把各部分的结构画出来。 5. 绘制生物组织结构的黑白线条图,要求所有线条都非常均匀、平滑,不 可有深浅、虚实之分;要用点来表示不同部位颜色的深浅或距离的远近,切忌采 用艺术画中写生的画法。画线条要尽可能一气呵成,不要反复描绘;点点要点得 圆、点得匀,不要等画好后,看得太疏而有些不顺眼,再加点子,再加的点子反 而会显得不均匀。 6. 绘细胞结构图时,细胞壁要用线表示,原生质体内的结构(如细胞质、 细胞核等)要用不同疏密的小点表示。细胞与其他细胞相连接处画出一些来,以 表示所画的细胞不是孤立的。 7. 绘组织结构的细胞图时,不一定把全部的切面(如根或茎的横切面)都 画出来,只画其中一部分即可,但要清楚地表明各部分细胞的形状、大小、排列 方式,一般细胞的内部结构不必表示。 8. 轮廓图与细胞图一样,也要注意各部分结构的比例、大小,区别是不用 画出每一个细胞, 只需用一些轮廓线把各部分结构在切片中所占的比例以及不同 部分排列的相对位置表示出来即可。 9. 图画好后,要再与显微镜下实物对照,检查一下有无遗漏或错误,然后 把各部分的名称注出,同时在图下方注出图的名称。注字时要尽可能详细些,所 注的字最好在图右边一侧,用平行线引出,排列要整齐。 10.注字及画图一定要用铅笔,不要用钢笔、圆珠笔或颜色铅笔。


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