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D不同氮素营养条件下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究


南开大学 硕士学位论文 不同氮素营养条件下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特 征的影响研究 姓名:王金龙 申请学位级别:硕士 专业:生态学 指导教师:高玉葆 2002.5.1

不同氮索营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙


f多年生黑麦草(Lolium





perenne£.)为禾本科(Gramineae)羊茅亚科

~ (Febtuooideae)羊茅族黑麦草属(Lolium)植物,原产于欧洲地中海沿岸,北非及亚
洲西南,是欧洲最古老的牧草之一,十三世纪已在意大利北部草地上生长。目前在欧

洲大陆的温带及澳大利亚、新西兰、英国、美国等许多国家广泛作为乳牛、肉牛和 羊的干草和放牧之草,对这些国家畜牧业的发展起了很大的作用。我国自四十年代
从国外引进栽培后,黑麦草在农、牧业生产以及环境绿化中均发挥着重要的作用。 内生真菌(Endophyte,EndophytiC fungi或Fungal endophyte),是存在于 健康植物的茎叶中,形成不明显侵染的一类真菌。很多禾本科植物与内生真菌的关 系是互惠共生的,表现在一方面植物为内生真菌提供光合产物和营养物质;另一方 面内生真菌的代谢物能刺激植物的生长发育,提高宿主植物对生物胁迫(如食草动 物的取食、虫害和病害等)和非生物胁迫(如高温、干旱等)的抵抗能力。内生真

菌已经在多种植物类群中发现,在禾本科植物电尤为常见,现已在80个属的290多种

、/ 禾本科植物中发现有与之共生的内生真菌。I,
关于内生真菌对多年生黑麦草生长发育及抗逆性的影响,国内外学者都做了不 少工作。但是关于不同氮水平下内生真菌对黑麦草生长发育的影响这方面的工作较 少,涉及到黑麦草光合、蒸腾等生理特征的就更少了。鉴于这种情况,我们以多年 生黑麦草SR4000为实验材料,研究内生真菌(Neotyphodiumlolli)在不同氮水平 对SR4000生长和生理特性的影响,以期发现氮素和内生真菌两个因素对多年生黑麦

草营养生长的作用,从而为更好地在我国发展黑麦草以及进一步认识内生真菌和植
物的关系提供依据。


f实验是两因素随机区组化设计,实验前我们通过对黑麦草SR4000幼苗进行了


内生真菌检测,建植了内生真菌感染(EI)种群和内生真菌未感染(EF)种群:然
后进行了低、中、高浓度氮肥处理(相当于1img氮/升、73mg氮/升、220mg氮/升)。
每个区组重复5次。实验是从2001年5月28日开始,到2001年lO月31日结束, 一共持续约150天。为了保证黑麦草的正常生长,这个期间共刈割两次,一次是在
7月8 El,另一次是在8月27日。因此,实验过程可以分为三个处理期。在每个处


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理期里,测定一些生长指标(叶片长度、叶片宽度)和生理指标(净光合速率、蒸 腾速率、气孔导度、细胞间隙C02浓度),同时也记录测定上述指标时的环境因子 (光合有效辐射、大气温度、大气湿度、叶片温度、大气C02浓度的变化)。另外, 实验前后还对黑麦草所在土壤的水分常数、有机质含量、全氮含量、有效磷含量、
速效钾含量以及pH值做了测定。 在生长指标方面发现,内生真菌感染对黑麦草叶片延伸速率有一定的影响,随

着时间的延长,E1种群的优势越来越明显。以E12为例,第一处理期时其叶片长度 累积值是6种处理中最低的,但在第二处理期E12的叶片长度累积值位于6种处理 中间水平,在第三处理期时E12的叶片长度累积值已是6种处理中最高水平的。氮
水平对黑麦草叶片延伸速率影响不如内生真菌明显。EI和EF种群的各个处理间的

叶宽累积值在实验过程期间均无显著性差异。值得注意的是,同叶长一样,E1种群 的优势越来越明显,例如E12的叶片宽度累积值在第一处理期时是最低的,到了第 三处理期就位于较高水平了。这说明内生真菌感染对黑麦草叶片宽度也有一定的影
响。氮水平对黑麦草叶片宽度的影响不如内生真菌明显。由于叶面积值取决于叶长

和叶宽,所以其变化规律和叶长、叶宽密切相关。内生真菌感染对黑麦草叶面积也 有一定的影响,随着时间的延长,E1种群的优势越来越明显。氮水平对黑麦草叶片
面积的影响不如内生真菌明显。

在生理指标方面发现,不论是第一处理期、第二处理期,还是第三处理期, 内生真菌感染(EI)种群比非感染(EF)种群之间的净光合速率总体上要高一些。 在蒸腾速率、水分利用效率和气孔导度上,随着旆氮时间的延长,内生真菌感染(EI) 种群的优势渐趋明显。不管是在净光合速率、蒸腾速率、水分利用效率还是气孔导
度上,氮素的影响都没有内生真菌的影响大。在细胞间隙C02浓度
和EF的

各个氮水平以及同一氮水平下的EI和EF种群之间均无显著性差异 总之,内生真菌通过自身代谢产物作用于黑麦草,对于黑麦草的某些生长和生 理特性是有一定的促进作用的。

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至型墨重要鲞!塑竺兰堕壁鲞翌墨窭苎董王兰兰塑生堡堑堡塑墅堕塑窒兰全垄 Abstract

Perennial ryegrass(Lolium perenne£.)is



widespread caespitose grass common in
an

pastures and lawns of the United States,Europe and Australia.It is

important forage

crop in many parts of the world;in addition,numerous cultivars have been developed for
use

in providing
an

cover

on

public ground and suburban lawns.Perennial ryegrass is

playing

important role in

agriculture,stoekbreeding
and

and virescence,SO

it is of

practical value to study the morphological
ryegrass under


physiological characters of the perennial

given condition.

Plants

are

frequently infected with endophytic fungi which.for all of living plants without causing pathogen

or

part of their

lifecycle,colonize the tissue

any

of the diseases fungus-grass

symptoms
associations

typical
are

of

plant

infections.Most

endophytic

mutualistic.This suggests that these fungi CO-evolved with their grass


host,are non-parasitic,and the endophyte—plant relationship of perennial ryegrass is

mutualistic symbiosis.The fungus benefits from the association by receiving nutrients, protection,reproduction,and dissemination.In return,the production which deters

plant

may be aided by toxin

ruminant

grazing and pest attack.

The

objective

of this study was to evaluate cloned EF and EI perennial ryegrass

plants for differences in morphological and physiological responses to N fertilizer rates.

All plants were checked periodically for endophyte infection.Hoaglands solution

containing 1

l(10w),73(medium),and 220(high)mg
once a

N L。1 were prepared and 1 L of the week for about 1 50 d.During these

appropriate solution was applied to each pot

I 50 days leaves were clipped twice in order to protect the plants.

We measured the length and width of all of the leaves of selected tillers
three days and found that the

once

every

difference

in

the

leaf

elongation

between

endophyte?infected populmions

and

endophte-free populations got more and more


尘堕墨鲞重茭!堕竺塞堕壁鲨翌墨耋兰董±圭堡塑生墨楚堡塑堂堕竺塑

三全垄

significant while the difference between three nitrogen element levels did not either in E1 populations
or

in EF populations,SO did the leaf blade width

or

the leaf blade

area.

We

also determined the physiological parameters during the whole daytime in

several sunny days and found that net photosynthesis rate,evaporation rate,stomatal conductance and water
use

efficiency

were affected more greatly by endophyte than

nitrogen.El populations had greater physiological parameters

than

EF populations but

high nitrogen level had not.Internal C02 concentration was not between EI and EF populations.

significantly

different

According to the results?we

can

make



conclusion that endophyte infection
a sense

can

enhance growth and development of perennial ryegrass in

by its metabolite.

Key words

perennial ryegrass E1 populaions

endophyte EF populations

nitrogen



不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙





植物内生真菌(Endophyto,Endophytic fungi或Funga]endoph.vte)是指那些

全部或部分生活史聚集在活的植物组织中,并对植物不产生任何典型病原菌病害症 状的一类真菌(wilson,1995)。有关植物内生真菌的研究起始于1898年内生真菌菌
丝体的发现,但是直到人们了解到造成畜牧业重大损失的牲畜中毒是由于食用了感 染内生真菌的牧草后,内生真菌与植物之间的关系的研究才得以广泛深入地开展起 来。到目前为止,内生真菌已经在多种植物类群中发现,其中在禾本科植物中尤为 丰富,现已在80多个属几百种禾本科植物中发现有与之共生的内生真菌。 多年生黑麦草(Lolium
perenne

L.)为禾本科(Graminea由羊茅亚科

(festucoideae)羊茅族黑麦草属(Lolium)植物,原产于欧洲地中海沿岸,北非及亚 洲西南,是欧洲最古老的牧草之一,十三世纪己在意大利北部草地上生长。目前在 欧洲大陆的温带及澳大利亚、新西兰、英国、美国等许多国家广泛作为乳牛、肉牛 和羊的干草和放牧之草,对这些国家畜牧业的发展起了很大的作用。我国自四十年

代从国外引进栽培后,黑麦草在农、牧业生产中均发挥着重要的作用。
本文旨在研究不同氮水平下内生真菌(Neotyphodium lolii)感染对多年生黑麦
草(Lolium
perenne

L.)部分生长及生理特性的影响,以期探讨氮素(非生物因子)

和内生真菌(生物因子)对多年生黑麦草生长的作用,从而为进一步认识内生真菌与 植物的关系,更有效地保护和利用生物资源提供科学依据。

1内生真菌研究历史与涵义、分类及基本特征
1.1内生真菌研究历史 内生真菌的研究至今已有100年了,这一百年里有关内生真菌研究的重要事件 列举如下: 1898年,Vogl在Lolium temu]entum中发现了菌丝体,内生真菌研究从此开 始。 1902年,哈佛大学的Freeman详细地研究了内生真菌在L.temultentum中的 分布,并指出内生真菌也存在于Lolium ita]icum爿.Br.和Lolium perenne L.中的


——
种子星。

!:!型塑壅堡鲞!堕生塞堕堕墨翌墨鲞苎董±竺量塑生望堑堡塑丝堕翌窒三全垄

1906年,Freeman指出内生真菌是不能在其宿主上形成孢子的黑粉菌,其依据
是L.temultentum内生真菌和小麦上的Ustilago tritici僻j Rostr.的生活史具 有相似性。

20世纪30年代初在南非进行了~系列的毒性方面的研究但未能发现内生真菌 和L.temultentum对牛的毒性二者间的关系,于是得出感染内生真菌的草缺乏经济
价值的结论(Kingsbury,1964)。

禾草类与内生真菌的密切关系直到1933和1935年Sampson在威尔士研究

助ichloe
现。
Nei

typhina仇J砌』.的生境和种子传播并比较了黑麦草属的生活史后才发
arundinaeea

l(1940,1941)在新西兰成功地从Festuca

schreb.和

L.perenne中培养出了内生真菌。1948年,类似于麦角中毒的Feseue foot在新西 兰发现。 1950年,美国发现Fescue foot。虽然在随后的研究中从有毒高羊茅中分离出

几种麦角碱类化合物,但种子上未发现有麦角菌核,因而认为麦角菌不是病因。
1963年,Jacobson等人首次对高羊茅毒性引起的临床症状进行描述,包括
Fescue

foot和Fescue toxicosis。

1975年,Bacon等人将Balansia感染草与牛的毒性症状联系起来,证实了 Balansia与麦角菌相关,具有合成生物碱的能力,但属于内生真菌,且其生物碱为
Clavine—type,不如肽型生物碱更具生物活性。 1977年,Bacon及同事在乔治亚州的USDA大学发现了F arundinacea和牛的
“Summer

syndrome”之间的关系。从此,全世界的工作者在研究内生真菌上做出了

许多努力去了解这些真菌的生态学和经济上的价值(Siegel,1987)。 1979年,Porter等人从高羊茅内生真菌的培养基中分离出麦角碱。 1980年,Hoveland等人内生真菌与牛的高羊茅毒症联系起来。
1981年,Hurley等人报道感染内生真菌的草对取食动物血清催乳素的影响。

1982年;Morgan—Jones&Gams将高羊茅内生真菌命名为dcremonium


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coenophialum。

1984年,Latch等人将引起Perennial
AcremonYum lolii。

ryegrass

staggers的内生真菌命名为

1985年,yates等人从Missouri的羊茅中检测到Ergovaline。 1986年,Monroe等人从Georgia羊茅中检测到Ergovaline。 1987年,White报道内生真菌在Poaceae中广泛分布。 1988年,Monroe等人报道了感染内生真菌的高羊茅对马的影响。 1990年,关于Acremonium/grass的第一次国际会议召开。 1992年,Tsai等人进行高羊茅内生真菌的转化。

1993年,美国学者Stierle等首次从短叶紫杉(Taxus brevifolia)的树皮中分 离出一株内生的真菌新种Taxusmyces andreanae,在培养液中能产生紫杉醇和其它 紫杉烷类化合物。
1996年,G1enn将根据体外培养形态的相似性为基础命名的Acremon/um,从分 子系统学角度出发重新命名为Neotyphodium。 1.2内生真菌的涵义、分类及基本特征 内生菌(Endophyte)包括内生真菌和内生细菌,由De Bary(1866)首先提出,是 指生活在植物组织内的微生物,用以区分那些生活在植物表面的表生菌(Epiphyte)。

按此定义植物的致病菌也归属于内生菌的范畴。Carroll(1986)将内生菌定义为生活
在地上部分、活的植物组织内并不引起明显病害症状的真菌,突出强调内生菌与植 物的互惠共生关系,因此,在这个内生真菌概念的范畴内不包括植物致病菌和菌根

菌。Petrini(1991)把Carroll的概念范畴进一步扩展,将内生菌定义为那些在其生
活史中的某一段时期生活在植物组织内,对植物组织没有引起明显病害症状的菌, 这个定义包括那些在其生活史中的某一阶段营表面生的腐生菌,对宿主暂时没有伤 害的潜伏性病原菌(Latent pathogens)和菌根菌。B订is(1996)也认为一些类型的菌 根菌,如内外生菌根菌,杜鹃菌根菌和假菌根菌,应属于内生菌。以上论述可见,

目前关于内生菌的概念范畴还有争议,正如Hawksworth等(1995)所指出:在研究内 生菌前最好先确定内生菌的概念范畴。在现在的内生菌研究中,Petrini提出的概


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念被广泛地接受。
内生真菌(Endophytic fungi)是一类生长在植物体内的真菌。至今在许多高大

多数内生真菌都属于子囊孢子类(Ascomycetes),包括核菌纲(尸rrenomyete曲、盘菌
纲(Oiscomyetes)和腔菌纲(Loculoascomyete由的许多种类以及它们的一些衍生菌。 在多种植物中广泛分布的几个属是:半壳霉属(Leptostroma)、Cryptocline属、拟

隐孢霉属(Cryptosporipsis)、拟茎点霉属(Phomopsis)和叶点霉属(肋rllosticta),
其宿主范围涉及藻类、针叶树、灌木和草本等多个植物类群(Carroll,1988)。目前
研究较集中于内生真菌与禾本科植物的关系上。与禾本科植物关系密切的内生真菌

主要是子囊孢子类核菌纲麦角菌科(Clavicipitaceae)中的一些类群,其中瘤座菌属

(Balansia)、麦角菌属(CJaviceps)和香柱菌属(印ichlo&研究是最多的。而半知菌
类的顶孢霉属(Neotyphodium)(裘维蕃,1998),作为香柱菌属的无性衍生菌(morgan

Jones&Gams,1982),因其与栽培牧草的密切关系而受到广泛关注。
与菌根真菌不同,内生真菌仅存在于植物地上部分的组织内而不是根组织中。 内生真菌分布于植物茎、叶等组织的细胞问,并沿茎叶的长轴生长,菌丝体细长、 弯曲、分枝较少,主要通过两种形式传播:一种是不产生孢子,而是在植物开花期间, 通过菌丝生长进入植物的胚株,经宿主的种子传播,内生真菌通过这种无性方式由植

物的母代传到子代,并不发生植物间的交叉感染:另一种是产生孢子,通过风、降水 等途径传播。我们实验中所设计的内生真菌Neotyphodium属属于前者,当寄主植物 由营养生长期进入生殖生长期时,内生真菌会随着寄主顶端的分生组织渐渐移至花 序,再随着花序的发育进入种子。一旦进入种子后,内生真菌会在糊粉层中增殖, 接着开始蔓延至全部的种子中,直到种子萌芽,内生真菌会重新感染新的幼苗。虽
然内生真菌以异营为主,但它们通常只需从寄主体内吸取少量的养分,且不会在寄 主表面产生任何病症。

2内生真菌与禾本科植物的共生关系
内生真菌与禾本科植物之间的共生关系因其与农牧业的密切关系而受到研究 者们的广泛关注。目前全世界至少已在80个属290多种禾本科植物中发现有内生真


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菌(谭仁祥等,2001)。内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中,并与宿主协同 进化,在演化过程中二者形成了互惠共生关系,一方面内生真菌可从宿主中吸收营

养供自己生长需要,另~方面内生真菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要
的作用。内生真菌和禾本科植物间的共生关系可以用下图来表示:
宿主植物
PLANT

内生真菌
日ⅧX)Pl扪仃E

内生真菌和植物之间的关系(仿Siegel,1993)
Interactions between endophytes and

plants(after Siegel,1993)

2.1内生真菌对禾本科植物生长发育的促进作用
内生真菌对宿主植物的促进作用表现在种子形成和发芽、幼苗存活、分蘖生长、

母系植物开花、生物量等多个方面。Clay(1987)发现,内生真菌感染的高羊茅饱满
种子是未感染高羊茅的两倍多,所占比率分别为44%和19%:在发芽率上,内生真菌 感染的黑麦草和高羊茅种子均比未感染的高出10%左右。在澳大利亚,16Kg/hm2的 播种密度时黑麦草的幼苗萌发率,内生真菌感染的要比未感染的多

25%(Quigley。2000)。Clay(1993)对美国路易斯安那州中部的高羊茅草场进行了三年


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的观察,结果表明感染植株的存活率比未感染植株高50%,且产生的分蘖、花序和 生物量分别比未感染植株高50%、40%和70%。感染植株的平均适应性是未感染植株
的两倍。一项温室实验也表明,在生长6-10周后,感染的黑麦草植株的生物量和分

蘖数明显比未感染植株多;高羊茅在生长10—14周后,也表现出同样的结果(Clay,
1987)。Latch等人(1985)对黑麦草的研究表明,与未感染植株相比,感染植株的总 面积、分蘖数、叶片生长速率和生物量都有明显的增加。De Battista等人(1990) 的研究表明,内生真菌感染的高羊茅植株经12周生长后,分蘖数、茎叶部生物量和根 重分别比对照高12%、18%和25%。内生真菌对植物的繁殖能力也有影响。Rice等人 (1990)在对高羊茅的两组实验中发现,与未感染植株相比,感染植株在每株圆锥花序 数量上分别高出20%和34%;在每穗种子数上分别高出32%和4%;在单株种子数上分 别高出60%和33%;在种子总重量上分别高出79%和32%。

当然也有报道认为,内生真菌感染后的禾本科植物并未表现出生长发育上的优 势。Clay(1987)发现,内生真菌感染及未感染的黑麦草饱满种子的比例相近:高羊
茅和黑麦草两个种种子的重量,内生真菌感染的和未感染的一样。Neil(1941,1952)

发现在感染的和未感染的黑麦草间的牧草饲料产量没有差异。Siegel

et

al(1984)

也发现在感染的和未感染的高羊茅间饲料产量无差别。尽管如此,学者们还是普遍 认为,内生真菌侵染可以促进禾本科植物的生长发育。 内生真菌促进植株生长的一个可能的基础是增加了对食草动物的抗性。几个研 究阐明,内生真菌感染的禾草会被食草昆虫识别,如果这些禾草被取食的话,那么
昆虫存活和生长就会比那些取食未感染禾草的昆虫少(Funk
1985;Johnson
et et

al,1983:Clay et al,

al,1985)。有关这方面的研究,Latch

et

al(1985)的结果认为

内生真菌促进植物生长不能归因于食草动物的差异,因为对于生长于无食草动物环 境中的植物来说,内生真菌也能提高它们的生长。Porter
et

al(1985)指出Balansia

epichloe在Vitro中可以产生生长素。De Battista等(1990)从体外培养的高羊茅

内生真菌A.coenophialum中也分离出了生长素。Latch等(1985)认为黑麦草感染植
株生物量的增加可能与赤霉素的作用有关。蓑衣草Cyperus virens如果经常被

B.Cyperi感染时会产生Plantlet,这一现象与激素不平衡相关(Clay,1986)。至于内
t0

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生真菌是否通过激素调节来促进禾草类植物的生长,目前还未弄清。

2.2内生真菌对禾本科植物抗逆性的增强作用 内生真菌对植物抗逆性的增益作用既表现在非生物胁迫(如抗高温、抗干旱等)
方面也表现在生物胁迫(如阻抑昆虫和食草动物的采食、抵抗病虫害等)方面。 对于植物内生真菌共生体的抗旱性研究已开展较多,较普遍的看法是:内生真

菌的侵染有助于提高植物对干旱胁迫的抵抗能力(Arachevaleta等,1989;
Clay,1990;Bacon,1993;Siege],1993)。Arachevaleta等(1989)在一项温室内进

行的水分胁追实验中发现,含内生真菌的高羊茅植株的生产力在轻度胁迫 (一0.05MPa)下高于未感染植株;而在重度胁迫(一0.5MPa)条件下,当75%的未感染植 株死亡时,所有的感染植株都存活下来,并且叶卷曲(一种抗旱性状)在感染植株中要 普遍得多;感染植株在刈割后恢复生物量也比未感染植株快得多。White等(1992) 的高羊茅内生真菌共生体抗旱性实验表明,与未感染植株相比,感染植株叶片更厚更 窄、叶卷曲现象更普遍、根系生物量更大且分布更深。Bacon(1993)也认为,高羊茅
感染植株老叶的早落和幼叶的卷曲是重要的抗旱特性。West等(1993)认为,高羊茅

植株存活能力的提高和分蘖密度的增加是与该植物同内生真菌的共生关系紧密联系 的,这使得植物在干旱胁迫下的种群密度稳定性得以提高。本实验室也研究了内生
真菌对黑麦草抗旱性的增益效应,结果发现内生真菌可以通过促进根系生长、促进

分蘖、控制胁迫条件下叶片卷曲的时间以及在严重的胁迫下维持较高的光合能力来 提高黑麦草的抗旱性,并使内生真菌感染种群取得对未感染种群的竞争优势(梁宇
等,1999)。

根据推测,内生真菌能增强耐旱性是由于:(】)促进根的发育(Belesky

et

a,.,1989):(2)增加叶的生长:叶片增厚、叶片卷曲、再生能力增强(Arechevaleta
et

a1.,1989):(3)调节气孑L的开合(Elmi

Pt

a1.,1995):(4)渗透调节:a.共生植

株在叶鞘细胞中,葡萄糖及果糖浓度增加,未共生植株在叶鞘细胞中的糖类浓度不
变(Elmi
et

a1.,1995);b.共生植株叶片中的细胞壁弹性较大(White

et

a』.,1992)。

内生真菌也能增强禾草植物的耐高温性。Read和Camp通过3年的放牧实验观 察到受内生真菌感染的高羊茅的产草量比未受感染的高,尤其是在夏季干旱高温时 期,未受感染的高羊茅产量减少54%,而受感染的仅减少4%。Mark和clay(1966)对高 羊茅的光合特性进行了研究,发现当叶温超过35℃时,感染植株的C02交换速率比

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未感染植株高20—25%,这说明在高温条件下,感染植株光合作用固定碳的能力较强。 感染植物的内生真菌能产生多种生物碱和真菌毒素如黑麦草碱、麦角碱、波胺
和覃青毒素等,这些次生代谢物因对食孽动物和昆虫等具有毒性或能降低宿主植物 的适口性,从而能提高植物对多种食草昆虫的抗性。在新西兰,感染内生真菌的多年 生黑麦草对阿根廷茎象鼻虫(Argentine
a1.,1982)。
stem

weevil)有优越的抗性(Prestidge

et

虽然内生真菌可抑制很多虫害,但一些昆虫仍然持续生存。这原因有两点:一 是部分昆虫体内有抗真菌毒素的物质;二是和昆虫的进食行为有关,也就是说抗虫

的效果会随不同的进食方式而改变。内生真菌在组织中的分布不同,就可能对昆虫
有不同程度的抗性。若真菌毒素只在内生真菌体内出现,而不释放到寄主体内,那 么昆虫需要直接取食植物体内含有菌丝的部分,才可达到抗虫的效果。对于一些咀 嚼式口器的昆虫,如夜盗蛾的幼虫,抗虫性就很高(Johnson—Cicalese
and

White,1990;Breen,1993)。然而对一些刺吸式口器的昆虫,如蚜虫(¥chizaphis
spp.),则需要在植物体液内出现真菌毒素时,才可达到抗虫效果。为了抗此类昆虫,

内生真菌需分泌真菌毒素到植物体内的非原质体(Apoplast)中,这些毒素再随着维 管束组织(如韧皮组织)运输。当蚜虫以口器刺入植物体内的韧皮组织时,便吸食到
毒素而导致死亡。

早期的文章曾指出在体外(如vifro)的内生真菌可拮抗真菌性病原菌(White
and Cole,1985;Siegel et

a』.,1991),此观点被认为在一些共生性内生真菌也具

有抗病性。不过在一些植物抗病害的研究发现,这观点并非完全正确。高狐草对茎
锈病(Stem rust,Puccinia graninis subsp.graminicola)或叶斑病(Leaf
Rhizoctonia
spot,

zeaeVoorhees)的病害反应,并不受内生真菌之共生所影响(Chu—Chou

e£a1.,1992)。而在共生的高狐草幼苗,可增加褐斑病(Brown patch,兄solaniKuhn) 的抗性,但对夏斑病(Summer
patch,Magnaporthe

poa0并无影响(Gwinn

and

Bernard,1988)。最近的证据指出,在一些品种含有内生真菌的Fine fescue对
Dol lar

spot(Sclerotinia homeocarpa)有很好的抗性(B.B.Clarke,Rutgers

Univ.,1996,unpublished data)。

线虫也会危害植物,因所造成的征状和营养缺乏或其它逆境相似,所以线虫也 不易被诊断出来。对受不同种类的内生真菌感染的植物来说,抗线虫的效果是不一
致的(Cook
et

a1.,1991),例如以Tylenchorhenchus sp.,Paratrichodorus

sp.,

不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

Helicotylenchus

sp.,和Meloidogyne Sp.和高狐草共生,则可借着降低线虫发生
et

的机率、减少根被吃食、及减少卵的产生,来达到抗线虫的效果(Gwinn
Pedersen
et a1.,1988;West
et

a1.。1993;

a1.,1988;Kimmous et

a1.,1990)。利用内生真

菌抗线虫,可产生健康的根系,间接增强耐旱性。另外有一些小动物,包括鸟类和 哺乳类动物会以植物的叶片或种子当作食物,因此和内生真菌共生的植物,可防止

这些小动物的吃食。例如:啃食共生性高狐草的老鼠,会降低生殖能力,进而减少 族群数(Zavos
et

a1.,1986,1988;Sadler,1980)。另一个例子是当吃种子的鸟类吃
and Clay,1991;Conover and

食共生草种的种子时,会降低食欲,或体重减轻(Madej
Messmer,1996;Zavos
Pt

a1..1993)。

3不同营养条件下内生真菌对禾本科植物生长发育的影响
内生真菌长期生活在植物体内,并从宿主中吸收营养供自己生长所用,另外宿

主也必须从外界吸收~定的营养来满足自身的需要。内生真菌与其宿主植物并不总 是共生关系,它们会受到一些生物因子和非生物因子的影响(Marks&Clay,1990;
Marks
et

a1.1991;LewiS,1992)。Cheplick(1997)也指出内生真菌对黑麦草生

长的促进作用与宿主的基因型和营养环境有关。因此,研究不同营养条件下内生真 菌对植物体的影响就很必要了。 3.1不同氮素水平下内生真菌对禾本科植物生长发育的影响 国外部分学者做了一些有关氮素营养条件下内生真菌对禾本科植物生长发育 的影响的工作,主要包括生物量、分蘖数、叶片形态以及氮代谢相关的酶等指标。

在生物量方面,以单株高羊茅为研究对象发现EF植株的干重和EI植株的干重 在低氮水平下无显著差异,但在较高的氮水平下EI植株的干重比EF植株高出50%,
在更高的氮水平下EI植株能比EF植株高出67%。Belesky
et

a1.(1987)也发现在

较高氮水平EI植株的鲜重要比EF植株高。Richardson(1999)在温室条件下以一种
草坪草Chewings fescue为研究对象发现,内生真菌感染植株生物量增加了54%,

氮素吸收提高了58%。Belesky(1989)也发现大多数的高羊茅无性系在适度施氮和 浇水时内生真菌感染使植物的生物量平均增加了15%。但Lewis(1996)和Ravel
(1997)以多年生黑麦草为材料发现了内生真菌和氮肥水平对植物的生物量和氮肥吸

收并没有影响。
13

不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

在分蘖数方面,Ravel

et

a1.(1997)认为氮肥不足时EI植株的叶片数和分蘖

数比EF植株多。Latch等(1985)也报道过黑麦草在相对较高的氮水平下EI植株产 生的分蘖数比EF植株的多,在较低的氮水平下EI植株的分蘖数小于EF植株。 Latch(1985)还发现实验初期EF植株分蘖数稍大于EI植株。他对此的解释是这种现
象的出现可能是由于在挑选试验对象进行处理时EI与EF植株之间的差异性造成的。 Arechavaleta(1989)发现在低氮和中氮水平下EI与EF植株之间没有差别,但在高 氮水平下EI植株分蘖数要比EF植株多36%。Belesky 水平下EI植株分蘖数要比EF植株多30%。 在叶片形态方面,Arechavaleta(1989)发现低氮水平时内生真菌感染的高羊茅 叶片要比未感染的厚18%(60天后)和25%(160天后);在最高的氮水平下,叶片厚度
LBT(Leaf blade thickness)不受内生真菌的影响。Arechavaleta(1989)还发现60
et

a1.(1987)也发现在高氮

天后不管是在何种氮水平下EI植株的叶片宽度LBW(Leaf

blade

width)要比EF植

株低20%;160天后,低氮水平下EI植株的叶片宽度和EF植株接近,但是在高氮水 平时,EF植株叶片要宽一些。Arechavaleta认为内生真菌感染的植物叶片要比未感 染的更厚、更窄一些,这与氮水平关系不大。感染植株的叶片这种形态学的变化的 一个好处是能够更好地适应干旱的环境。
在氮代谢方面,Lyons
et

a1.(1990)在温室条件下研究发现,内生真菌感染影

响高羊茅KY31叶片和叶鞘内有机和无机氮的累积。在高氮水平下EI植株叶片和叶 鞘内可溶性总氨基酸含量均比有所提高,叶鞘中铵离子增加,很多氨基酸也明显增
加,而叶片中只有天冬酰胺增加。Lyons
et

a』.(1990)还发现EI植株叶片内谷氨酰

胺合成酶(GS)的活性在高氮水平和低氮水平时均比EF植株高,但是不论叶片还是叶 鞘中EI和EF植株的硝酸还原酶(NR)的活性没有差异。
3.2其它营养条件下内生真菌对禾本科植物生长发育的影响 其它营养条件下内生真菌对禾本科植物也会产生一定的影响。从国外的文献来 看,关于磷元素这方面的论述较多。
Malinowski
et

a』.(1998)研究了4个品种的高羊茅(DN2、DN4、DN7和DNll)

在三种磷浓度(17,50和96mgPk91)下内生真菌的作用。他们发现在低磷条件下EI
1l

4i同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王会龙

植株的累积生物量比EF植株高8%,但在高磷条件下EI植株的累积生物量比EF植

株低12%。他们还发现,EI植株根部和地上部的磷、镁和钙的含量在低磷条件下显
著高于EF植株;EI植株根部锌、铁和铝的含量明显高于EF,地上部锰和铝的含量 低于EF。这说明,内生真菌感染影响了植物对磷以及其它养分元素的吸收,有利于 高羊茅在磷不足的土壤中生长。

对于这方面的机制,Azevedo(1992)认为内生真菌的菌丝可以作为磷库来积
累无机磷,在磷不足时可向植物供磷来满足其生长需要。Malinowski认为内生真菌

能够诱导植物通过两种途径来对磷胁迫作出反应:一方面是根的形态发生了变化,
根变得细长,表面积增大,从而增加了对磷的吸收能力;另一方面是根部分泌活性的

改变即植物的根部分泌更多的酚类化合物来螯合磷,以提高对磷的吸收。
Malinowski
et

a』.(2000)又对高羊茅DN2和DN4两个品种在低磷(3.1ppm)和

高磷(31ppm)培养条件下,内生真菌对其生长和养分吸收情况的作用进行了研究。研

究发现,低磷条件下两个品种地上部和总生物量不受内生真菌感染的影响,但EI
植株的相对生长速率要比EF的大;高磷条件下,DN2品种的EI植株地上部生物量

比EF的少13%,而DN4品种的EI植株地上部生物量比EF的多29%。
由上可见,内生真菌在不同的磷水平和不同的植物基因型时,其作用是不一样
的。

4实验设计
从国内外的文献报道来看,有关不同氮水平下内生真菌对禾本科植物生长发育
的影响这方面的工作主要集中在一些生长指标,例如生物量、分蘖数等,而生理指

标较少提及;另外所选的植物材料大多是高羊茅,涉及黑麦草的不是太多。鉴于这 种情况,我们以多年生黑麦草SR4000为实验材料,通过叶片的形态学测量以及使用 C1301光合仪进行光合、蒸腾等生理指标测定,来研究内生真菌(Neotyphodiuml0111) 在不同氮水平对SR4000若干生长和生理特性的影响,以期发现氮素和内生真菌两个
因素对多年生黑麦草营养生长的作用,从而为更好地在我国发展黑麦草以及进一步 认识内生真菌和植物的关系提供依据。
15

不|司氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

材料与方法
1实验材料
本实验所用的植物材料是多年生黑麦草(Lolium
Neotyphodium
perenne

L.),内生真菌是

lolli。黑麦草种子来源于南开大学植物生理生念实验室田间样地

(2000年9月收获),是1999年种植的黑麦草SR4000品种(红旗农场提供,自澳大 利亚购进)所结实。

2实验前准备
2.1

EI和EF实验种群的建植
选取均匀、饱满的EI、EF种子,浸泡在蒸馏水中5-6个小时后摆放于培养皿

的湿滤纸上。每个培养皿约摆放200粒种子,EI、EF重复数都为3,共需6个大培 养皿。在26℃的恒温培养箱中盖上盖培养,期间及时补水,7天后萌发。

将萌发后的幼苗移栽到温室的瓦盆中,接着又移入直径为24厘米的塑料花盆 中,基质均为蛭石。这个期间每周旌Hoagland营养液一次,每2—3天浇一次水,以 保证幼苗充足的养分和水分供应。温室内最高和最低温度分别为15。C和35。C。移栽 一周后逐株进行内生真菌感染率的检测。选取内生真菌自然侵染或不侵染的无性系
植株准备实验。4周后移入田问。 2.2土壤指标的测定

本实验所用的土壤是来自天津市红桥区某农场的沙质壤土,实验前测定其各项 理化指标,包括土壤水分常数测定、土壤有机质测定和土壤中氮、磷、钾的测定。 2.2.1土壤水分常数测定
a)土壤水分含量(Soi
1 water content,SWC)

采用称重法测定。实验开始前和实验结束后,取20cm土层的土壤,放入铝盒,
称其湿重(wet weight,WW),然后于105‘C烘干48h,称其干重(Dw),计算土壤水分 含量:
SWC(%):[(ww—DW)/DW]X100%

b)土壤田间持水量的测定(环刀法)
t6



不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦革若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

于欲测土壤按层次用容重环取土样,另取土样测土壤含水量。将容重环带至室 内,称重(精度至0.1克)后,放在垫有滤纸的培养皿上,再将培养皿与容重环一同
放在瓷盘中,瓷盘中注水,水位略低于培养皿,皿上所垫滤纸应浸入水中。由于毛

细管力的作用,经一定时间后(砂土l天,粘土3天),容重环中土样充满了毛管支
持水。随后,去掉瓷盘中水分,盖上容中环盖,防止蒸发,经2—3天排除重力水后, 测其含水量,即得田间持水量。经测定,本实验中所用土壤的田间持水量为25.4%。 2.2.2土壤pH值测定 采用电位法。称已过lmm筛的风干土样lOg,放在50m1高型烧杯中,加入 25m10.Olmol/L得CaCl2溶液,剧烈搅动lmin一2mifl,使土体充分散开。放置30min, 此时应避免空气中得NH3或挥发性酸等得影响,然后用pH计测定。测定结果如下 PH值 实验前 实验后
EIO 7.6 7.6
E11

E12 7.6 7.5

EFO 7.6 7.5

EFl

EF2

7.6 7.6

7.6 7.5

7.6 7.3

注:0代表低氮水平,l代表中氮水平,2代表高氮水平。
2.2.3土壤有机质测定 a)试剂配制

①O.4N重铬酸钾硫酸溶液

称取研细的化学纯K。Cr:0,209,溶解于500ml蒸馏

水中,冷却后缓缓加入比重为1.84的化学纯浓硫酸500毫升,并不断搅动,冷却后
备用。

②O.1N重铬酸钾标准溶液

准确称取分析纯K2Cr:0,(在130℃烘3h)4.909溶

于200ml蒸馏水中,然后慢慢加入浓硫酸约70ml,小心移至lL容量瓶中,加水至 刻度,即为标准为0.1000N K2Cr:0,溶液。

③O.2N硫酸亚铁溶液

称取分析纯FeSO。.7H:0 569,溶解于蒸馏水中,加6N硫

酸60m1,然后加水稀释至1L,此溶液的浓度,可以用0.1000N K2Cr:0,溶液标定之。 即准确分别吸取三份0.1000NK2Cr。0,溶液各20ml于三个150ml三角瓶中,加入邻啡
哕啉指示剂2-3滴,然后用0.2N硫酸亚铁滴定至砖红色终点,并计算出硫酸亚铁的 准确浓度。
17

不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

乇金龙

④邻啡哕啉指示剂

称取分析纯邻啡哕啉1.4859,FeSO..7H:0 0.6959,溶于

lOOml蒸馏水中,贮于棕色滴瓶中。

⑤石蜡(固体)或植物油。 ⑥浓H2SO。(比重为I.84、化学纯)。
b)测定步骤

用减重法称取0.25mm土样0.卜0.59放入一干燥硬质试管中,用吸管或滴定管 加入0.4N重铬酸钾10ml,在试管口加一小漏斗。将试管10-20个盛于铁丝笼中(每

批样品测定加3个空白实验),放入温度为185—190。C的液体石蜡油或植物油浴锅中,
要求放入后油锅温度下降至170-180。C,等试管内液体沸腾发生气泡时开始计时,煮

沸5min,取出试管,稍冷,擦净试管外部油液。 冷却后,将试管内容物倒入250mi三角瓶中,用蒸馏水洗净试管内部及小漏斗,
将洗液一并倒入三角瓶中,瓶内总体积应在60一70ml。保持溶液中硫酸浓度应为 2—3N,然后加2—3滴邻啡哕啉指示剂,用标准硫酸亚铁滴定至出现砖红色即为终点。

每批样品测定的同时,进行2—3个空白实验,即用石英砂或灼烧过的土壤代替土样,
其他手续均同上。
c)结果计算

土壤有机碳%=(Vo-V)N×0.003×1.1×i00/烘干土重
式中:

V。,一一为滴定空白实验时所用去的硫酸甄铁毫升数: V一一为滴定土样时所用去的硫酸弧铁毫升数; N——为硫酸亚铁当量浓度; 0.003——为1个毫克当量碳的克数; i.1一一为氧化校正系数: 1.724——为有机碳换算成有机质的平均换算系数。

测定结果如下
有机质(%)
实验前 实验后
E10 1.05 6.36 EIl 1.05 5.45 E12 1.05 6.78 EFO
1.05 EFl

EF2
1.05

1.05 7.00

6.33

5.95

18

水同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

2.2.4土壤中全氮量的测定
a)试剂配制

①混合催化剂lOOg硫酸钾和lOg CuSO。.5H。0混合磨碎,过80号筛,消煮
时每毫升硫酸加催化剂0.379。


②40%氢氧化钠
500ml。

2009工业用固体氢氧化钠,加水溶解不断搅动,稀释至

③2%硼酸溶液指示剂

59硼酸用60。C蒸馏水溶解,冷却后稀释至250mi,用

稀盐酸或稀氢氧化钠调节pH值至4.5,加入定氮混合指示剂2.5ml。

④定氮混合指示剂

分别称取0.Olg甲基红和0.059溴甲酚绿,放入玛瑙

研钵中,并用95%酒精研磨溶解。此液应用稀盐酸或稀氢氧化钠调节pH值至4.5, 此指示剂变色范围为pl-]4.2(红色)一4.9(兰绿色)。

⑤饱和重铬酸钾溶液

509化学纯重铬酸钾溶于250ml热蒸馏水中。

⑥0.OIM盐酸溶液8.5ml浓盐酸加水稀释至1升,用120℃烘干的碳酸钠标
定其准确浓度。然后准确吸取1份用水稀释10倍,计算其准确浓度。

⑦酚酞指示剂0.Olg酚酞溶于25m170%Z,醇中。
b)实验步骤

准确称取通过100孔筛的风干土样0.59一小心放入干燥的50m]开氏瓶中一加 几滴蒸馏水湿润之一加入1.859混合催化剂一加入浓硫酸5ml一轻轻摇匀,以小漏
斗盖住开氏瓶口一将开氏瓶斜置800W电炉上加热至溶液微沸一继续加热直至溶液 呈清澈的淡蓝色,然后继续消煮半小时(全程约2个小时),消煮时硫酸在瓶内回流

程度以高达瓶颈1/3为好,否则表示温度过高或过低一消煮结束后,取下凯氏瓶稍
冷,多次冲洗凯氏瓶,lOOml容量瓶定容。

吸取5ml消煮液进行蒸馏一另备lOOml三角瓶,内加2%硼酸指示剂5ml,将三 角瓶置于冷凝器的承接管下,管口插入至距硼酸液面2—3cm一向蒸馏室内加入
10m140%氢氧化钠,立即关闭蒸馏室一打开螺丝夹,进行蒸汽蒸馏,待硼酸指示剂变 色开始定时5分钟停止蒸馏一用少量水冲洗冷凝管,取下三角瓶一用0.01M盐酸标

液滴定馏出液中的氨一终点由绿色突变为紫红色。
19

小同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若十生长和生理特征的影响研究

王金龙

C)结果计算 土壤全氮量%=(V-V。)×C×0.014×100/样品重

式中,V一一滴定时消耗标准盐酸的毫升数: V。一一滴定空白时消耗标准盐酸的毫升数; C一一标准盐酸的浓度; 0.014一一lmm01N的质量为0.0149。
测定结果如下 全氮(%)
EIO
EIl

E12

EF0

EFl

EF2

实验前
实验后

0,027 0.075

0.027 0.084

0.027
0.071

0.027
O.07l

0.027 0.074

0.027 0.115

2.2.5土壤中速效磷的测定 a)试剂配制

①1.5%钼酸铵一3.5N盐酸溶液

1.59钼酸铵(含四个结晶水)溶于300ml温水

中。冷却后加入30ml浓盐酸,定容100m],贮于棕色瓶中。

②2.5%氯化亚锡一甘油溶液

称取SnCl:.2H:0 2.59,加入浓HClloml,加热溶

解,加甘油90ml,混匀,贮于棕色瓶中。

③标准磷溶液

准确称取105。C烘箱烘干的分析纯KH:PO。0.229溶解于400ml

水中,加入5ml浓硫酸,定容100ml,即为50ppm磷标准溶液。准确吸取50ppm磷
标准溶液0.4,1,2,4,8ml,稀释定容至100ml,即为0.2,0.5,1.0,2.0,4.0ppm含磷液。

按测定土壤浸出液的方法同样显色。
b)实验步骤 称取29田间自然土壤于试管中一补加蒸馏水至其总含水量10ml一加入1.5%钼

酸铵一3.5N盐酸6滴一塞紧试管猛烈震荡3分钟一待放置澄清后,吸取4ml于比色
杯中,准确加入1.5%钼酸铵一3.5N盐酸lml,摇匀,加入2.5%SnCl:甘油溶液l滴, 摇匀比色(700nm)。 测定结果如下:

不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

土金龙

2.2.6土壤中速效钾的测定 a)试剂配制


①lN硫酸钠浸提剂 ②3%四苯硼钠溶液

70.1409无水硫酸钠溶水稀释至1000ml。 39四苯硼钠溶于lOOml水中,加入20滴0.2N NaOH使呈

微碱性,放置过夜用紧密滤纸过滤,贮于棕色瓶,存放于暗处低温保存。

③甲醛一EDTA掩蔽剂称取2.59EDTA二钠盐,19氢氧化钠(分析纯)溶于20ml
水中,加入80m]37%甲醛。

④称取0.190689分析纯KCI(1IO。C烘干2小时)于水中,定容lOOml。此为
1000ppm标准钾溶液。用1N硫酸钠稀释成lOOppm。然后吸取lOOppm钾标准溶液0、 1、3、5、lO、15、20、30m1分别用lN硫酸钠定容lOOml,此为0、1、3、5、10、

15、20、30ppm钾标准系列溶液。
b)实验步骤

称取通过1mm筛孔的风干土5.oog一加入JN硫酸钠25rnl,加塞振荡20min后
过滤一吸取滤液8ml放入25m1三角瓶中,准确加入lml甲醛掩蔽剂,摇匀一用带针 头的注射器吸取3%四苯硼钠lml快速有力注入,立即摇匀一lOmin后420nm比色。 测定结果如下:

速效钾(ppm)I 实验前 I 实验后 I
2.3移苗定株

EIO 9.17 51.285

E11

E12
9.17

EFO 9.17 45.886

EFl 9.17 40.890

EF2 9.17 38.449

9.17 43.673

44.129

本实验采用两因素随机化完全区组实验设计,因素之一为内生真菌感染情况,

分为感染(EI)和不感染(EF)两个水平,因素之二为施氮水平,分为低氮(LN)、中氮 (MN)、高氮(HN)三个水平。实验是以桶栽方式在大田状态下进行。栽植桶是用马口 铁即镀锌铁皮做成,桶内径25厘米,深60厘米,共30只,每桶都深埋入地下,仅 留5厘米高于地面,桶底垫有小石块以保持所有桶口在同一水平面上。30桶分5区

不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生眭和生理特征的影响研究

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组,每组6桶,并且EI和EF相间排列。桶内填充土肥质量比为14:1的复合土壤
来保证植物根部充分生长。其中所用的多元素螯合肥来自天津绿洲全肥公司,其N、 P、K的总含量超过30%,包含腐殖质和有机酸等在内的微量元素和有机质的含量超 过20%。然后,充分浇水使之达到田间持水量。 选取30株具3个分蘖和质量相近的幼苗植株分别移栽到上述铁桶中,再次用

苯胺蓝法逐株进行植株的内生真菌的侵染情况。然后,剔除感染情况和生长状况异
常的植株,最后每盆定株为20。随后每盆分别选取有代表性的2株分蘖,用彩色塑 料环进行标记。 2.4施氮处理 用CaCl:和KCl分别替代Hoagland营养液中的Ca(N0。):和KNO。,然后分别加 入0.5M硝酸铵7.86ml、52.14ml、157.15ml于10升1/3Hoagland营养液中,进行

低、中、高浓度氮肥处理(相当于1lmg氮/升、73mg氮/升、220mg氮/升),每个栽
植桶中加入1升营养液。每周施一次肥,根据情况浇等量的水,以保证实验期间苗 充足供水。

3三个处理期实验
本实验是从2001年5月28日开始,到10月31日结束,共持续约150天。为 了保证黑麦草的正常生长,这个期间共刈割两次,一次是在7月8日,另一次是在

8月27日。因此,实验过程可以分为三个处理期。
3.1第一处理期实验(2001年5月28日至2001年7月8日) 3.1.1生长指标的测定

每隔三天测量一次标记分蘖的叶长和叶宽,以最先长出来的那一片叶作为该分 蘖的第一片叶,新生的那一片叶作为最后一片叶,依次累加,每次测量完便可得到
截至浚天的叶长累积值和叶面积累积值,依此计算出叶片增长速率。叶片的叶面积

可由下公式得出:叶面积=0.905×叶长×叶宽,其中0.905为黑麦草叶片形状因子
(Kemp,1960)。每隔10天数一次所有翁的总分蘖数。

3.1.2生理指标测定
22

不同氮索营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

用cI一301光合系统(美国CID公司生产)测定单叶净光合速率、蒸腾速率、气
孔导度和细胞间隙C02浓度等生理指标。2001年6月26同进行上述各项指标的日 进程测定。从早至晚,每两小时测定一次。在测定上述指标的同时,自动记录有效 光合辐射(PAR)、空气温度、叶片温度、空气湿度、空气C02浓度的变化。
3.1.3环境因子测定

大气温度:用周记型双金属温度计记录 相对湿度(RH%):用周记型毛发湿度计记录。 3.1.4收获时生物量测定 第一处理期结束后,收获各盆的地上部分(留茬高度为5厘米),分成叶片和叶 鞘两部分,计数每盆总分蘖数和绿叶数并称其鲜重(Fresh weight,FW)。然后于105 ℃烘箱烘30分钟,再于70。C烘24小时,称其干重(Dry weight,DW)。 3.2第二处理期实验(2001年7月29日至2001年8月27日) 3.2.1生长指标的测定

每隔三天测量一次标记分蘖的叶长和叶宽,以最先长出来的那一片叶作为该分 蘖的第一片叶,新生的那一片叶作为最后一片叶,依次累加,每次测量完便可得到
截至该天的叶长累积值和叶面积累积值,依此计算出叶片增长速率。叶片的叶面积

可由下公式得出:叶面积=0.905X叶长X叶宽,其中0.905为黑麦草叶片形状因子
(Kemp。1960)。每隔10天数一次所有盆的总分蘖数。 3.2.2生理指标测定

用CI一301光合系统(美国CID公司生产)测定单叶净光合速率、蒸腾速率、气 孔导度和细胞间隙C02浓度等生理指标。2001年8月15日、8月21日、8月24 日进行上述各项指标的日进程测定。从早至晚,每两小时测定一次。在测定上述指
标的同时,自动记录有效光合辐射(PAR)、空气温度、叶片温度、空气湿度、空气

C02浓度的变化。
3.2.3环境因子测定

大气温度:用周记型双金属温度计记录: 相对湿度(RH%):用周记型毛发湿度计记录。
23

不同氯素营养下内生真菌感染对黑麦草若十生长和生理特征的影响研究

王金龙

3.2.4收获时生物量测定
第二处理期结束后,收获各瓮的地上部分(留茬高度为5厘米),分成叶片和叶 鞘两部分,计数每盆总分蘖数和绿叶数并称其鲜重(Fresh weight,FW)。然后于105 ℃烘箱烘30分钟,再于70。C烘箱烘24小时,称其干重(Dry weight,DW)。 3.3第三处理期实验(2001年9月19日至2001年10月31日) 3.3.1生长指标的测定 每隔三天测量一次标记分蘖的叶长和叶宽,以最先长出来的那一片叶作为该分 蘖的第一片叶,新生的那一片叶作为最后一片叶,依次累加,每次测量完便可得到 截至该天的叶长累积值和叶面积累积值,依此计算出叶片增长速率。叶片的叶面积 可由下公式得出:叶面积=O.905×叶长×叶宽,其中0.905为黑麦草叶片形状因子 (Kemp,1960)。每隔10天数一次所有盆的总分蘖数。 3.3.2生理指标测定 用C1-301光合系统(美国CID公司生产)测定单叶净光合速率、蒸腾速率、气

孔导度和细胞间隙C02浓度等生理指标。2001年9月27日和10月8日进行上述各
项指标的日进程测定。从早至晚,每两小时测定一次。在测定上述指标的同时,自

动记录有效光合辐射(PAR)、空气温度、叶片温度、空气湿度、空气C02浓度的变
化。 3.3.3环境因子测定

大气温度:用周记型双金属温度计记录 相对湿度(RH%):用周记型毛发湿度计记录。 3.3.4收获时各项指标测定

第三处理期结束后,收获各盆的地上部分(包括叶片和叶鞘),计数每盆总分蘖
数和绿叶数并称其鲜重(Fresh weight,FW),然后于105℃烘箱烘30分钟,再于 70。C烘24小时,称其干重(Dry weight,DW)。同时收获地下部分,将根洗净晾干后, 用美国CID公司的根长扫描仪测量根长,其结果用相对根长表示,相对根长=根长/ 根干重。另外,在收获后的栽植桶土壤20一30厘米处取土样,测定每盆土样的有机 质和氮、磷、钾含量以及土壤的pH值。
24

不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

4内生真菌的检测
黑麦草种子在5%NaOH中浸泡过夜,然后在苯胺蓝染液中煮3-5min,去除稃片, 置于滴有苯胺蓝染液的载玻片上,在酒精灯上加热几秒钟(如温度较高可不用加热), 染色约10—20min后,盖上盖玻片,压片并用吸水纸吸去多余的染液,在光学显微镜 下观察。幼苗移栽4-5周后,取其叶片进行内生真菌的检测,采用乳酸一酚苯胺蓝染 色法(Bacon
et

a1.,1977),然后在光学显微镜下检测。 苯酚lOg、乳酸lOg、甘油209、蒸馏水lOml、苯胺蓝0.0259。

a)苯胺蓝染液的配制

将水与苯酚混合直到溶解,然后加乳酸和甘油,最后加入苯胺蓝。 b)检测步骤 剪取成熟的叶片(带叶鞘), 用解剖刀切断叶鞘部分上表皮层并用

镊子撕下一块上表皮,置于滴有苯胺蓝染液的载玻片上,在酒精灯上加热几秒钟(如 温度较高可不用加热),染色约10—20min后,盖上盖玻片,压片并用吸水纸吸去多 余的染液,于光学显微镜下观察。 以下为观察结果: 种子内菌丝体主要位于糊粉层中。糊粉层是胚乳最外层的~层细胞,约占种子 总重量的6%左右,细胞较大,排列整齐,有一半的成分是纤维素,25%为含氮物 质。与叶鞘中的菌丝相比,种子中的菌丝较粗且弯曲,菌丝密度高。 幼苗移栽4—5周后,取其叶片(带叶鞘)进行内生真菌的检测。所观察到的菌丝体细 长、分枝较少、具明显的隔,叶鞘中菌丝体含量多,而在叶片中没有观察到菌丝体。 这些结果与文献上的描述基本吻合。

黑麦草叶鞘中的内生真菌

黑麦草种子中的内生真菌

不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

结果与分析
1不同氨素营养条件下内生真菌感染对黑麦草若干生长特征的影响
1.1第一处理期实验
1.1.1第一处理期叶长变化

A叶片长度累积值

从上图可以看出,EI和EF种群的叶片累积长度曲线形状相似,均可用直线拟合。

各个处理问的叶片累积长度在第一处理期期间均无显著性差异。值得注意的是,EI 和EF种群均是高氮浓度的叶片长度累积值较低,而低氮浓度的叶片长度累积值较高。
B叶片延伸速率





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将后一次的叶片长度累积值减去前一次的叶片长度累积值,然后除以间隔的天 数,即得叶片延伸速率。从上图可以看出,所有处理的叶片延伸速率曲线均里波浪形。 由于实验时测量的时间间隔是固定的(3天),因而说明叶片长度累积值的增加既不是

卅i同氮索营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

一个较为稳定的值,也不是随时问一直增加或减少,而是随时间先增加后减少,然后 再增加再减少,这样曲线才呈波浪形。比较上图中各条曲线间的差异发现,各个处理 问的波浪形状有相似的地方,但又不尽相同。另外,第一处理期中E12的叶片延伸速 率值一直较低,而EFO的叶片延伸速率值一直较高些,这就导致最后的叶片长度累积
值间的差异。

1.1.2第一处理期叶宽变化 A叶片宽度累积值

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7月13日

日期(date)

与第一处理期的叶片长度累积值变化曲线相似,各个处理间的叶片宽度累积曲线

也可以用直线拟合。EI和EF种群的各个处理间的叶宽累积值在第一处理期期间均无
显著性差异。值得注意的是,同叶长一样,也是高氮浓度的叶片宽度累积值较低,而

低氮浓度的叶片宽度累积值较高。 B叶片宽度增长速率



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叶宽增长速率曲线也是呈波浪形,从上图可以看出,各个处理间叶片宽度增长

速率无显著差异。E12的叶宽增长速率值平均要低一些,也就导致E12的叶宽累积
27

不同氯素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

值最后要低于其他处理。 1.1.3第一处理期叶面积变化

A叶面积累积值

^h。.【_ =\。山。一器旧蕾娶酶 日期(date)



叶面积累积值曲线形状与前已叙及的叶长、叶宽累积值曲线形状相似,都是可
以用直线拟合。上图中可以看出,第一处理期开始时各个处理的叶面累积值较为接 近,到第一处理期结束时,各个处理的叶面积累积值有一定的差异。尽管差异不显 著,但还是可以看到,EF种群的叶面积累积值比E1种群高,另外EF种群的叶面

积累积值在三个氮水平间没有明显差异,而在E1种群中E12的叶面积累积值要低于
低氮水平的。 B叶面积增长速率

乏 七


槲 删 业 蜜 辎 旧 古

叶面积增长速率曲线也是呈波浪形,从上图可以看出,各条曲线的波形都存在 一定的差异。E1种群的叶面积增长速率值要比EF种群低一些,E12的叶面积增长速 率值在各个处理间是最低的。

1.2第二处理期实验
28

不同氨素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

1.2.1第二处理期叶长变化 A叶片长度累积值

同前面一样,叶片长度累积值变化曲线形状也可以用直线拟合。从上图可以看 出,各个处理间的叶片长度累积值在第二处理期开始时是较为接近的,以后随着时 间的延长,它们之间就存在着一定的差异了。在低氮水平和高氮水平下,EI和EF

种群之间无明显差异:在中氮水平下,E11的叶片长度累积值要比EFl高。另外, E11的叶片长度累积值明显高于其他处理。同第一处理期的叶片长度累积曲线相比,
E12曲线的相对位置提高了,而EF0曲线的相对位置降低了。 B叶片延伸速率







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日期(date)

从上图可以看出,叶片延伸速率曲线形状也是呈波浪形。各个处理曲线的波峰、 波谷出现的时间不尽相同。EII的叶片延伸速率要高出其他处理一些;E12曲线波动
较小并且其叶片延伸速率值平均来说不是最低,这就使它的叶长累积值能居于各个 处理间中等水平。


不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

1.2.2第二处理期叶宽变化 A叶片宽度累积值

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第二处理期的叶片宽度累积值曲线也可以用直线来拟合。从上图可以看出,EI
和EF种群各个氮处理之间的叶宽累积均无显著差异。同第一处理期不同的是,E12

的叶片宽度累积值有了一定的增加,不再像第一处理期那样最低。
B叶片宽度增长速率
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第二处理期的叶宽增长速率曲线也呈波浪形,各个处理问的波形还是有一定差 异的。同第一处理期相比,EF2的叶宽增长速率值相对其他处理还是有了一定的提
高。

1.2.3第二处理期叶面积变化
A叶面积累积值 同第一处理期,第二处理期的叶面积累积值曲线也可以用直线来拟合。所不同 的是,第一处理期中E12的叶面积累积值最低,在第二处理期中已位于中等水平;

而EFO在第一处理期中的叶面积累积值是最高的,但在第二处理期下降至较低水平。
10

不同氨紊营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

手金龙









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B叶面积增长速率

第二处理期叶面积增长速率曲线也呈波浪形,EF和E1种群的各个处理间均存 在一定的差异。EF种群中,EFl和EF2的叶面积增长速率较大些,EFO的叶面积增 长速率较低:E1种群中,EIO的叶面积增长速率较低。这就导致EFO和EIO的叶面 积累积值较低。

1.3第三处理期实验
1.3.1第三处理期叶长变化 A叶片长度累积值 从下图可以看出,各个处理曲线均可以用直线来拟合。不同于第一、第二处理 期的是,第三处理期EI的累积叶长比前两个处理期有了一定的提高。图中尽管E12、

EIO的累积叶长和其它处理之间并无显著性差异,但其曲线的位置已位于其它曲线
之上。

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第三处理期的叶片延伸速率曲线也呈不规则波浪形,从上图可以看出,E12和 E10的叶片延伸速率值较其他处理要大,因而会导致第三轮实验结束时E12和E10
的叶片长度累积值较大。 1.3.2第三处理期叶宽变化 A叶片宽度累积值

从下图可以看出,EI和EF种群的各个处理的叶宽累积曲线比较靠近,这说明 处理间的叶片宽度累积值之间并无显著性差异。同前两个处理期比较而言,E12和
EI

1的叶宽累积值相对于其他处理增大了。

不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生K和生理特征的影响研究

王金龙




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10月1日 10月11日 日期(date)

10月21日

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10月21日

10月31日

日期(date)

从上图可以看出,第三处理期的叶宽增长速率曲线也呈不规则波浪形,而且波

的形状、大小不尽相同。与前面的两个处理期相比较,第三处理期中E1种群的叶宽 增长速率相对来说也有了一定的提高,尤其是E12在10月上旬的叶宽增长速率值明
显高于其他处理。 1.3.3第三处理期叶面积变化 A叶面积累积值 第三处理期叶面积累积值曲线同前两个处理期一样,也可以用直线来拟合。从 下图可以看出,EI和EF种群的不同氮水平以及同一氮水平的EI和EF种群之间的 累积叶面积值在整个实验过程中并无显著性差异。但不同于前两个处理期的是,E1

种群的叶面积累积值相对来说是提高了,而EF种群的叶面积累积值相对来说则是下 降了。这些变化从E12和EF0两条曲线来看,是最为明显的。

不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙









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B叶面积增长速率




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1日

日期(date)

由于第三处理期叶长、叶宽测定的次数较前两个处理期要多,所以各个处理的

波浪形显得更为错综复杂些。虽然各个处理间的叶面积增长速率值差异不是太明显, 但还是可以看出,E12的叶面积增长速率总体来说还是较高的。

2不同氮素营养条件下内生真菌感染对黑麦草若干生理特征的影响
2.1第一处理期实验
2.1.1

6月26日生理指标日变化

A环境因子F1变化 B净光合速率日变化 各个氮水平下EI和EF的单叶净光合速率呈现双峰曲线:一个高峰在上午9:

00,一个高峰在下午3:00(EFl在l:oo左右1。从下图可以看出:EFO的两个峰值
最低;E12在上午9:oo至12:00期间净光合速率明显高于其它处理。
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C蒸腾速率日变化

不同氪素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

由上图可以看出,EI和EF种群各胁迫强度的单叶蒸腾曲线都呈双峰形,大多 一个峰值在上午9:00,另一个峰值出现在13:00左右。除E12和EF0外,EI和EF 的各个氮水平之间及同一氮水平下的EI和EF种群之间无明显差异。E12在上午10:
00后其蒸腾速率平均来说明显高于其它处理;而EF0的蒸腾速率开始一直较低,只 有在下午2:00至4:00期间较高。

D单叶水分利用效率日变化 10.0『——一一
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EI和EF的各个氮水平之间以及同一氮水平下的EI和EF种群之间单叶水分利 用效率均无显著差异。
E气孔导度日变化

EI和EF种群的气孔导度日变化曲线都呈双峰型,一个高峰出现在上午9:oo, 另一个高峰出现在下午1:00或3:oo。同一氮水平的EI和EF种群以及EI和EF
种群的不同氮水平间都存在一定的差异。在上午9:30至11:30之间E12的气孑L导 度明显高于其他处理。


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F细胞间隙C02浓度日变化 从下陲q.-I以看出,El和EF种群细胞间隙C02浓度日变化曲线是在一定范围内 上下波动。同一氮水平下的EI和EF种群以及EI和EF种群内的三个氮水平之间还 是存在一定的差异的,但不太明显。

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时间(Time)

2.2第二处理期实验
1,2.1

8月15日生理指标日变化

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时间(Time)

37

不同氨索营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

千金龙

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时间(Time)

8月15日EI和EF种群的净光合速率日变化曲线形状不一。E12和EF2的曲线

是呈双峰型,而其它处理的净光合速率日变化曲线呈单峰型,但它们在上午9:00
时都有一个共同的峰。然后,EIO和EF0曲线下降得较快,Ell和EFl曲线也在下

降,而E12和EF2曲线是下降后又出现了第二个峰。因而,EI和EF种群的三个氮 水平之间有着较大的差异,而同一氮水平下的EI和EF种群并没有太大的差异。
C蒸腾速率日变化
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8月15 I:1的蒸腾速率日变化曲线都是单峰型曲线,除EIO外,其它曲线的峰值

出现在12:30左右。除了E10外,其它处理的蒸腾速率日变化之间差异并不大。
D单叶水分利用效率日变化

从下图可见,EI和EF的各氮水平之间以及同一氮水平下的EI和EF种群之间 单叶水分利用效率均无显著差异。
38

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8月15同的气孔导度宽化曲线除EIO有一个峰外,其它处理的曲线走势一致 都是一直呈下降趋势,它们之间的差异不是太大。
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39



不同氨素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

从上图可以看出,除了E10和EF0外,其余四条曲线形状一致。EI和EF的各
氮水平之间以及同一氮水平下的EI和EF种群之间无显著性差异。
1.2.2

8月21日生理指标日变化

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时间(Time)

B净光合速率日变化






时间(Time)

由上图净光合速率可以看出,EI和EF种群的净光合速率日变化曲线都呈单峰 型,峰值出现在上午9:30左右。EI各氮水平之间的净光合速率差异不大,而EF

各氮水平之间的净光合速率有些差异,EFl的净光合速率较大一些。在同一氮水平
下E1种群比EF种群的净光合速率要高一些。


不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

C蒸腾速率日变化
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EI和EF种群在各个氮水平下的单叶蒸腾曲线呈早晚低、中午高的单峰曲线, 峰值出现在中午1:00附近。从早晨7:00到上午11:00,El和EF的各氮水平之

间以及同一氮水平下的EI和EF种群之间的蒸腾速率均无显著差异:从中午11:00
到下午4:00,E12的蒸腾速率要高于其它处理,另外E1种群的蒸腾速率总体来说 要比EF种群高一些。 D单叶水分利用效率

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从上图可以看出,EI和EF种群的单叶水分利用效率在上午8:00前是EF高
一些,但随着光辐射强度、叶温和气温的增加,E1种群的单叶水分利用效率增加得 要比EF种群快些,从上午9:00到下午3:00,E1种群的单叶水分利用效率总体 上要高于EF种群。EI和EF种群的各个氮水平间的单叶水分利用效率存在一些差

异,E1种群是E10高一些,EF种群是EFI高一些。
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E气孔导度日变化 除了E12的气孔导度在早晨7:00.8:oo间要高于其它处理外,在8月21日

EI和EF的各氮7烀2_l'fiJ以及同一氮水平下的El和EF种群之间均无明显差异。
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F细胞间隙C02浓度日变化

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时间(Tilne)

从上图可以看出,EI和EF的各氮水平之间以及同一氮水平下的EI和EF种群 之间并无显著性差异。
2.2.3

8月24日生理指标日变化

注:8月24日由于机器数据缺失(8:30.12:30),故只有从中午12:30到下
午16:30的数据。这样,这一天并不是一个完整的日进程,而只是半天的日进程。 A环境因子日变化

小同氨索营养下内生真菌感染对黑麦草若十生长和生理特征的影响研究

王金龙

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时间(Time)

从上图可以看出,E11和EFl的曲线是先下降再上升,其余四条曲线都是先略 有升高再下降。另外,同一氮水平下E1种群的净光合速率总是高于EF种群。E1 种群中,三个氮水平间的净光合速率值是E10>E12>E11:EF种群中,三个氮水平间
的净光合速率值是EFO>EF2>EFl。

C蒸腾速率日变化
8月24 R的蒸腾速率日变化曲线也是除了E11和EFl的曲线直线下降外,其

余四条曲线都有一个峰。另外,同一氮水平下E1种群的蒸腾速率总是高于EF种群 (E10和EFO之间差别较小)。E1种群中,三个氮水平间的净光合速率值是
43

不同氮索营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

E10>E12>E11;EF种群中,三个氮水平间的净光合速率值是EFO>EF2>EFl。
9.0

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D单叶水分利用效率日变化

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时间(Time)

从中午12:00到下午13:00问,6种处理的单叶水分利用效率值几乎一 致。在13:00到15:oo这个期间E12的单叶水分利用效率明显高于其他处理。 E气孔导度只变化
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8月24日气孔导度的日变化同前面一样,也是除了E11和EFl的曲线是先下 降后上升外,其余四条曲线都有一个峰。另外,同一氮水平下E1种群的蒸腾速率总 是高于EF种群。EI和EF种群都是低氮水平的处理气孔导度最大。 F细胞间隙C02浓度日变化

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时间(Time)

由上图可以看出,6条处理曲线之间差别不大,说明EI和EF的各氮水平之间 以及同一氮水平下的EI和EF种群之间的细胞间隙C02浓度差别不大。

2.3第三处理期实验
2.3.1

9月27日生理指标日变化

A环境因子日变化
B净光合速率日变化

由下图净光合日变化可看出,EI和EF种群的净光合速率日变化曲线都里单峰

型,但峰值出现的时间不同。E11、EFl和EF2的峰值出现在中午12:00左右,而 EFO、EIO和E12的峰值出现在下午2:00左右。EI和EF的各氮水平之间以及同一 氮水平下的EI和EF种群之间的净光合速率日变化均存在一定的差异。E1种群是低 氮浓度的净光合速率较高些,EF种群是中氮浓度的净光合速率高些。 C蒸腾速率日变化
由下图蒸腾速率日变化可以看出,EI和EF种群的蒸腾速率日变化都呈单峰型,

峰值出现在12:00左右,EI和EF的各氮水平之间以及同一氮水平下的EI和EF
种群之间的蒸腾速率日变化均无显著差异,只是E10在下午13:00至15:00间明 显高于其他处理。
45

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时间(Time)

不同氟索营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

D单叶水分利用效率
由下图可以看出,EI和EF种群的单叶水分利用效率早晚高,中午低。各个处

理间的差异总体上说不太明显。

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时间(Time)

9月27日的气孔导度日变化曲线都是单峰型,除两个低氮水平的曲线峰值在 下午14:00,其余4条曲线的峰值都在中午12:00。同一氮水平下EI的气孔导度总
体上要比EF种群要高一些。 F细胞间隙C02浓度日变化

由下图可以看出,9月27日的细胞间隙C02浓度值都是早晨、中午低,傍晚高
并且有一个峰。除了EIO和EFl两条曲线的值在10:00到14:00之间明显低外, 其它处理的曲线形状大体一样。

不同氨素营养下内生真菌感染对黑麦草若十生长和生理特征的影响研究

L:金龙

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时问(Time)

10月8日生理指标日变化

A环境因子日变化

B净光合速率日变化

由下图可看出,除E12和EF2外,EI和EF种群的净光合日变化曲线呈单峰型, 峰值出现在中午12:00左右。虽然EI和EF种群的不同氮浓度间存在一些差异,
但可以看出同一氮浓度下,EI的净光合速率总体上比EF高一些。 C蒸腾速率日变化 由下图可以看出,EI和EF种群的蒸腾速率日变化都呈单峰型,峰值出现在中 午12:00左右,EI和EF的各氮水平之间以及同一氮水平下的EI和EF种群之间的

蒸腾速率日变化有一些差异。总体上说,E1种群的蒸腾速率要比EF种群高一些。




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由单叶水分利用效率日变化图可以看出,EI和EF种群的单叶水分利用效率早 晚高,中午略低些。在同一氮浓度下,E1种群的水分利用效率总体来说要比EF种
群高些。

E气孔导度日变化

不同氨素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

10月8 R所有处理的气孔导度同变化曲线都是由高到低的走势。中午12:oo 前,EI和EF种群的各个处理间的气孔导度值存在一定的差异:但在12:oo后,这 6条曲线的形状几乎一致了。


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F细胞间隙C02浓度日变化

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10月8日EI和EF种群的细胞间隙C02浓度日变化曲线都是先下降后上升。各 个处理间的差异不是太大,只是高氮水平的E12和EF2的细胞间隙C02浓度值要比
低氮水平的高一些。

不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙





1不同氨水平下内生真菌感染对黑麦草生长特性的影响
1.1氮素对黑麦草生长特性的影响 有关氮素对植物生长特性例如生物量、分蘖数、叶片数、叶面积指数等生长指 标的影响的报道很多,普遍结论是施氮能够增加上述指标的值。在生长指标方面, 本实验重点是探讨了黑麦草的叶片延伸速率、叶宽增长速率以及叶面积增长速率,

结果发现氮素引起的叶片形态学变化并不明显。
实验时氮处理是通过向1/3浓度的Hoagland营养液加入不同量的NH。N0,来完

成的,最后形成11(低)、73(中)、220(高)mgNLl的氮素梯度。营养液中的ca(NO。): 和KNO,分别用CaCl:和KCl来代替,这样来保证氮素梯度控制的可能性。通过收获
时对土壤含氮量的测定,我们发现土壤的含氮量并不是处于较高水平的,基本上在 0.08%左右,这些可以说明整个实验过程中氮素的梯度还是存在的。

Yoshida等1969年报道的氮素引起水稻叶片典型的形态学变化如下表所示。叶
片的长度、宽度和叶面积增加,厚度下降。

我们的供氮梯度与Yoshida大体一样,但是没有得出上述结果。在实验的第一 处理期,从叶片长度累积值来看,E1种群是E11>EIO>E12,EF种群是EFO>EFl、

EF2;第二处理期,从叶片长度累积值来看,E1种群是E11>E12>EIO,EF种群是 EFl>EF2>EFO;第三处理期,从叶片长度累积值来看,E1种群是EIO、E12>E11,EF
种群是EFl>EF2>EFO。 总结这三个处理期叶片长度累积值的变化,可以发现,第一处理期时高氮浓度的

叶片累积长度是最低的,这有可能一方面与初始值有关,另一方面可与施氮不久有关,
5l

不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

即高氮水平处理并没有显现出优势。随着时间的延长,高氮浓度处理(E12和EF2)的 叶长累积值在6中处理中的相对位置有了提高,第二处理期E12和EF2位于中间水平,
到了第三处理期时E12已位居E1种群中的最高水平,而EF2也位于EF种群中的中间 水平。这说明高浓度的氮对E12和EF2的叶片生长还是有一定的效果的,但是在整个 实验过程中三个氮水平梯度并没有产生明显的结果。 从实验结果可以看出,叶片延伸速率与叶片长度累积值有一定的相关性,即叶片 长度累积值大的,叶片延伸速率值平均来说也较大。这一点很容易解释,因为我们实

验前所选的分蘖株的大小、叶片数基本一致,所以各种处理的初始叶长累积值基本一
致,差别不是太大,这样叶片延伸速率大的处理自然叶片长度累积值就会大了。 据报道,当养分供应不当时,光合作用速率降低或细胞膨胀不足都会限制叶片 生长速度。缺氮植物的叶细胞较小(Radin&Parker,1979),这一效应是水分传导性降 低造成的,它导致伸展的叶片中水分缺乏(Radin&Boyer,1982)。缺氮对叶片伸展的

影响因植物种类而异,单子叶植物昼夜间细胞扩展受阻程度相同(白天为16%,夜晚
为18%),然而双子叶植物则白天受阻更为严重(白天为53%,夜晚为8%)。这种效应 差异与品种间的形态差异以及与蒸腾和细胞扩展对有效水竞争的相应差异有关。对

双子叶植物,细胞扩展发生于裸露在大气中的叶片,因而在白天经受高的蒸腾率。
而对单子叶植物,细胞扩展发生在叶片基部,此处由于前叶叶鞘而免予和大气接触,

所以这个伸长带很少有蒸腾发生(Radin,1983)。黑麦草属于单子叶植物,因此缺氮 对其叶片伸展的影响不是太大,这可能是实验时未能得到明显的叶片延伸速率的梯
度的一个原因吧。 氮素对叶宽的影响较叶长要小,这是因为叶片纵向的延伸要比横向的扩展快多 了。从实验结果可以看出,叶片长度平均在lOcm左右,而叶片宽度却在0.3cm左右,

另外叶片延伸速率平均为1.5cm/天,而叶片宽度增长速率平均为0.04cm/天。从三 个处理期的叶片宽度累积值来看,其变化规律和叶片长度累积值变化规律基本一致。 这说明了长的叶片也会较宽的。 叶面积是通过叶长、叶宽以及黑麦草形状因子三者的乘积而计算出来的。由于 黑麦草形状因子是一个常数,所以叶面积的值是取决于叶长和叶宽的。从实验结果


卅;同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若十生长和生理特征的影响研究

王金龙

可以看出,叶面积累积值在三个实验处理期的变化同叶片长度累积值的变化非常相
似,即在实验的第一处理期,E1种群是ElI>EIO>E12,EF种群是EFO>EFl、EF2:

第二处理期,E1种群是E11>E12>EIO,EF种群是EFl、EF2>EFO;第三处理期,E1
种群是EIO、E12>Ell,EF种群是EFl>EF2>EFO。 1.2内生真菌对黑麦草生长特性的影响 国内外很多学者认为内生真菌对植物的营养生长有一定的促进作用,例如分蘖 数、生物量等。本实验通过150天对黑麦草感染和非感染种群叶片长度、叶片宽度 的观察和测量,发现内生真菌对多年生黑麦草的叶片形态学变化有一定的影响,感

染种群(EI)的优势随着时问的延长渐渐显示出来。 在实验的第一处理期,从叶片长度累积值来看,低氮水平的是EFO>EIO、中氮 水平的是EFl<E11、高氮水平的是EF2>E12:第二处理期,从叶片长度累积值来看, 低氮水平的是EFO*EIO、中氮水平的是EFI<E11、高氮水平的是EF2一E12;第三处
理期,从叶片长度累积值来看,低氮水平的是EFO<EIO、中氮水平的是EFl“E11、

高氮水平的是EF2<E12。从以上结果可以看出,同一氮水平下E1种群在实验第一处 理期的叶片长度累积值没有EF种群大(E11除外),在第二处理期时E1种群的叶片 长度累积值就和EF种群接近了,在实验的第三处理期时,E1种群的叶片长度累积 值就超过了EF种群。尽管EIl在第三处理期和EFl的叶片长度累积值接近,但在前 两个处理期EIl的值都大于EFI。所以,内生真菌对黑麦草叶长累积还是有一定影
响的。

正如前面所述,叶片延伸速率是和叶片长度累积值紧密联系在一起的。在实验

的第一处理期,同一氮水平下E1种群在实验第一处理期的叶片延伸速率值总体上没 有EF种群大,在第二处理期时E1种群的叶片延伸速率值就和EF种群接近了,在实
验的第三处理期时,E1种群的叶片延伸速率值就超过了EF种群。这说明内生真菌

感染会促进黑麦草的叶片延伸。 有关内生真菌侵染对宿主叶片生长的影响,国外早已有些报道。Latch等(1985)
发现,在控制的实验条件下,EI植株的叶生长显著高于EF植株。而Belesky等(1989)

在实验中却发现,黑麦草叶片生长在不同的accessions(同一品种中,根据表现型
53

型爨素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

划分的类群)之间而显著,而内生真菌的侵染对叶片延伸生长的影响不显著。Belesky
等(1987)还发现,高羊茅不同的无性系中,内生真菌侵染对叶片延伸生长的影响也 不同,在有的无性系中,叶片延伸生长EI大于EF植株,有的无性系差异不显著, 有的无性系中则是EF的叶片延伸生长大于EI植株。从国外的报道来看,内生真菌

侵染对植物叶片生长的影响不尽相同。我们的实验结果经统计学检验(可重复双因素 随机性方差分析)发现,内生真菌侵染对叶片延伸生长的影响并不是显著的,但从数 值上看,内生真菌的确提高了黑麦草的叶片延伸速率。 关于内生真菌对宿主叶片宽度的影响,本实验发现,在实验的第一处理期,从 叶片宽度累积值来看,低氮水平的是EFO>EIO、中氮水平的是EFI。EII、高氮水平
的是EF2>E12;第二处理期,从叶片宽度累积值来看,低氮水平的是EFO—EIO、中 氮水平的是EFlaEll、高氮水平的是EF2>E12;第三处理期,从叶片长度累积值来

看,低氮水平的是EFO<EIO、中氮水平的是EFl>E11、高氮水平的是EF2≈-E12。从
上述结果可以看出内生真菌对叶片宽度累积值的影响并不是太明显,但是E1种群在 从第一处理期到第三处理期的实验过程中,相对于EF种群来说,其优势渐渐显示出
来了。

前已叙及,叶面积值与叶长、叶宽密切相关,尤其是叶长,所以这三个处理期 中叶面积累积值的变化和叶片长度累积值的变化有很大的相似性。同一氮水平下E1 种群在实验第一处理期的叶面积累积值没有EF种群大,在第二处理期时E1种群的 叶面积累积值相对于EF种群有了一定的提高,在实验的第三处理期时,E1种群的 叶面积累积值就超过了EF种群(E11在第三处理期后半期叶面积累积值低于EFl)。 至于为何内生真菌会促进黑麦草的叶形态变化,我认为可能有两方面的原因:
一方面是内生真菌能提高黑麦草的生物抗性(抗虫性、抗病原菌等);另一方面是感

染植株和未感染植株在渗透调节物质以及激素含量上存在着差异。内生真菌感染能 提高植物的抗虫性,这一点已有很多报道。由于是田间实验,所以不可避免的会出 现病虫害,内生真菌产生的次生代谢物质会对它们有一定的抗性。另外,叶片的伸
展与叶肉细胞膨压密切相关,所以渗透调节物质的量就会起重要作用。一些植物激

素会促进细胞的分裂,所以植物激素的含量也与叶片的延伸关系密切。


一iI司氪素营荐下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

2不同氨水平下内生真菌感染对黑麦草生理特性的影响
2.1氮素对黑麦草生理特性的影响
关于氮素对植物光合、蒸腾等生理特征的影响,国内外报道得较多。氮素对作 物叶绿素、光合速率、暗反应的主要酶以及光呼吸等都有明显的影响,直接或间接影 响着光合作用。氮素是叶绿素的主要成分,施氮一般能促进植物叶片叶绿素的合成。 在一定范围内,施氮量越多,光合速率就越快。追施氮肥促使光合速率的原因有两 方面:一方面是促进叶片面积增大,叶片数目增多,增加光合面积,这是间接的影

响。另一方面是直接的影响,即影响光合能力。施氮肥后,叶绿素含量急剧增加,
加速光反应:增施氮肥,能改善光合酶的代谢,提高叶片羧化酶的含量和活性,改 善蛋白复合体PS I和PSⅡ的光合电子传递能力,减小光合底物C02扩散过程中的 阻力,也使暗反应进行顺利。

本实验中未能反映出氮素浓度越大,净光合速率越大这个规律,可能原因有两
点:1)各测定日特定时间进行的生理指标测定受当日测定时环境因子的影响相当

大,变化较为复杂:2)氮素超过一定值会降低同化速率。Evans研究发现小麦叶片 C02的固定只与叶片含氮量有关,但叶片含氮量超过125mmolm-2时,同化速率降低。 其可能原因有二:一是光合部位氮素含量增强,导致氮同化能力加强,就与光合碳 同化竞争ATP和NADPH;二是氮同化亦需要碳架,氮同化加强后,呼吸作用向光合
碳同化提供碳架的能力变小,C02同化速率降低。

很多报道反映,充分供水条件下蒸腾速率是随着氮素的增加而增加的。从实验 结果来看,氮素对蒸腾速率的影响也不明显。蒸腾速率与光合速率往往是联系在一 块的,因为植物在进行光合作用的时候,必须和周围环境发生气体交换:在气体交 换的同时,又会引起植物大量失去水分。由于本实验中氮水平对净光合速率影响不 大,所以对蒸腾速率的影响也不大是可以预料的。单叶水分利用效率是净光合速率 与蒸腾速率的比值,由于本实验中氮素对净光合速率及蒸腾速率的影响都不明显,
所以对单叶水分利用效率的影响也就不明显了。 上官周平(1997)曾报道过,在湿润条件下,小麦叶片气孔导度随着氮素用量的

增加而提高,而细胞间隙C02浓度在各氮肥处理间变化很小。曲桂敏等(2000)也报
55

不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

道过,随着施氮量的增加,苹果幼树叶片的气孔导度增加。本实验没有发现气孔导
度随氮素用量的增加而提高,但发现了细胞间隙C02浓度在各氮肥处理间变化很 小。实验也发现,气孔导度与净光合速率具有相似的相应模式,但气孔导度的变化 并不是净光合速率变化的原因,这是由于实验中的胁迫因素常常作用于叶绿体,使 其光合能力下降,成为限制光合速率的非气孔因素,包括RUBP羧化限制、RUBP再

生限制和无机磷限制,以及植物体内活性氧自由基代谢引发的光合器官结构与功能
的破坏及细胞内物质和能量代谢的失调。 2.2内生真菌对黑麦草生理特性的影响 关于内生真菌侵染对植物光合、蒸腾等生理特征的影响,国内外报道得不多。 内生真菌能否增强植物的光合作用,还存在一些争议。Belesky等在对高羊茅光合 活性的研究时发现,当光照强度增加时,EF植株较EI植株的光合能力更强,而当 光照强度降低时,EF植株更为敏感。考虑到EI植株可以积累更多的生物量,Belesky

等认为EF植株利用光合产物的效率较EI植株低,也反映了EF植株合理调节气孔关
闭的能力较低。Richardson等对高羊茅的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、细胞 间隙C02浓度和水分利用效率的日进程进行了研究,结果发现,净光合速率在四个 基因型上存在差异,而在内生真菌感染与不感染之间不存在确定的差异,其中还有 两个基因型的蒸腾失水量是EI植株小于EF植株。 通过对多年生黑麦草的上述指标日进程的测定,本实验发现:在净光合速率上, 不论是第一处理期、第二处理期,还是第三处理期,内生真菌感染(EI)种群比非感 染(EF)种群之间的净光合速率总体上要高一些。在蒸腾速率、水分利用效率和气孔

导度上,随着时间的延长,内生真菌感染(EI)种群的优势渐趋明显。在细胞间隙C02 浓度上,EI和EF种群之问无显著性差异。据此,我们认为内生真菌侵染对对植物
光合、蒸腾等生理特性还是有一定的增强作用的,这一点和Marks&Clay的研究有

相似的地方。
Marks和Clay作了EI和EF植株叶片的光合特性(C02交换速率)的对比研究,

结果表明,叶片C02交换速率在1989年lO月EI大于EF,而在7月和12月则无显
著差异,说明不同季节条件下,EI和EF植株的生理特征不同。本实验在6月、8
S6

不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若十生长和生理特征的影响研究

t金龙

月、9月和10月期问进行了日进程测定,由于条件所限,未能继续在11月和12月
份进行日进程测定,所以不能判断黑麦草在夏季和冬季的生理特征是否不同。比较 6月26日和10月8日这两次的日进程发现EI和EF植株的生理特征并无季节特征。 但Marks和Clay在进一步对数据与环境因子作相关分析时发现,叶片的C02交换 速率只与叶片温度相关,在叶温小于35 4C时,C02交换速率在EI和EF之间的差异 不显著,当叶温超过35℃时,EI植株的C02交换速率比EF植株高20~25%,差异

明显。由于我们的实验都是在夏秋季晴朗的天气下进行的,所以从环境因子叶温曲
线可以看出,中午12:oo至下午2:00之间,叶温都超过了35℃。比较此段时间

内EI和EF植株的净光合速率发现,在多数测定臼里,EI植株的净光合速率要比EF 植株高,并且越接近实验尾声,结果越明显。但我们并没有发现叶温超过35。C时, EI植株的C02交换速率比EF植株高20~25%这么明显的结果。 至于内生真菌在一定条件下增强宿主植物光合作用、蒸腾作用等生理特征的机 制,目前还未能弄清,这需要我们进一步去探讨。

/争

57

塑氨趟养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究
主要结论
l不同氨水平下内生真菌感染对黑麦草生长特性的影响

王金龙

?内生真菌感染对黑麦草叶片延伸速率有一定的影响,随着时间的延长,E1 种群的优势越来越明显。氮水平对黑麦草叶片延伸速率影响不如内生真菌
明显。

●EI和EF种群的各个处理间的叶宽累积值在实验过程期问均无显著性差异。 随着时间的延长,E1种群的优势越来越明显,氮水平对黑麦草叶片宽度的
影响不如内生真菌明显。

?内生真菌感染对黑麦草叶面积也有一定的影响,随着时间的延长,E1种群 的优势越来越明显。氮水平对黑麦草叶片面积的影响不如内生真菌明显。

2不同氨水平下内生真菌感染对愚麦草生理特性的影响
●在净光合速率上,不论是第一处理期、第二处理期,还是第三处理期,内

生真菌感染(EI)种群比非感染(EF)种群之间的净光合速率总体上要高一些。 ●在蒸腾速率、水分利用效率和气孔导度上,随着施氮时间的延长,内生真菌
感染(EI)种群的优势渐趋明显。 ●不管是在净光合速率、蒸腾速率、水分利用效率还是气孔导度上,氮素的影 响都没有内生真菌的影响大。

?在细胞间隙C02浓度上,EI和EF的各个氮水平以及同一氮水平下的EI和
EF种群之间均无显著性差异。

不间氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究

王金龙

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至同塑素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生长和生理特征的影响研究


王金龙







本文是在高玉葆教授的悉心指导下完成的。在本文形成的过程中,每一步都倾 注了高老师无数的心血。高老师高尚的人格,严谨的治学态度,博学精深的学问都 是值得我永远学习的。在过去三年的研究生生活中,高老师给予我无微不至的关怀 和帮助,我的每一点进步都与高老师的指导密不可分,谨此向高老师致以最衷心的
感谢和最诚挚的敬意!

实验过程中得到了任安芝副教授的许多指导,阮维斌老师也提出不少建设性意 见,本实验室的陈磊老师也给予了不少帮助在此向他们表示感谢:另外在酶活测定 的时候得到了王淑芳教授的指导,中心实验室的吕宪禹副教授和植物学实验室的田 俊英老师在实验药品与仪器使用上提供了不少便利,在此也向他(她)们表示感谢!
还需要感谢的是本实验室的成员,他们是博士后:刘林德、常学礼、何兴东; 博士生:马成仓、刘惠芬、李永红、梁宇、陈世苹、刘爽、赵念席;硕士生:周芳、

刘默涵、聂立影、王丹;本科生:高文生。他(她)们在实验期间也给予了不少帮助,
在此向他(她)们表示感谢! 我同宿舍的弟兄们也在实验中帮了不少忙,他们是王玉荣、关容、饶恩于、任

毅、周铁林以及牛会林同学;另外,同年级的罗绍光、刘清岱、范恩国、刘君也给 予了不少帮助,在此向他们一并表示感谢! 特别要感谢的是我的合作伙伴王巍同学,她在我的实验中给予了很多帮助,也 提出了不少建议,在此向她表示感谢! 我还要感谢的是我的家人,他(她)们不断的支持和鼓励才使我顺利完成学业!
最后向所有帮助我和惦记我的人表示感谢!

不同氮素营养下内生真菌感染对黑麦草若干生K=和生理特征的影响研究

千金龙

附录

C1301光合蒸腾溯定系统公式

1.w:开路系统中单位叶面积的质量流速(mol/m2.s)
W=2005.39×V×P/TaxA

这里,V:体积流速(叶/分钟) Ta:空气温度(K) P:大气压力(bar)

A:叶面积(锄2)
2.Pn:开路系统的净光合速率(u mol/m2.s) Pn=-WX(Co-ci)=-2005.39xV×P×rCo?Ci)/TaXA 这里,C“Ci):出(进)气口的C02浓度(ppm或u mol/m01) 3.E:蒸腾速率(mmol/m2.s)
E=(eo-ei)X-W X 1 03/(P.eo)

其中eo=hro×es
ei=hri×es
es 2

6.13753×10’exp[Ta×(18.564-1W254.4)/(Ta+255,57)】

这里e。为饱和蒸汽压(105 Pa) hro(hri)为出气(入气)相对湿度(%)

4..CI“f叶片气孔导度(mmol/m2.s)



1000 X W/[(ele。f-e0)(P-eo)(eo—ei)/P-RbW】

其中elcaltf=6.13753×103 exp[TIeaf×(18.564
eIcIf为叶温下饱和蒸汽压(105Pa) Tl。。f为叶温 Rb为边界层阻力(m2s/m01)这里用0.3 5.C02i。t:细胞间隙C02浓度(ppm或u mol/m01)
C02int=Ci一1.6Pn(Rb+Rjcaf)
In2s/mol

其中RI。。f为叶片气孔阻力,C。为进气C02浓度(IJ mol/m01)
70


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