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第七章 蛋白质工程的应用 修改


第七章 蛋白质工程的应用
21世纪生命科学发展的重要态势 世纪生命科学发展的重要态势
? 对生命现象的认识从基因工 程水平向蛋白质工程水平发展

? 现代生命科学研究的理论与 技术从较长期的积累走向应用

第一节 抗体工程

抗原(antigen,Ag)是指一种能刺 抗原( )是指一种能刺
激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴 人或动物机体产生抗体或致敏淋巴 抗体 细胞, 细胞,并能与这些产物在体内或体外 发生特异性结合的物质 发生特异性结合的物质 。 特异性结合 大分子蛋白质。 最常见的抗原分子是大分子蛋白质 最常见的抗原分子是大分子蛋白质。

医学上重要的抗原
细菌、病毒、衣原体、支原体、 病原微生物:细菌、病毒、衣原体、支原体、立克 次体、放线菌、螺旋体、真菌。成分复杂, 次体、放线菌、螺旋体、真菌。成分复杂,不同抗原 成分组成的复合体。 成分组成的复合体。

细菌外毒素与类毒素
外毒素: 外毒素:某些细菌在生长过程中合成分泌到菌体外的 毒性物质。 亿只小鼠。 毒性物质。肉毒毒素 1mg 可杀死 2亿只小鼠。 类毒素: 0.3%~0.4%甲醛溶液处理后, %~0.4 类毒素:外毒素经 0.3%~0.4%甲醛溶液处理后,失 去毒性,仍保留免疫原性。 去毒性,仍保留免疫原性。

异种动物血清:抗毒素的抗体, 异种动物血清:抗毒素的抗体,可中和病人体内相
应毒素,同时是异种抗原。 应毒素,同时是异种抗原。

肿瘤抗原:细胞恶变过程中出现的新抗原的总称。 肿瘤抗原:细胞恶变过程中出现的新抗原的总称。

抗体的发现
1890 年,德国学者 Emil von Behring在 Koch 研究所 应用白喉外毒素给动物免疫, 应用白喉外毒素给动物免疫,发现在其血清中有一 种能中和外毒素的物质,称为抗毒素。 种能中和外毒素的物质,称为抗毒素。将这种免疫 血清转移给正常动物也有中和外毒素的作用。 血清转移给正常动物也有中和外毒素的作用。这种 被动免疫法很快应用于临床治疗。Behring于 被动免疫法很快应用于临床治疗。Behring于 1891 年应用来自动物的免疫血清成功治疗了一个白喉患 这是第一个被动免疫治疗的病例。为此, 者,这是第一个被动免疫治疗的病例。为此,他于 年获得了诺贝尔医学奖。 1902 年获得了诺贝尔医学奖。

Emil von Behring倍林

Emil von Behring 1854 - 1917, Nobel Prize in 1902 for demonstrating that circulating antitoxins against diphtheria and tetanus toxins conferred immunity.

德国细菌学、免疫学家。 德国细菌学 、 免疫学家 。 以抗毒素对白喉患者进行治 疗 ,发现此种中和毒素的能力 发现此种中和毒素的能力 能被动地转移给正常动物,使 能被动地转移给正常动物 使 后者获得抗白喉毒素的免疫 开创了血清疗法, 力, 开创了血清疗法,使白喉 死亡率大为降低; 死亡率大为降低 ; 他还证明 用非致死量的破伤风毒素多 次给动物注射后, 次给动物注射后 , 其血清对 破伤风毒素有特异性中和作 用 , 将此血清注射给其他动 物也可使之获得免疫, 物也可使之获得免疫 , 又研 制成功破伤风免疫血清, 制成功破伤风免疫血清 , 用 于战伤获得良好效果。 于战伤获得良好效果。

第一节 抗体工程
一、概述
抗体( 细胞识别抗 抗体(Antibody ,Ab): 是B细胞识别抗 细胞 原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白 浆细胞所产生的一种 原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白 主要存在于血清等体液中, 质,主要存在于血清等体液中,能与相应 抗原特异性地结合,具有免疫功能。 抗原特异性地结合,具有免疫功能。 免疫球蛋白(Immunoglobulin, 免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig): 是 指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的 球蛋白。 球蛋白。IgG、IgM、IgA、和IgE 、 、 、

抗体工程( engineering) 抗体工程(antibody engineering) 是通过对抗体分子结构和功能关系的 研究,有计划地对抗体蛋白序列进行 研究, 改造,改善抗体某些功能的技术。 改造,改善抗体某些功能的技术。

二、抗体的结构与分类

(一)抗体的结构
1.重链和轻链 .重链和 重链( chain, 450-550个 重链(heavy chain,H链)由450-550个 氨基酸组成,分子质量约为50 50- ku, 氨基酸组成,分子质量约为50-70 ku,有 对链内二硫键。 4-5对链内二硫键。 轻链( chain, 214个氨基 轻链(light chain,L链)由214个氨基 酸组成,分子质量约为2.5 ku, 酸组成,分子质量约为2.5 ku,有两对链 内二硫键。 内二硫键。

2.可变区和恒定区
— —

— —

轻链 重链
— — —
V

-S -S C C

V
H

L



-S -S —

-

-S S

-

-S S





CDRs

S S -S-S-S-S-

S S

S S -S-S+

S S

L

S

-S -S -

-S -S -

抗体分子结构示意图



铰链区

-S-S-S-SC 2 C 2 C h2

— —

— —

-S -S -S -S -S -S

SS-S SSSSS-S

S S h1


S S
— — — — — —

木瓜蛋白酶消化
-S-S-S-S-

S

— — —

— — — —

— — —

-S -S -S -S S S S S S-

-

S S S -S -

— — — —

— — — — — — — — —

-S -S -S -S -S -S -S -S -S -S -

胃蛋白酶消化

C h3 h h

S S -S-S-S-S-

S S



抗体分子的酶解片段

region, (1)可变区(variable region,V区) 可变区( 重链可变区( 为重链N端约110 110个 重链可变区(VH区)为重链N端约110个 氨基酸残基组成的区域, 氨基酸残基组成的区域, 轻链可变区( 位于轻链N端约100 轻链可变区(VL区)位于轻链N端约100 个氨基酸残基区域。 个氨基酸残基区域。 region, (2)恒定区(constant region,C区) 恒定区( 氨基酸序列相对稳定保守的区域。重链C 氨基酸序列相对稳定保守的区域。重链C 位于重链C 340-440个氨基酸组 区(CH区)位于重链C端340-440个氨基酸组 成的区域,轻链C 位于轻链C 成的区域,轻链C区(CL区)位于轻链C端约 105个氨基酸的区域 个氨基酸的区域。 105个氨基酸的区域。

(二)抗体的分类
多克隆抗体 单克隆抗体 基因工程抗体

1.多克隆抗体 多克隆抗体(polyclonal antibody, pAb) 多克隆抗体
用含多种抗原决定簇的Ag物质免 用含多种抗原决定簇的Ag物质免 Ag 疫动物,刺激多个B 疫动物,刺激多个B细胞克隆所获得 的免疫血清(含多种Ab的混合物), 的免疫血清(含多种Ab的混合物), Ab的混合物 称为pAb pAb。 称为pAb。 特点:来源广泛,制备容易; 特点:来源广泛,制备容易; 特异性不高。 特异性不高。

6-8aa

2.单克隆抗体( 2.单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb, mAb) 单克隆抗体
由一个识别一种Ag表位的B 由一个识别一种Ag表位的B细胞克隆产生的同源 Ag表位的 Ab。 Ab。 借助小鼠B细胞杂交瘤(hybridoma)技术, 借助小鼠B细胞杂交瘤(hybridoma)技术,所制 备的高度均一(属同一类、亚类、型别)、 )、单一 备的高度均一(属同一类、亚类、型别)、单一 特异性(仅针对特定抗定Ag表位) Ab。 Ag表位 特异性(仅针对特定抗定Ag表位)的Ab。 特点:纯度高,特异性强,效价高,可大量生产, 特点:纯度高,特异性强,效价高,可大量生产,交 叉反应少或无。 叉反应少或无。

杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞
后同时保持两者的主要特征。 后同时保持两者的主要特征。当两个细胞紧密 接触时候,其细胞膜可能融合在一起。 接触时候,其细胞膜可能融合在一起。

B淋巴细胞杂交瘤技术 淋巴细胞杂交瘤技术
该技术中采用的两株细胞分别是经抗原免疫的 该技术中采用的两株细胞分别是经抗原免疫的 小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。 小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。前者的主要特 征是它的抗体分泌功能, 征是它的抗体分泌功能,但在体外不能长期生 而后者则可在体外培养无限分裂增殖, 长;而后者则可在体外培养无限分裂增殖,二 者杂交融合, 者杂交融合,形成在体外无限增殖分裂并产生 McAb的杂交瘤细胞。 的杂交瘤细胞。 的杂交瘤细胞

单克隆抗体的基本原理

致敏的B淋巴细胞 致敏的B 杂交瘤

骨髓瘤细胞

细胞融合
细胞融合( 细胞融合(Cell fusion)是上世纪 年代发展 )是上世纪60年代发展 起来的一门细胞工程技术, 起来的一门细胞工程技术,在自然条件下或人 工诱导使两个或两个以上的相同或不同的细胞 合并形成一个细胞的过程。 合并形成一个细胞的过程。 细胞融合实际上包含多个过程: 细胞融合实际上包含多个过程:首先是两个亲 本细胞挨近,两者细胞膜粘合, 本细胞挨近,两者细胞膜粘合,以后膜组织局 部破损,最终形成完整的连续胞膜。 部破损,最终形成完整的连续胞膜。

融合剂
细胞虽在体外培养条件下会自发融合, 细胞虽在体外培养条件下会自发融合,但频率极 低,故均须添加具有诱导细胞融合效应的生物因 子或化学试剂,或采用电融合技术, 子或化学试剂,或采用电融合技术,人为地促进 细胞融合。 细胞融合。 通常把这种可以促进细胞融合,提高细胞融合率 通常把这种可以促进细胞融合, 而加入的生物因子或化学试剂叫做细胞融合剂 细胞融合剂。 而加入的生物因子或化学试剂叫做细胞融合剂。

生物方法(如灭活仙台病毒):这种病毒 生物方法(如灭活仙台病毒):这种病毒 ): 可进入细胞内, 可进入细胞内,在邻近的细胞之间形成细 胞质桥,介导细胞与细胞的融合。 胞质桥,介导细胞与细胞的融合。

诱 导 细

化学方法(聚乙二醇):聚乙二醇简便、易得, ):聚乙二醇简便 化学方法(聚乙二醇):聚乙二醇简便、易得, 且融合效果稳定, 且融合效果稳定,使细胞膜的脂类分子的酰键及 极性基团发生重排, 极性基团发生重排,从而打开细胞膜促使细胞融 合。(实验常用方法) 。(实验常用方法 实验常用方法) 物理方法(电激和激光):造成膜脂分子排列的 ):造成膜脂分子排列的 物理方法(电激和激光): 改变,去掉作用因素之后, 改变,去掉作用因素之后,质膜恢复原有的有序 结构, 结构,在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生 融合。 融合。

脾细胞

骨髓瘤细胞
50%PEG 1mL

培养液 10 mL

500g离心 10min 离心

37 ℃摇动、由慢渐快 摇动、 1min、静止 、静止1.5min

1000g离心 7min 离心

加入HAT培养 加入HAT培养 HAT 液悬浮细胞, 液悬浮细胞, 置于培养孔内

HAT选择杂交瘤细胞 选择杂交瘤细胞
细胞融合是一个随机的物理过程,并非全部的细胞都能融合。 细胞融合是一个随机的物理过程,并非全部的细胞都能融合。 除不同亲本细胞间的融合外, 除不同亲本细胞间的融合外,与此同时还伴有各亲本细胞的 自身融合, 自身融合,就需设法把含两亲本细胞染色体的杂种细胞分离 或筛选出来。 或筛选出来。 最简便的办法无疑是应用选择培养基,使亲本细胞死亡, 最简便的办法无疑是应用选择培养基,使亲本细胞死亡,仅 让杂种细胞存活下来。 让杂种细胞存活下来。
HAT培养基: 培养基: 培养基 H (Hypoxanthine):次黄嘌呤 ) 次黄嘌呤 A (Aminopterin):氨基喋呤;叶酸拮抗物,阻断 ):氨基喋呤 ):氨基喋呤;叶酸拮抗物,阻断DNA合成主要途径 合成主要途径 T (Thymidine):胸腺嘧啶核苷;“核苷酸前体”,供细胞通过替代途 :胸腺嘧啶核苷; 核苷酸前体” 径合成DNA 径合成

核苷酸从头合成途径 synthesis) (de novo synthesis)

核苷酸补救合成途径 (salvage synthesis) ) 次黄嘌呤( 次黄嘌呤(H)

氨基碟呤 (A)

HAT

胸腺嘧啶核苷( 胸腺嘧啶核苷(T)

核苷酸

DNA

HAT选择培养原理 选择培养原理

随机融合后的细胞类型
细胞组合

HGPRT + + + -

生长状态

淋巴细胞 + 骨髓瘤 淋巴细胞 + 淋巴细胞 骨髓瘤 + 骨髓瘤 未融合淋巴细胞 未融合骨髓瘤

长期生长 短期生长 不能生长 短期生长 不能生长

HGPRT:黄嘌呤 鸟嘌呤 磷酸核糖转移酶 黄嘌呤-鸟嘌呤 黄嘌呤 鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶

抗体的检测
细胞融合2周左右就可筛选杂交瘤细胞, 细胞融合 周左右就可筛选杂交瘤细胞,即 周左右就可筛选杂交瘤细胞 是有针对性地从众多的细胞孔中选出分泌 所需抗体的杂交瘤孔。 所需抗体的杂交瘤孔。
目 前 常 用 的 方 法
试验(indirect 试验(indirect agglutination test) 免疫 试验( test) 试验(immunofluorescens test) 酶联免疫吸附试验(ELISA) 酶联免疫吸附试验(ELISA) 免疫测 RIA) (radioimmuno-assay, RIA) radioimmuno-

3.基因工程抗体 基因工程抗体 基因工程抗体是利用DNA重组技术, 基因工程抗体是利用DNA重组技术,通 是利用DNA重组技术 过对抗体基因结构与功能的了解, 过对抗体基因结构与功能的了解,有目的 地在基因水平上对抗体分子进行切割、 地在基因水平上对抗体分子进行切割、 拼接、或修饰, 拼接、或修饰,或直接合成抗体基因序 列,再将基因导入细胞表达产生的一类 抗体。 抗体。

基因工程抗体的类型
1. 人鼠嵌合抗体 2. 鼠单抗可变区人源化抗体 小分子抗体(Fab, ,scFv diabody, scFv, 3. 小分子抗体(Fab, Fv ,scFv,diabody, single domain antibody) ,minimal recognition unit) 4. 双特异性及多特异性抗体

人鼠嵌合抗体
在基因水平上将鼠源单克隆抗体的可变 区和人抗体的恒定区连接起来,并在合 区和人抗体的恒定区连接起来, 适的宿主细胞中进行表达的抗体。 适的宿主细胞中进行表达的抗体。

鼠单抗可变区人源化抗体
改形抗体
将人单抗的CDR区替换成鼠单抗的相应区域, 区替换成鼠单抗的相应区域, 将人单抗的 区替换成鼠单抗的相应区域 就能使得人单抗获得与鼠单抗一样的抗原特异 并最大程度的降低抗体异源性。 性,并最大程度的降低抗体异源性。

镶面抗体
使骨架区中暴露的氨基酸残基替换成人单抗可 变区的相应的氨基酸残基就可使鼠单抗可变区 人源化。 人源化。

小分子抗体的种类及组成
种 类 组 成 Fab片段 Fab片段 重组Fab片段 重组Fab片段 Fab Fv 单链抗体scFv 单链抗体scFv 单域抗体 最小识别单位 VH、CH1、一条完整的轻链 一条完整的轻链, VH、CH1、一条完整的轻链,其中 CHl与CL为人源 VH、VL,二者通过非共价键连接 由短肽连接的V 形成的抗体, 由短肽连接的VH和VL形成的抗体, 为一单链分子 由单个V 或单个V 由单个VH或单个VL组成 单独的CDR 单独的CDR

单链抗体(scFv)是其中研究的最热 是其中研究的最热 单链抗体 门的领域之一
VL VH C L C L VL VH

1 CH

1 CH

CH2 CH3

CH2 CH3

Antibody IgG structure
VL

Fab

C VH CH1

L

(Fab’)2 Hinge

Fc

CH2 CH3

Membrane Extension

Antibody IgG structure
VL C VH CH1 L

CH2 CH3

Fv
VH

VL C

L

CH1

CH2 CH3

VL

VL

Fv

scFv
VH VH

Single Chain Fragment variable

ScFv的结构 特点
ScFv是抗体分子中保留抗原结合部位的最 ScFv是抗体分子中保留抗原结合部位的最 是抗体分子中保留抗原结合部位的 小功能片段, 由重链可变区和轻链可变区 小功能片段, 构成的小分子, 构成的小分子,它仍然保持着天然抗体的特 异性和大致相似亲和力。重链可变区和轻 异性和大致相似亲和力。 链可变区由一条亲水性的柔软的连接肽。 链可变区由一条亲水性的柔软的连接肽。 从而形成和天然抗体中抗原结合位点相似 的结构。 的结构。

scFv 的特点
1. 2. 3. 4. 5. 6. 分子小:全抗体的1/6 分子小:全抗体的1/6 免疫原性低 非靶向组织中滞留时间短 在血液中清除快 对肿瘤穿透力强 易于生产

scFv的应用 1.疾病诊断 疾病诊断
ELISA诊断试剂盒 scFv与碱性磷酸酶 诊断试剂盒: (1) ELISA诊断试剂盒:scFv与碱性磷酸酶 或荧光素酶融合,做成ELISA试剂盒。 ELISA试剂盒 或荧光素酶融合,做成ELISA试剂盒。这种 试剂盒更简便, 节省测试时间。 试剂盒更简便, 节省测试时间。 免疫成像诊断: (2) 免疫成像诊断:用同位素标记的抗肿瘤 相关抗原的scFv应用于病人的显像诊断。 scFv应用于病人的显像诊断 相关抗原的scFv应用于病人的显像诊断。 肿瘤部位定位明显, 肿瘤部位定位明显,优于目前应用的各种 成像技术。 成像技术。

2.疾病治疗 疾病治疗
肿瘤治疗: 肿瘤治疗: scFv 用于肿瘤治疗主要通过以下 方式: 方式: 重组免疫毒素: 基因与毒素基因相连, (1) 重组免疫毒素:将scFv 基因与毒素基因相连, 经表达后得到的单链抗体与毒素的融合蛋白; 经表达后得到的单链抗体与毒素的融合蛋白; 与细胞因子融合蛋白; (2) scFv 与细胞因子融合蛋白; 与药物代谢酶相连:称为“ (3) scFv 与药物代谢酶相连:称为“抗体导向 前体药物疗法” ADEPT) 酶-前体药物疗法”(ADEPT)

ScFv在朊病毒检测上的应用 在朊病毒检测上的应用
Prion(疯牛病) Prion(疯牛病)
Prion是引起人和动物的一种传染性病原 , Prion 是引起人和动物的一种传染性病原, 又 是引起人和动物的一种传染性病原 称疯牛病、羊瘙痒病、人类海绵状脑病。 称疯牛病、羊瘙痒病、人类海绵状脑病。迄今 尚无有效的治疗方法。 尚无有效的治疗方法。 两种Prion: 两种Prion:PRPc 和PRPsc Prion

三、抗体融合蛋白
将抗体分子(或片段) 将抗体分子(或片段)与其他效应分子 连接,可以产生具有新生物学活性的杂 连接,可以产生具有新生物学活性的杂 合分子( molecule) 合分子(hybrid molecule),即免疫导 向分子。 向分子。借助于抗体对靶抗原的高度特 异性, 异性,可将连接的融和蛋白的生物学活 性导向至特定的靶部位, 性导向至特定的靶部位,更有效地发挥 其生物学功能, 其生物学功能,减轻对非靶部位组织的 毒副作用。 毒副作用。

(一)免疫毒素
免疫毒素(Immunotoxions,ITs) 免疫毒素(Immunotoxions,ITs)是运 用蛋白质工程技术设计、构建, 用蛋白质工程技术设计、构建,将一种 毒素肽与对靶细胞具有高度特异性抗体 连接起来的融合蛋白。 连接起来的融合蛋白。 免疫毒素通过抗体部分靶向结构域的特 异结合功能使毒素传递到靶细胞并与之 作用进而杀死靶细胞。 作用进而杀死靶细胞。

1.毒素 . 2.重组抗体片段 . 3.几类重组免疫毒素 .

1.毒素 .
植物毒素的A 或植物RIP通常具有N 糖苷酶的活性, 植物毒素的A链或植物RIP通常具有N-糖苷酶的活性, RIP通常具有 的活性 可催化核糖体组成成分28S RNA的特定位点脱嘌呤 的特定位点脱嘌呤, 可催化核糖体组成成分28S RNA的特定位点脱嘌呤, 从而使核糖体60S亚基失活 理论上,一个A 核糖体60S亚基失活。 从而使核糖体60S亚基失活。理论上,一个A链分子 RIP每分钟可以使1500个核糖体失活 每分钟可以使1500个核糖体失活, 或RIP每分钟可以使1500个核糖体失活,从而抑制 蛋白质合成,最终导致细胞死亡。 蛋白质合成,最终导致细胞死亡。 真菌毒素均有特异的核酸内切酶活性, 真菌毒素均有特异的核酸内切酶活性,可以催化水 3’端的单个磷酸酯键,导致核糖体60S 端的单个磷酸酯键 解28S RNA 3 端的单个磷酸酯键,导致核糖体60S 亚基失活,抑制蛋白质合成,从而导致细胞死亡。 亚基失活,抑制蛋白质合成,从而导致细胞死亡。

2.重组抗体片段 .

3.几类重组免疫毒素 . 有研究者构建了源于mAb B3的二硫键稳定单 有研究者构建了源于mAb B3的二硫键稳定单 链抗体( dsscFv),与改造后的假单孢 ),与改造后的 链抗体(B3 dsscFv),与改造后的假单孢 菌外毒素PE 38基因进行了融合表达 PE- 基因进行了融合表达, 菌外毒素PE-38基因进行了融合表达,所获 得的B3dsscFv PE38免疫毒素具备导向和杀 B3dsscFv得的B3dsscFv-PE38免疫毒素具备导向和杀 伤肿瘤细胞的双重功能和良好的稳定性, 伤肿瘤细胞的双重功能和良好的稳定性,为 研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物奠定了一 定的基础。 定的基础。

3.几类重组免疫毒素 .
研究者构建了二硫键稳定的人源化抗肝 研究者构建了二硫键稳定的人源化抗肝 癌单链抗体(hdsFv)与牛蛙核糖核酸酶 癌单链抗体(hdsFv)与牛蛙核糖核酸酶 RC-RNase)重组免疫毒素(hdsFv-RC(RC-RNase)重组免疫毒素(hdsFv-RCRNase),研究表明hdsFv RC-RNase重组 ),研究表明hdsFvRNase),研究表明hdsFv-RC-RNase重组 免疫毒素对荷人肝癌裸鼠移植瘤生长具 有良好的抑制作用。 有良好的抑制作用。

处于实验室研究及临床试验阶段的几种重组免疫毒素
抗 体 Rituximab 抗CD22 Fv scFv MAGE抗MAGE-A1 Fv hdsFv hdsFv BDIBDI-1 效应分子 Allicin, Allicin,大蒜素 PE38, PE38,假单孢菌外毒素 PE 38 ETA, ETA,绿脓杆菌外毒素 Abrin- 相思子毒素A Abrin-A,相思子毒素A 链 RC-RNase, RC-RNase,牛蛙核糖核 酸酶 hEDN, hEDN,人嗜酸细胞神经 毒素 PEA, PEA,绿脓杆菌外毒素 疾 病 白血病 白血病 前列腺癌 肝癌 肝癌 肝癌 膀胱癌

(二)基因工程抗体 酶融合蛋白 基因工程抗体-酶 抗体
1.ADEPT体系中的抗体 . 体系中的抗体 用于ADEPT体系的理想抗体应满足以下几 用于ADEPT体系的理想抗体应满足以下几 ADEPT 方面: 方面: ①抗体与肿瘤组织亲和力较高; 抗体与肿瘤组织亲和力较高; 抗体不结合正常组织或结合很弱; ②抗体不结合正常组织或结合很弱; 抗体与抗原的结合不受酶结合的影响; ③抗体与抗原的结合不受酶结合的影响; 抗体与酶结合不影响酶的活性; ④抗体与酶结合不影响酶的活性; 抗体的免疫原性较低等。 ⑤抗体的免疫原性较低等。

2.ADEPT体系中的酶 . 体系中的酶
来 源 用 于 和 抗 体 偶 联 的 酶 羧肽酶G2 CPG2)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、 G2( )、胞嘧啶脱氨酶 羧肽酶G2(CPG2)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、 非哺乳动物来源 内酰胺酶( )、青霉素 青霉素G (无哺乳动物同源 β-内酰胺酶(β-L)、青霉素G氨基化酶 性) PGA)、青霉素V氨基化酶(PVA) )、青霉素 (PGA)、青霉素V氨基化酶(PVA)
非哺乳动物来源 葡苷酸酶( )、羧肽酶 羧肽酶A CPA)、 β-葡苷酸酶(β-G)、羧肽酶A(CPA)、 (具哺乳动物同源 硝基还原酶(NR) 硝基还原酶(NR) 性) 哺乳动物来源

碱性磷酸酶(AP)、α 半乳糖苷酶( 碱性磷酸酶(AP)、α-半乳糖苷酶(α-g) )、

3.几类ADEPT体系 .几类 体系
抗 体 W14 A5B7 KS1/4 靶抗原 β-hCG CEA 活化酶 CPG2 CPG2 前 药 苯甲酸氮芥谷氨酰胺衍 生物 ZD2767 甲氨喋呤甲氨喋呤-α-丙氨酸 对羟苯乙酰阿霉素 5-氟胞嘧啶 头孢菌素氮芥 肺腺癌 肿瘤特异性 绒毛膜上皮 癌 结肠癌 肺腺癌

肺癌相关抗原 CPA PGA

L6

肺癌相关抗原 CD β -L

(三)基因工程抗体 细胞因子融合蛋白 基因工程抗体-细胞因子 抗体 细胞因子融合蛋白
细胞因子(cytokines) 细胞因子(cytokines)主要介导和调节 免疫应答和炎症反应, 免疫应答和炎症反应,因此对大部分免 疫细胞,如单核细胞、巨噬细胞、 疫细胞,如单核细胞、巨噬细胞、T细胞 和B细胞等均有刺激作用。 细胞等均有刺激作用。 细胞因子治疗可以使某些没有免疫原性 的肿瘤产生免疫原性, 的肿瘤产生免疫原性,激活保护性免疫 反应。 反应。 然而由于这种免疫反应是非特异的, 然而由于这种免疫反应是非特异的,常 非特异的 产生全身毒性,导致严重的毒副作用。 产生全身毒性,导致严重的毒副作用。

Deng等(2003)将抗HER2-scFv、 IgG1的Fc段和 Deng等(2003)将抗HER2-scFv、人IgG1的Fc段和 将抗HER2 IL- 基因片段连接,并在CHO细胞中成功表达。 CHO细胞中成功表达 IL-2基因片段连接,并在CHO细胞中成功表达。 该融合蛋白能与肿瘤细胞表面HER2胞外区特 胞外区特 该融合蛋白能与肿瘤细胞表面 异性结合介导ADCC作用,具有 作用, 异性结合介导 作用 具有IL-2的生物学 的生物学 活性,增强抗肿瘤效应。 活性,增强抗肿瘤效应。 有研究者构建的融合蛋白有2个抗原结合位点, 有研究者构建的融合蛋白有 个抗原结合位点, 个抗原结合位点 一个可与肿瘤细胞HER2胞外区特异性结合, 胞外区特异性结合, 一个可与肿瘤细胞 胞外区特异性结合 另一个可与NK细胞、吞噬细胞、中性粒细胞 细胞、 另一个可与 细胞 吞噬细胞、 表面的CD16(FcγRⅢ)特异性结合。 表面的 Ⅲ 特异性结合。 特异性结合

研究者将抗卵巢癌单链抗体183B2scFv与 研究者将抗卵巢癌单链抗体183B2scFv与 183B2scFv 细胞因子IL IL细胞因子IL-2构建成抗卵巢癌单链免疫细 胞因子IL 2/183B2scFv,并在CHO ILCHO细胞内 胞因子IL-2/183B2scFv,并在CHO细胞内 表达出可溶性融合蛋白。 表达出可溶性融合蛋白。

四、抗体的应用
抗体在生物医药方面有着广泛的应用,在 抗体在生物医药方面有着广泛的应用, 疾病的诊断、疾病的治疗、 疾病的诊断、疾病的治疗、器官移植等方 面发挥着越来越重要的作用。 面发挥着越来越重要的作用。

(一)疾病的诊断
抗体的放射免疫显影
抗体经过适宜的放射性核素标记, 抗体经过适宜的放射性核素标记,静脉 或者腹腔、腰椎穿刺等方式进入体内后, 或者腹腔、腰椎穿刺等方式进入体内后, 特异的作用于靶组织细胞上的抗原, 特异的作用于靶组织细胞上的抗原,可 以显示出特异的抗原分子及细胞组织的 机能状态。 机能状态。

(一)疾病的诊断
1.肿瘤显像中的应用 2.心血管系统疾病中的应用 3.炎症显像中的应用

肿瘤显像中的应用
结肠-直肠癌或卵巢癌显像( 结肠 直肠癌或卵巢癌显像(99mTc标记的 直肠癌或卵巢癌显像 标记的 IMMU-4) ) 小细胞肺癌显像(NR-LU-10) 小细胞肺癌显像(NR-LU-10) 肝癌单克隆抗体( 标记的 标记的HAb18Fab) 肝癌单克隆抗体 131I标记的 )

心血管系统疾病中的应用
99mTc标记的抗平滑肌及球蛋白单抗 标记的抗平滑肌及球蛋白单抗

(SM-MAb)注入主动脉断裂小鼠体内, )注入主动脉断裂小鼠体内, 显像结果显示放射性活性在断裂处明显 增加。 增加。

炎症显像中的应用
99mTc标记的抗 标记的抗CD15IgM的单克隆抗体对 标记的抗 的单克隆抗体对

阑尾炎的显像。 阑尾炎的显像。 的显像 时间短,显像质量高,诊断快. 时间短,显像质量高,诊断快.

(二)疾病的治疗
1.基于抗体的放射免疫治疗 .
放射免疫治疗(radio immune therapy, therapy, 放射免疫治疗( RIT) 利用特异性抗体作为运载工具, RIT)指利用特异性抗体作为运载工具, 偶联上发射β 粒子的放射性核素, 偶联上发射β或α粒子的放射性核素,将 射线定向引导到肿瘤部位, 射线定向引导到肿瘤部位,对瘤体进行内 照射治疗。 照射治疗。

2.抗体药物 .
(1)肿瘤相关抗体药物 ) (2)心血管疾病相关的抗体药物 ) (3)抗病毒抗体药物 )

(1)肿瘤相关抗体药物 ) 抗肿瘤单抗药物一般可分为两类: 抗肿瘤单抗药物一般可分为两类: 两类 一类是纯粹的单克隆抗体 单克隆抗体, 一类是纯粹的单克隆抗体,它们通过封闭与 肿瘤细胞生长代谢相关的细胞因子、 肿瘤细胞生长代谢相关的细胞因子、信号通 路或通过抗体介导免疫系统杀伤肿瘤细胞, 路或通过抗体介导免疫系统杀伤肿瘤细胞, 从而起到抗肿瘤作用。 从而起到抗肿瘤作用。 另一类是单抗与抗肿瘤药物的免疫偶联物, 另一类是单抗与抗肿瘤药物的免疫偶联物, 单抗与抗肿瘤药物的免疫偶联物 是抗肿瘤药物的主要研究方向。 是抗肿瘤药物的主要研究方向。

已被美国FDA批准上市的肿瘤治疗性抗体 批准上市的肿瘤治疗性抗体 已被美国
药品名称 Rituximab(Rituxan) 利妥昔单抗 Trastuzumab 曲妥珠单抗 Gemtuzumab ozogamicin 吉妥珠单抗 Alemtuzumab 阿来珠
90Y-Ibritumomab

商品名称 Mabthera 美罗华 Herceptin 赫赛汀 Mylotary 奥唑米星 Campath Zevalin Bexxar Erbitux 爱必妥 Avastin 阿瓦斯汀

药物种类
131I-嵌合抗体

适应症 滤泡性非霍奇金淋巴瘤 乳腺癌

上市时间 1997 1998

人源化单抗

人源化单抗人源化单抗-卡奇 霉素

急性髓系白血病

2000

人源化单抗
90Y-鼠单抗

慢性淋巴细胞白血病 非霍奇金淋巴瘤 非霍奇金淋巴瘤 结直肠癌 转移性结直肠癌

2001 2002 2003 2004 2004

Tiuxetan Tositumomab 托西莫单抗 Cetuximab 西妥昔单抗 Bevacizumab 贝伐单抗
131I-鼠单抗

嵌合抗体 人源化单抗

(2)心血管疾病相关的抗体药物 ) 以阿昔单抗(abcixiab) 以阿昔单抗(abcixiab)为代表的单克 隆抗体药物, 隆抗体药物,在多种心血管疾病的治疗 上取得了显著疗效。 上取得了显著疗效。 7E3(商品名为ReoPro abcixiab) 7E3(商品名为ReoPro abcixiab)是抗 GPIIb-IIIa的单克隆抗体 7E3只要阻断 的单克隆抗体。 GPIIb-IIIa的单克隆抗体。7E3只要阻断 80%的GPIIb-IIIa位点 位点, 约80%的GPIIb-IIIa位点,就能完全抑制 血小板的聚集反应 的聚集反应。 血小板的聚集反应。

(3)抗病毒抗体药物 ) 2002年底至2003年严重急性呼吸综合症(SARS) 2002年底至2003年严重急性呼吸综合症(SARS) 年底至2003年严重急性呼吸综合症 的全球性暴发造成了约8000人感染,774人死 8000人感染 的全球性暴发造成了约8000人感染,774人死 引起SARS的病原体,SARS冠状病毒 SARS的病原体 亡。引起SARS的病原体,SARS冠状病毒 (SARS-CoV)是一种新型冠状病毒,人群基本 SARS-CoV)是一种新型冠状病毒, 上无免疫力。 上无免疫力。 SARS-CoV抗体工程的研究, SARS-CoV抗体工程的研究,是探索病毒的检 抗体工程的研究 病毒在人体中的分布、 测、病毒在人体中的分布、疾病的预防及治 疗的基础。 疗的基础。

SARS病毒的电镜图片 SARS病毒的电镜图片

Vero E6 Cell CPE

Genome structure of SARS-CoV
5 Kb 10 Kb 15 Kb 20 Kb 25 Kb 30 Kb

1b

S

E Orf7 N Orf3 M Orf8

s2m

1a 非结构蛋白nsp14 非结构蛋白nsp14

N: 与病毒RNA结合形成核衣壳 诱导细胞免疫 与病毒 结合形成核衣壳,诱导细胞免疫 结合形成核衣壳 M:决定病毒出芽位点 诱导 决定病毒出芽位点,诱导 决定病毒出芽位点 诱导Alfa干扰素的生成 干扰素的生成 E:病毒颗粒的装配 可能与诱导宿主细胞调亡有关 病毒颗粒的装配,可能与诱导宿主细胞调亡有关 病毒颗粒的装配 S:诱导病毒包膜与宿主细胞膜的融合 诱导病毒包膜与宿主细胞膜的融合

(三)抗体在其他方面的应用
1.在器官移植方面的应用 .

抗体在器官移植方面的主要研究成果
抗体(靶点) 抗体(靶点) 动物模型 作用 延长移植心脏存活时间 抗排斥作用 降低排斥反应 延长移植物存活时间 预防急性排斥反应 延长存活时间 延长移植心脏存活时间 抑制排斥反应 诱导受体产生免疫耐受 IL-12抗体(IL-12) 小鼠, IL-12抗体(IL-12) 小鼠,心脏 抗体 移植 抗IL-2受体mAb IL- 受体mAb CD25) (CD25) 大鼠, 大鼠,心脏 移植

小鼠, CD8 mAb/CD40L mAb 小鼠,心脏 联合应用 移植 mAb(CD45) CD45 mAb(CD45) CD45 mAb CD45) (CD45)

mAb(CD40L) 大鼠, CD40L mAb(CD40L) 大鼠,小肠 移植

2.在免疫戒毒疗法中的应用 .
该方法是将滥用药物如可卡因作半抗原免疫 动物,诱导机体产生针对滥用药物的抗体, 动物,诱导机体产生针对滥用药物的抗体, 在外周血中中和药物, 在外周血中中和药物,减少或阻断滥用药物 通过血脑屏障进入中枢神经系统, 通过血脑屏障进入中枢神经系统,间隔一段 时间加强免疫, 时间加强免疫,可保证机体体液中保持高滴 度的抗体,从而中和吸入的毒品, 度的抗体,从而中和吸入的毒品,阻断其进 入大脑,使吸毒患者无法产生欣快感, 入大脑,使吸毒患者无法产生欣快感,从而 达到防止复吸的目的( 达到防止复吸的目的(Bunce CJ et al 2003)。 2003)。

第二节 酶的蛋白质工程
酶的蛋白质工程是指根据蛋白质的 酶的蛋白质工程是指根据蛋白质的 结构规律及其与功能的关系, 结构规律及其与功能的关系,对蛋 白质进行改造, 白质进行改造,以生产出性能更加 优良、 优良、更能满足人类社会需要的新 型酶分子。 型酶分子。

一、枯草杆菌蛋白酶

枯草杆菌蛋白酶催化蛋白质水解为氨基酸, 枯草杆菌蛋白酶催化蛋白质水解为氨基酸, 在有机溶剂中也能催化多肽的合成, 在有机溶剂中也能催化多肽的合成,因此该 酶具有重要的应用价值, 酶具有重要的应用价值,被广泛应用于洗涤 制革及丝绸工业。 剂、制革及丝绸工业。

(一)结构及生物学特性
枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin, 枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin,EC 3.4.21.62) 是由枯草芽孢杆菌属细菌( 是由枯草芽孢杆菌属细菌(Bacillus subtilis)所分泌的胞外碱性蛋白酶,属丝 所分泌的胞外碱性蛋白酶, 氨酸蛋白水解酶类。 氨酸蛋白水解酶类。枯草杆菌蛋白酶依其来 源不同分为Carlsberg BPN? Carlsberg、 BL、YaB等 源不同分为Carlsberg、BPN?、E、BL、YaB等 多种。 多种。对于枯草杆菌蛋白酶结构与功能的研 究已有较长的历史, 究已有较长的历史,其三维结构都基本研究 清楚。大部分枯草杆菌蛋白酶是由270 270多个氨 清楚。大部分枯草杆菌蛋白酶是由270多个氨 基酸残基组成。 基酸残基组成。

(二)蛋白质工程改造
1.增强抗氧化性 .
His 64 Met 221

Ser 221

Asp 32

野生型与单点突变枯草杆菌蛋白酶比活的比较* 野生型与单点突变枯草杆菌蛋白酶比活的比较
222位氨基酸 222位氨基酸 Cys Met(野生型) Met(野生型) Ala Ser Gly Thr Asn Pro Leu Val 对于野生型的相对比活% 对于野生型的相对比活% 138.0 100.0 53.0 35.0 30.0 28.0 15.0 13.0 12.0 9.3 222位氨基酸 222位氨基酸 Gln Phe Trp Asp Tyr His Glu Ile Arg Lys 对于野生型的相对比活% 对于野生型的相对比活% 7.2 4.9 4.8 4.1 4.0 4.0 3.6 2.2 0.5 0.3

2.改变底物特异性 . 3.提高酶的热稳定性 . 4.改良酶的pH活性范围 .改良酶的 活性范围 5.提高酶在有机相中的反应效率 .

二、木糖异构酶
木糖异构酶( Isomerase, 木糖异构酶(D-Xylose Isomerase,EC 5.3.1.5)又称葡萄糖异构酶( 5.3.1.5)又称葡萄糖异构酶(Glucose Isomerase,GI) Isomerase,GI),是工业上大规模制备高 果糖浆的关键酶,也是国际上公认的研究酶 催化机制及建立蛋白质工程技术最好的模型 之一。

(一)结构及特性
木糖异构酶分子是一个四聚体, 木糖异构酶分子是一个四聚体,由四个 相同的分子质量为45 kDa的亚基形成两个二 相同的分子质量为45 kDa的亚基形成两个二 聚体。 聚体。亚基的结构单体间的交接面的大小是 二聚体间的交接面的三倍, 二聚体间的交接面的三倍,因此两个二聚体 间的作用相对欠稳定。 间的作用相对欠稳定。该酶的稳定性及活性 受金属离子影响, 受金属离子影响,Mg2+、Co2+及Mn2+对该酶有 激活作用, 起抑制作用。 激活作用,而Ca2+、Hg2+及Cu2+起抑制作用。

(二)蛋白质工程改造
耐热性的改进 底物亲和性的改善 最适反应温度的改变 酶活及最适pH的改变 酶活及最适pH的改变 pH

1.耐热性的改进 耐热性的改进
(1)定点突变 Gly及表面疏水性氨基酸置换 (2)Gly及表面疏水性氨基酸置换 (3)二聚体交接面的改造
73

70 74 40 13
Lys253 Lys294

Streptomyces olivaceoviridis 木糖异构酶定点突变位置图 (http://swissmodel.expasy.org)

木糖异构酶二聚体交接面赖氨酸位置 (http://swissmodel.expasy.org)

2.底物亲和性的改善 .
C. thermosul furogenes木糖异构酶 木糖异构酶Trp139/Val186点突变 木糖异构酶 点突变 对底物亲和性的影响* 对底物亲和性的影响
变异体 野生型 Trp139Tyr Trp139Phe Val186Thr Val186Ser Trp139Phe/Val186Thr Trp139Phe/ Val186Ser Kcat/Km(min-1nL/mol) 葡 萄 糖 5.8 6.0 1.5 9.7 5.7 32.9 12.4 木 糖 97.2 3.2 13.6 55.4 15.9 21.6 4.0

3.最适反应温度的改变 . 将两个氨基酸残基Pro137和Asp247突变成Gly, 将两个氨基酸残基Pro137和Asp247突变成Gly, Pro137 突变成Gly 获得了三个突变体P137G D247G及P137G和 P137G、 获得了三个突变体P137G、D247G及P137G和 D247G的双突变体 并构建表达载体, 的双突变体, D247G的双突变体,并构建表达载体,转化酿 酒酵母H158 酶活性分析显示, H158。 酒酵母H158。酶活性分析显示,三个突变体在 中温条件下的酶活性均有所提高,特别是30℃ 酶活性均有所提高 中温条件下的酶活性均有所提高,特别是30℃ 的酶活提高了1倍; 的酶活提高了1 酶的最适pH范围有很大的拓展 pH范围有很大的拓展, pH6.0酶的最适pH范围有很大的拓展,在pH6.0-9.0 之间都能表现出很高的酶活性。 之间都能表现出很高的酶活性。

4.酶活及最适pH的改变 .酶活及最适 的改变

如锈赤链霉菌的D56N和E221A突变体, 如锈赤链霉菌的D56N和E221A突变体,当 D56N 突变体 pH从8.5-8.8降至6-7.5时酶活性提高40% 降至6 时酶活性提高40 pH从8.5-8.8降至 7.5时酶活性提高40%

三、植酸酶
植酸酶(Phytase,EC.3.1.3.8) 植酸酶(Phytase,EC.3.1.3.8)是催 化植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸( 化植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸(或磷 酸盐)的一类酶的总称。 酸盐)的一类酶的总称。植酸酶制剂对于 提高植物性饲料中磷的利用率, 提高植物性饲料中磷的利用率,减轻畜禽 高磷排泄物对环境的污染以及饲料中矿物 质的吸收利用具有重要作用。 质的吸收利用具有重要作用。

(一)特性
推广应用中存在热稳定性差的问题 熔点在56-63℃之间 熔点在56-63℃之间 56 加工饲料的制粒过程需要一个短暂的高 温过程,温度一般在75 75温过程,温度一般在75-93℃ 饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶 活性

(二)蛋白质工程改造
1.提高热稳定性

2.改良最适pH 2.改良最适pH 改良最适 3.提高比活性 3.提高比活性 4.其他方面 4.其他方面

提高热稳定性
(1)定点突变 )
141

(2)一致性技术的应用 ) (3)二级结构的改造 ) (4)酶结构的延伸 )
282 277 272

23

Aspergillus fumigatus1植酸酶定点突变位置示意图 植酸酶定点突变位置示意图 (http://swissmodel.expasy.org)

四、溶菌酶
(一)结构及特性
Lysozyme, 溶菌酶(Lysozyme,EC
129

3.2.1.17) 3.2.1.17)又
15 100

24

称胞壁质酶(Muramidase),是糖苷水 称胞壁质酶(Muramidase),是糖苷水 ), 解酶,作用于N 乙酰氨基葡萄糖(NAG) 解酶,作用于N-乙酰氨基葡萄糖(NAG) 及N-乙酰胞壁酸(NAM)之间的β-1,4 乙酰胞壁酸(NAM)之间的β 糖苷键, 糖苷键,能使某些细菌细胞壁中的黏多 糖成分水解,因而具有溶菌能力。 糖成分水解,因而具有溶菌能力。鸡卵 清溶菌酶是由129 129个氨基酸残基排列构成 清溶菌酶是由129个氨基酸残基排列构成 的单一肽链,有四对二硫键, 的单一肽链,有四对二硫键,分子量为 kDa。 14.4 kDa。

91

55 1

41

52

45

溶菌酶活性中心示意图 (http://swissmodel.expasy.org)

(二)蛋白质工程改造
1.抗菌范围的扩大 2.热稳定性的提高
(1)加强疏水中心 (2)引进糖链

溶菌酶 的三级结构

五、其他酶
1. 扩展青霉碱性脂肪酶 2.戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶 戊二酰3.乙酰胆碱酯酶

第三节 抗体酶
抗体酶(abzyme)又称催化性抗体 抗体酶(abzyme)又称催化性抗体 antibody), ),是一类具有 (catalytic antibody),是一类具有 催化功能的抗体分子, 催化功能的抗体分子,在其可变区赋予 了酶的属性,它既具有抗体的高度选择 了酶的属性, 又具有酶的高效催化效率。 性,又具有酶的高效催化效率。

一、抗体酶的作用机理
抗体酶和所有的抗体一样, 抗体酶和所有的抗体一样,都是由两条 轻链和两条重链构成, 轻链和两条重链构成,抗原与轻链和重 链的可变区特异性结合, 链的可变区特异性结合,因此可变区的 氨基酸排列顺序决定了抗体分子的特异 性。

1.酰基转移反应 .
氨基酸在掺入肽链之前必须进行活化以 获得额外的能量, 获得额外的能量,这一活化过程即是酰 基转移反应。 基转移反应。

2.重排反应 .
Claisen重排是有机化合物异构化的一种 Claisen重排是有机化合物异构化的一种 重要形式, 重要形式,生物体内一些化合物在光照 下会发生Claisen重排。 Claisen重排 下会发生Claisen重排。

3.光诱导反应 .
光诱导反应包括光聚合反应和光裂解反应。 光诱导反应包括光聚合反应和光裂解反应。 这两类反应在植物体内是非常重要的。DNA的 这两类反应在植物体内是非常重要的。DNA的 修复也涉及到光诱导反应。 修复也涉及到光诱导反应。

4.水解反应 .
抗体酶主要催化生物体内两类水解反应, 抗体酶主要催化生物体内两类水解反应,即 酰胺水解和酯水解。对蛋白质而言, 酰胺水解和酯水解。对蛋白质而言,蛋白质 的水解都属于酰胺水解。 的水解都属于酰胺水解。 磷酸酯键是自然界最稳定的化学键之一, 磷酸酯键是自然界最稳定的化学键之一,其 是自然界最稳定的化学键之一 水解是对抗体酶的挑战。Janda等利用稳定 水解是对抗体酶的挑战。Janda等利用稳定 的五配位氧代铼络合物A模拟RNA RNA水解时形成 的五配位氧代铼络合物A模拟RNA水解时形成 的环形氧代正膦中间物, 的环形氧代正膦中间物,产生了一种单抗 G12,可以催化水解磷酸二酯键。 G12,可以催化水解磷酸二酯键。

5.氧化还原反应 .
Shokat制得了对氧化态黄素 Shokat制得了对氧化态黄素Km=8mmol/L, 的抗体, 对还原态Km=300 nmol/L的抗体,使标准 电位差变为mV,由此, 电位差变为-342 mV,由此,黄素还原态 的还原范围相应扩大, 的还原范围相应扩大,一些原来无法按 其还原的物质( 其还原的物质(即标准还原电位差大于 抗体酶催化的黄素标准还原电位差) 抗体酶催化的黄素标准还原电位差)得 以还原。 以还原。因此抗体酶可以使热力学上原 来无法进行的氧还反应得以进行。 来无法进行的氧还反应得以进行。

6.金属螯合反应 .
金属螯合反应对于辅酶、 金属螯合反应对于辅酶、辅因子和酶的 结合具有重要的意义。 结合具有重要的意义。

二、抗体酶的制备
抗体酶的设计和制备方法主要有: 抗体酶的设计和制备方法主要有: 诱导法 拷贝法 引入法 化学修饰法 基因工程法

(一)诱导法
1.诱导和转换设计

2.反应免疫法

诱导法制备抗体酶
载体蛋白
b

b b
b

a a 过渡态类似物 免疫 单克隆化

抗体酶

(二)拷贝法
单克隆化



第一次免疫

第二次免疫

抗体酶

(三)引入法
引入法就是借助基因工程和蛋白质工程方法将催 引入法就是借助基因工程和蛋白质工程方法将催 化基因引入到已有底物结合能力的抗体的抗原结 化基因引入到已有底物结合能力的抗体的抗原结 合位点上。 合位点上。 具体来说,可以采用寡核苷酸定点诱变技术将特 具体来说, 定的氨基酸残基引入抗原结合部位使其获得催化 功能, 功能,也可以采用选择性化学修饰的方法将人工 合成的或天然存在的催化基因引入到抗原结合部 位。

(四)化学修饰法
将人工合成的或天然存在的催化基团引 入到抗体的抗原结合部位来获得抗体酶 的方法就是化学修饰法 化学修饰法。 的方法就是化学修饰法。 亲和标记也是一种有效方法 亲和标记也是一种有效方法 。

(五)抗体库法
抗体库法即用基因克隆技术将全套抗体 抗体库法即用基因克隆技术将全套抗体 重链和轻链可变区克隆出来, 重链和轻链可变区克隆出来,重组到原 核表达载体, 核表达载体,通过大肠杆菌直接表达有 功能的抗体分子片断, 功能的抗体分子片断,从中筛选特异性 的可变区基因。 的可变区基因。

(六)抗独特型抗体酶
根据Jerne提出的免疫网络学说, 根据Jerne提出的免疫网络学说,抗体可变 Jerne提出的免疫网络学说 区不仅显示出抗体活性 抗体活性, 区不仅显示出抗体活性,而且由于有独特型 的抗原决定簇,又显示出抗原活性 抗原活性。 的抗原决定簇,又显示出抗原活性。 优点是可直接利用酶诱导机体产生抗体,进 优点是可直接利用酶诱导机体产生抗体, 是可直接利用酶诱导机体产生抗体 而产生与酶具有相同活性部位的抗独特型抗 体。

三、抗体酶的应用
(一)理论研究中的应用 (二)有机合成中关键反应的催化 (三)手性药物合成及拆分 (四)在前药设计中的应用 (五)临床治疗中的应用

分枝酸通过椅式构象的过渡态重排成预苯酸 罗贵民,酶工程,2003) (罗贵民,酶工程,2003)

分枝酸

预苯酸

过渡态类似物

临床治疗中的应用
1.治疗可卡因成瘾 . 2.治疗甲状腺疾病 . 3.治疗艾滋(HIV )病 .治疗艾滋 病 4.其他方面的应用 .


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