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发酵过程优化与控(第四章、赖氨酸发酵过程优化)


第三章 赖氨酸发酵过程优化 第一节、赖氨酸发酵概述 赖氨酸是一种碱性氨基酸,是仅次于谷氨酸的第二大氨基 酸产品,是谷物蛋白的第一限制性氨基酸,在谷物食料中添加 适量的赖氨酸,其蛋白质的生物价大大提高。

赖氨酸的应用范围很广。①作为食品强化剂;②作为药物
可用作肝细胞再生剂,对改善肝功能,治疗肝硬化、高氨症, 增进食欲、改善营养状况有明显的疗效;③作为饲料添加剂,

在畜、禽类的饲料中添加少许的赖氨酸,对家禽、家畜的日增
重、料肉比、家禽的产卵量等方面效果尤为显著。

一、发酵法生产赖氨酸技术的发展 1、赖氨酸的生产方法 水解法(已淘汰)、合成法、酶法和直接发酵法。 合成法:以己内酰胺、二氢吡喃、环己酮、呱啶为原料合 成L-赖氨酸已有报道,但还没有大规模的生产报道,主要是合

成法制成的中间体DL-赖氨酸进一步的分离工艺很复杂。
酶法(3种):①合成ε-苯甲酰-α-乙酰-DL-赖氨酸,采用消 旋酶处理制成ε-苯甲酰-L-赖氨酸,经酸水解得产品;②合成

DL-4-氨基丁基乙内酰脲,采用微生物酶使其转变为L-赖氨酸;
③由环己烯合成DL-氨基己内酰胺,采用水解酶和消旋酶共同 作用使其变成L-赖氨酸。

第三种工艺已用于赖氨酸工业化生产。该法发明者富村隆

最初找到了可水解L-氨基己内酰胺的罗伦隐球酵母,然后发现
了具有DL-氨基己内酰胺消旋酶活性的无色杆菌,通过这两种 细菌的共同作用, DL-氨基己内酰胺被转化为L-赖氨酸,且得

率高。
发酵法:原料来源广泛,且生产的赖氨酸均为L-型,在赖 氨酸的生产中占据了主导地位。生产赖氨酸的主要厂家见表4-1,

其中90%以上的企业采用发酵法生产。
2、发酵法生产赖氨酸 微生物的赖氨酸合成途径在1950年以后逐渐被阐明。

对结肠芽孢杆菌、黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌的赖氨酸

合成途径解析后发现:赖氨酸的合成与其它氨基酸不同,存在
两条途径即:二氨基二酸途径和α-氨基乙二酸途径,前者存在 于细菌、绿藻、原生质、高等植物中,后者存在于酵母菌、霉

菌中。
1957年,日本开始采用野生菌株发酵生产谷氨酸,1960年 用谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型变异株生产赖氨酸。 20世纪60年代中期,我国开始赖氨酸发酵菌株和工艺条件 研究。1974年中科院微生物所诱变北京棒杆菌AS 1.229得到营 养缺陷型变异株AS 1.563,产酸17.9g/L,进一步诱变得到AECr 变异株,产酸50g/L。

70年代后期,上海、黑龙江、广西和江苏等地积极开
展赖氨酸菌种筛选工作。如上海天厨味精厂得到AECr和 高丝氨酸缺陷双突变株,产酸36~37g/L;中科院微生物所

和常州味精厂合作筛选得到产酸48~53g/L的钝齿棒杆菌,
通过发酵中试技术鉴定。上海工业微生物研究所从黄色短 杆菌2030出发经诱变筛选得到抗性和营养缺陷型双突变株, 其中的FH-128菌株在16L小罐发酵70h产酸130g/L以上, 5m3罐中试发酵65~69h,产酸92.2~95g/L,转化率为 40.2%左右,达到国际先进水平,但至今未有工业化报道。

广西南宁赖氨酸厂于80年代投产后,与广西生物化工
研究所协作一直进行赖氨酸生产菌改良和发酵工艺改进, 得到分别以糖蜜和淀粉糖为原料的高产菌株,以淀粉糖为

原料30L罐发酵产酸120~130g/L左右,该厂还获得了可耐高
温生产菌,37℃下发酵,赖氨酸产量基本不受影响。 江南大学20世纪80年代从谷氨酸产酸菌AS 1.495诱变 赖氨酸产酸菌F11-519,产酸57.4g/L。再经原生质体融合和 化学、物理诱变等手段得到多重变异株FB21,摇瓶产酸 70g/L,为当时的国内领先水平,但未进行发酵中试和工业 化。

综上所述,国内赖氨酸研究起步较早,但高产菌实现工业
化比例低;另外,研究多局限于菌种改良和优化发酵的环境条 件,对各种培养条件下的优化控制研究不多,或与实际生产脱 节。 3、我国赖氨酸发酵工业现状 20世纪80年代初,国内开始进行赖氨酸发酵中试,并兴建 赖氨酸发酵厂,特点是产酸水平和转化率低、规模小。“七五” 期间,国家在广西南宁、福建泉州、湖北武汉及吉林九站建了4

套年产1kt赖氨酸生产装臵。后两家已经改产或停产,福建泉州
赖氨酸厂1989年与正大集团合资后改名为“泉州大泉赖氨酸有 限公司”,生产能力5kt/a左右,使用国外菌种和技术。广西南

宁赖氨酸厂具有6kt/a生产能力。此外,还有四川川化味之素公
司具有6kt/a生产能力,使用日本菌种和技术。

以上三家企业为我国最主要的赖氨酸生产厂家,其总生产 能力也不过略高于1.5万t/a,而仅美国ADM公司年产赖氨酸就达 12万t/a。广西南宁赖氨酸厂是唯一拥有自己的菌种和技术的国 内赖氨酸生产企业,该厂主要以糖蜜为原料,产酸达到80g/L以 上,对糖转化率38%左右,在国内属先进水平。但跟日本等国 的赖氨酸生产水平(日本味之素公司发酵法生产赖氨酸盐酸盐 浓度为120g/L,转化率可达50%)相比有很大差距。 二、赖氨酸发酵研究的目的和主要内容 赖氨酸在我国具有广阔的市场,我国赖氨酸生产技术虽然 取得了长足的进步,但与国外先进水平相比(如产酸水平、糖 酸转化率、提取率、生产规模、电耗、生产成本比值)都存在 差距。

发酵水平的高低是工厂的命脉,提高发酵水平有两条途 径:一是筛选出优良的菌株;二是得出与目的菌株相匹配的 最佳培养条件、控制手段,只有两者紧密结合才能最终实现 发酵的高水平。后者正在占据着越来越重要的地位。例如, 味之素公司研究人员曾报道,乳糖发酵短杆菌变异株AJ11204 在摇瓶条件下48h产赖氨酸为4.3%,但在小型发酵罐中,通 过控制培养条件,48h产酸水平可提高到7%,类似的结果在 其它发酵产品的研究中也时有报道。 我国学者对赖氨酸的研究长期以来都把工作重点放在高 产菌株的选育上,有关如何对发酵过程进行优化与控制的研 究较少。

实际生产需要的一些培养条件、技术指标往往在摇瓶条 件下获得,这种低水平的研究方法客观上制约了菌种潜力的 充分发挥,不仅如此,由于在摇瓶条件下无法对目的微生物 生理生化特性、营养供给及操作、发酵设备三者之间建立起 有机的联系,当反应器规模发生变化时发酵结果常常不能重 复。这是导致生产规模扩大而发酵水平降低的根本原因。 实现发酵过程最优化,使菌种的潜力充分发挥是发酵技 术的最高境界。鉴于国内赖氨酸高产菌株多集中于黄色短杆 菌,以此为研究菌株,陈坚等以实现流加发酵最优化为研究 目的,在小型反应器上对黄色短杆菌发酵生产赖氨酸的过程 进行了定量的解析。具体包括以下内容:

①在所提供的出发株基础上,通过常规诱变获得一株赖 氨酸产生菌FB42,在摇瓶条件下对可能影响代谢的环境因子 进行了考察,对发酵条件进行了优化; ②以连续培养作为研究手段,考察了微生物的菌体生长、 产物形成及基质消耗特性。通过代谢途径进行定量的质、能 衡算,得出了赖氨酸的理论转化率。进一步比较理论转化率 和FB42真实转化率之间的差异,对FB42的代谢流进行分析, 据此得出对工艺研究有指导的一些理论依据; ③在小型反应器中对影响赖氨酸形成的一些重要环境因 子进行定量的考察,找出目的微生物的生理生化特性、营养 源供给与反应器特性之间的内在联系,得出最适的操作条件。 在此基础上进一步对发酵过程的动力学进行研究,建立起合 理的动力学模型,为流加发酵的最优化研究打下基础;

④在动力学研究的基础上对发酵进行最优化操作。包括 状态方程的建立、目标泛函的确定、最优化流加方式的求解。 并通过实验对最优化操作进行检验,达到理论和实践的统一。 第二节、赖氨酸生产菌FB42的获得 一、出发菌株FB21的遗传特性:P81 二、FB31菌株摇瓶发酵性能的初步研究 FB31是由FB21(主要遗传标记为Leu-Thr- AECrAHVr ) 的保藏斜面中接出,经复壮、分离、纯化后获得。其主要遗 传标记为Leu-、AECr、AHVr。 1、种龄的确定 适宜的种龄应是菌体处于对数生长期的中后期。因为处 于对数生长期的菌体接种有利于缩短发酵周期,对数生长期 末菌体浓度相对较高,更有利于保持高的接种量。

从图4-2的生长曲线上可看出,培养进行到17~19h时, FB31处于对数生长期末,所以选择种龄为17~19h。 2、接种量对发酵的影响 培养17~19h的新鲜种子按不同的接种量接入发酵培养基 中,根据表4-3的结果,接种量以5%为好。 但进一步的实验又表明接种量以8%为好(表4-4)。 导致上述结果的根本原因在于缺乏菌体浓度作为衡量标 准。接种量为5%时,菌体浓度较高(OD=0.18~0.2);接种量 为8%时,菌体浓度较低(OD=0.085)。 同样培养时间条件下引起菌体浓度出现差异的可能原因 包括:温差、斜面接种量波动或其它因素。

3、初糖浓度对发酵的影响 表4-5的结果表明:初糖浓度13%时发酵的转化率最高, 进一步提高初糖浓度对发酵不利,当初糖浓度为18%时, FB31几乎不产酸,说明菌株不具备耐高糖的特性。 4、发酵培养基的优化 在固定葡萄糖、磷酸氢二钾、七水合硫酸镁和碳酸钙用 量基础上,对玉米浆、豆饼水解液、硫酸铵等氮源物质通过 正交实验,得出发酵培养基的最适组成为(g/L): 葡萄糖130 玉米浆 30 豆饼水解液 10 硫酸铵 40 磷酸氢 二钾 1 七水合硫酸镁 0.5 碳酸钙 45 用该培养基发酵72h,产酸为42g/L,和FB21(70g/L) 相比产酸性能下降很多。结合遗传标记的改变、发酵产酸水 平和耐糖能力的降低,表明FB31发生了回复突变。

防止回复突变目前通常采用如下办法: ①选育遗传性能稳定的菌株。经诱变处理后,在易出 现回复突变的培养基中反复传代,选出不发生回复突变的 菌株; ②定向赋加生产菌的遗传标记。如选育双缺菌株,增 加抗回复突变性能;对于抗性株,尽量选育多重抗性突变 株; ③在保藏过程中除选择合理的保藏方法外,对于营养 缺陷型菌株要提供足够的营养物,抗性株可添加适量的抗 性物质; ④必须定期进行分离、纯化工作,保持其遗传性能的 稳定。

三、赖氨酸生产菌FB42的获得 1、黄色短杆菌产赖氨酸的合成途径与调控机制 黄色短杆菌产12种氨基酸的合成代谢途径如图4-3所示。
葡萄糖 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸 乙酰辅酶 草酰乙酸 TCA 天冬氨酸 天冬氨酸半醛 赖氨酸 丙氨酸 高丝氨酸 蛋氨酸 苏氨酸 α-酮戊二酸 缬氨酸 反馈阻遏 反馈抑制 谷氨酸 α-酮戊二酸 丙氨酸 亮氨酸

图4-3中,氨基酸的代谢途径有3条:①从葡萄糖经 丙酮酸到丙氨酸、缬氨酸;②从葡萄糖经草酰乙酸和α酮戊二酸到谷氨酸;③从葡萄糖经天门冬氨酸、天门冬 氨酸半醛到赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸。 第三条代谢途径即赖氨酸合成途径存在着严格的调 节机制,正常的细胞几乎不积累赖氨酸、苏氨酸和蛋氨 酸。该调节机制由下面几种调节作用共同完成: ① 、谷氨酸优先合成,谷氨酸合成过剩就会抑制谷 氨酸脱氢酶(GD)的活性,使得生物合成的代谢流转向 天门冬氨酸。 天门冬氨酸的过剩也会抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶的活性,使得天门冬氨酸不致大量积累。

②赖氨酸的前体物质天门冬氨酸与乙酰辅酶A的生成 形成平衡合成,乙酰辅酶A的增加能逆转天门冬氨酸对其 自身合成的反馈抑制。 ③天门冬氨酸激酶(AK)受赖氨酸与苏氨酸的协同 反馈。 AK是一个变构酶,催化天门冬氨酸和ATP形成α-天门 冬氨酸磷酸,有两个变构位臵可以接受末端产物。AK受 赖氨酸与苏氨酸的协同抑制,当只有赖氨酸或苏氨酸与变 构位臵结合时,酶活影响不大,当赖氨酸与苏氨酸同时结 合到两个变构位臵时,酶活受到强烈的抑制。此外,AK 是赖氨酸合成途径中唯一的反馈调节点。

赖氨酸分支途径的其它酶,如第一个专一性酶——二氢吡 啶二羧酸合成酶,末端产物如赖氨酸或其它氨基酸单独或组合 对该酶无抑制作用,且该酶也不受赖氨酸的反馈阻遏。 ④赖氨酸亮氨酸的生物合成之间存在着代谢互锁,赖氨酸 分支途径的初始酶二氢吡啶二羧酸合成酶为亮氨酸所阻遏。 ⑤蛋氨酸比苏氨酸优先合成,蛋氨酸合成的过剩就会阻遏 高丝氨酸-O-转乙酰酶,使得生物合成的代谢流转向苏氨酸。 苏氨酸比赖氨酸优先合成,苏氨酸的过剩会反馈抑制高丝氨酸 脱羧酶的活性,使得生物合成转向赖氨酸。 2、赖氨酸产生菌的育种策略 根据前面对赖氨酸合成途径及调节机制的分析,赖氨酸发 酵属于代谢控制发酵。

所谓代谢控制发酵是指微生物在正常代谢调控机制作用下, 不会积累人们所需要的目的产物,通过用人工诱变等方法有目 的地破坏其部分代谢调控机制,改变其固有的调节机制,使合 成产物的途径畅通无阻,最大限度地积累目的产物。 结合黄色短杆菌的赖氨酸合成途径和代谢调控机制,相应 的育种策略可归纳如下: ①切断代谢支路:选育和应用营养缺陷型菌株,切断丙氨 酸、苏氨酸和蛋氨酸的分支途径是积累赖氨酸的有效手段。 ②解除反馈抑制:选育抗结构类似物的突变株,可以得到 对AK反馈抑制脱敏的菌株,代谢调节被遗传性地解除,这是 赖氨酸发酵育种的重要手段。特别是选育营养缺陷型兼具结构 类似物抗性的突变株,极有希望获得高产菌株。表4-8列举了 一些曾用过的结构类似物,其中以AEC效果佳、应用广。

③增加前体的生物合成:关键酶AK的催化反应速度与底物 天门冬氨酸浓度的之间的关系呈S型,随着底物浓度的增加,AK 与天门冬氨酸的亲和协同性增大。根据变构酶的S型动力学特性, 为了提高赖氨酸的产量,应设法增加前体物质天门冬氨酸的浓度, 以抵消变构抑制剂的影响。因此可以考虑选育丙氨酸缺陷型,抗 天门冬氨酸结构类似物的突变株。 ④解除代谢互锁:赖氨酸与亮氨酸的生物合成之间存在代谢 互锁,因此可以考虑选育亮氨酸缺陷型,抗亮氨酸结构类似物的 突变株。 3、赖氨酸产生菌FB42的获得 在不含苏氨酸的选择性培养基上得到50株苏氨酸完全缺陷的 突变株,在抗性平板上得到200株LysHx抗性突变株,经初筛、 复筛后得到FB41和FB42。同出发株FB31相比,产酸分别提高 23%和19%。诱变谱系见图4-4。

4、FB42菌株对LysHx和AHV的抗性检验 FB42(Leu-Thr-AECrAHVrLysHxr)是在添加AHV和 LysHx的筛选平板上获得的,因此具有对AHV和LysHx的抗性, 在LysHx为4mg/L时,FB42的相对生长仍为80%,而此时 FB31几乎不生长;此外,FB42对AHV的抗性也有所增加。

5、FB41和FB42的传代实验
对FB41(Leu-Thr-AECrAHVr)和FB42进行反复传代, 测定其赖氨酸合成能力。结果(表4-9)表明: FB42遗传、发

酵性能稳定,是一株较好的赖氨酸产生菌,因此,进一步对
影响FB42产酸的环境因子和发酵条件进行了研究。

四、环境因子对FB42分泌赖氨酸的影响 1、苏氨酸和亮氨酸对产酸的影响 FB42为亮氨酸缺陷型和苏氨酸需求型,所以发酵过程中必 须添加苏氨酸和亮氨酸。 实验结果表明,当苏氨酸浓度>150mg/L时,就能满足菌体 生长的需求,且实验范围内未发现过高的苏氨酸浓度对菌体生 长有抑制作用。对产酸而言,苏氨酸浓度有一合适范围 (100~350mg/L之间),过高对FB42产赖氨酸有抑制作用。 FB42和FB21菌株相比:①菌体生长所需的赖氨酸浓度降低 了;②苏氨酸对产酸的抑制作用也有所减小。这是因为:①FB42 为苏氨酸需求型,其自身可合成少量的苏氨酸,因而比苏氨酸 缺陷型的FB21对苏氨酸的需求少;②FB42对结构类似物AHV的 抗性较FB21有所增加,故而苏氨酸对菌体赖氨酸合成的抑制作 用得到缓解。

亮氨酸对菌体生长和产酸的影响相似,即存在合适的生长 和产酸浓度(400~600mg/L),过高会抑制菌体生长和产酸。 2、生物素浓度对产酸的影响 对于赖氨酸发酵,抑制谷氨酸的分泌可以使得代谢流转向 赖氨酸的合成。谷氨酸是通过Glu-Asp运输系统向胞外运输的, 该运输系统受细胞膜通透性的影响,细胞膜的通透性则受生物 素影响;而赖氨酸的分泌与Glu-Asp运输系统无关,因此高生物 素浓度将抑制谷氨酸的分泌而应该有利于赖氨酸分泌。通过合 成培养基进行的发酵实验表明,生物素浓度必须大于150μg/L。 发酵中,添加3%的玉米浆即可满足要求。 3、金属离子对产酸的影响 许多金属离子都是微生物代谢途径上酶的激活剂或是辅助 因子。

考察Mg、K、Fe、Mn、Cu的结果表明:K+和Mg2+对产 酸有促进作用,合适的添加量为1g/L和0.5g/L(以K2HPO4和 MgSO4.7H2O计); Fe2+和Mn2+对产酸影响不大,而Cu2+对 产酸有抑制作用,尤其是当Cu2+大于20mg/L时,几乎不产赖 氨酸。

五、响应面分析法优化FB42菌株发酵培养基
响应面分析(RSA)方法是数学与统计学相结合的产物, 以回归方法作为函数估算的工具,将多因子实验中,因子与

实验结果的相互关系,用多项式近似,把因子与实验结果
(响应面)的关系函数化,依次对函数的面进行分析,研究 因子与响应面之间、因子与因子之间的相互关系,并进行优

化。
通过响应面分析法优化得到的培养基组成见P90。

第三节 连续培养中FB42菌株的动力学特性及其代谢流分析 连续培养过程中各种条件相对稳定,可以有目的、定量地 研究各种变量之间的相互关系,较为精确地求出一些发酵过程 的重要动力学参数。这些动力学参数不依赖于培养条件,通常 在分批发酵和流加发酵中很难得出。

就赖氨酸而言,由于缺乏发酵过程中一些重要的动力学参
数如基质消耗比速、产物形成比速、菌体生长比速及其它们之 间的相互关系,因此很难对发酵过程进行精确控制,不利于发

挥菌种的潜能。
菌种的潜能到底有多大,或菌种真实转化率等于多大是需 要确定的值,该值是发酵过程优化的目标。

此外,发酵过程的理论转化率也是一个重要的物理参数。
理论转化率和真实转化率是两个不同的概念。理论转化率代表 菌体最有效地利用外界物质和能量而产生的效果,是热力学意

义上的最大可能性,是一个确定的值;而真实转化率则具有菌
体的特异性,根据两者的差异可对菌株的代谢流进行分析,用 以指导生产和菌株的改造。 但是由于微生物代谢途径的复杂性,而且理论转化率往往 无法通过实验直接得出,因此有关赖氨酸理论转化率的报道众 说纷纭,为此,陈坚等以连续培养方法为研究手段,进行了更 加深入的研究。

一、连续培养中的操作特性 由于营养缺陷型菌株,特别是基因工程菌,在连续传代过

程中存在着自然回复突变和质粒脱落的现象,因此连续培养中 的稳态操作可分为两个过程:开始的一段亚稳态和回复突变后 达到的另一个最终稳态点,为了能真实反应菌体大量分泌赖氨 酸的生长、代谢特性,只讨论开始的一段亚稳态。 1、菌体浓度、产物浓度、基质浓度与稀释率的关系 如图4-14所示。总的来说,随着稀释率的增加,菌体浓度 呈下降的趋势,特别是当D>0.15h-1后菌体浓度下降很快。在 D< 0.15h-1时产物的浓度几乎保持不变,但当D>0.15h-1后, 随着菌体浓度的下降,产物浓度迅速下降。与D= 0.05h-1时相 比,D= 0.22h-1后时菌体浓度值下降了39%,产物浓度降低了 52%,可见过高的稀释率对产物的形成的负面影响更大。

在D< 0.11h-1时,限制性基质葡萄糖的浓度未检出。其可 能的原因是:在较低的稀释速率下,葡萄糖很快被转化为代谢

过程的中间产物,这时葡萄糖的限制作用可能由其代谢途径上
的某一中间产物表现出来。当D> 0.11h-1时,葡萄糖浓度开始 增加,当D= 0.22h-1时葡萄糖浓度急剧升高,此时菌体浓度、

产物浓度的下降也很快,说明该点已接近洗出点。
2、产物生成比速、基质消耗比速与稀释率的变化关系 如图4-15所示。产物生成比速(π)与稀释率之间存在着

一个函数关系。当D< 0.15h-1时,产物形成比速(π)随D增加
呈线性增加;当D=0.15h-1~0.18h-1时,产物形成比速虽然继续 增加,但趋势变得缓慢,产物形成比速的最大值出现在 D=0.18h-1附近,当D>0.18h-1后,产物形成比速呈下降趋势。

葡萄糖的消耗比速(σ)和产物形成比速有一对应关系。

在产物形成比速线性增加的区域内,葡萄糖的消耗比速也呈线
性增加,当产物形成比速呈下降趋势后,葡萄糖消耗比速增加 的幅度变慢。这是因为葡萄糖不但用作菌体的生长,还用于产

物的形成。
3、菌体和产物表观转化率与稀释率的变化关系 如图4-16所示。D=0.05~0.15h-1之间时,菌体的表观转化

率YX似有下降,当D进一步增大时,菌体的表观转化率略有提
高,但总的来说菌体的表观转化率随稀释率的变化不很明显。 产物表观转化率YP的变化和菌体表观转化率的变化呈相反 的趋势。D从0.05h-1增加到0.15h-1时产物的表观转化率略有提 高,D> 0.15h-1后产物的表观转化率大幅度下降。

造成产物转化率急剧下降的原因还不很清楚,但极有可能

是在很高的稀释率下,菌体浓度和产物浓度很小,发酵液中培
养基的利用不很充分,这样对产酸有抑制的物质如苏氨酸、亮 氨酸的浓度相对较高,影响到赖氨酸的大量分泌。

因此,对于产物的形成,稀释率有一个较适的值。过高的
稀释率对产物的形成尤为不利。 二、连续培养中赖氨酸发酵的动力学特性

1、菌体生长动力学
尽管Monod方程在应用时会遇到多个限制生长因素,或高 底物浓度抑制、或产物抑制、或多底物竞争、或多种微生物间 的竞争等许多问题,但在一般条件下,特别是产物抑制不明显 的连续培养中,Monod方程表现出广泛的适用性。

对于一个单级CSTR,有关菌体(不计死亡)的物料衡算

式为:
V(dx/dt)=Fx0-Fx+μxV 一般x0=0,所以式(4-2)整理得: (4-2)

dx/dt=(-F/V) x+μx=(μ-D)

(4-3)

在连续培养达到稳态时dx/dt=0,所以μ=D。 依Linrweaver-Burk方法对Monod方程取倒数,得:

1/ μ=(1/μmax)+(Ks/μmax).(1/s)

(4-4)

将实验数据做1/s~1/μ图,结果见图4-17,1/s与1/μ呈线性 关系。求得μmax=0.24h-1,Ks=0.88g/L。因此,FB42菌株在以 葡萄糖为基质的连续培养生长动力学为: μ=0.24s/(0.88+s) (4-5)

由于半饱和常数Ks为0.88g/L,表明葡萄糖浓度只在较低的 情况下才表现出限制菌体生长的作用,如果培养液中葡萄糖浓度 >10g/L时,葡萄糖对菌体生长的限制作用可以不考虑。 2、产物形成动力学 产物形成过程非常复杂,为了便于研究,一般都将产物形成

和菌体生长结合起来进行讨论,并将产物形成动力学建立成菌体
生长比速μ的函数。如图4-18所示。 从图4-18知道,π和μ的关系不是线性关系,用一个二次曲线

进行拟合,得到产物形成的动力学表达式为:
π= -0.0316+1.257μ-3.09μ2 (4-6) 从图4-18知道,当μ<0.16h-1时,π和μ几乎呈线性关系。

π= 0.57μ

(4-7)

从式(4-7)可以看出,在较低的稀释率下,产物的形成表

现为生长偶联。尽管普遍的观点均认为赖氨酸为Ⅱ类发酵,产
物的形成为生长部分偶联,但前面的研究结果表明,在某些特 定的条件下,赖氨酸的产物形成会表现出生长偶联型的特征。

三、FB42的真实转化率P94
假定碳源主要由葡萄糖提供,其它成分所提供的碳源和葡 萄糖相比可忽略不计。这样稳态操作中碳源的物料平衡式为:

D(Cg1-Cg0)=DCX/YX+DCP/YP+mCX
持不变,则式(4-8)可转化为如下的线性等式: 1/Y0=(1/YP)+CX/(CPYX )+mCX/(DCP) Y0为产物对葡萄糖的表观转化率。

(4-8)

若真实转化率YX、YP和维持消耗常数m在各稳态操作中保 (4-9)

由式(4-9)可知,在一个三维空间作1/Y0关于CX/CP与

CX/DCP的图(图4-19),能求出真实转化率与维持消耗常数
的值。事实上由于在D适中的条件下建立稳态时,m很小, 这一点从图4-19中可以直观地看出,所以式(4-9)可以近似

为:
1/Y0=1/YP+CX/(CPYX) (4-10) 将实验数据作如图4-20所示的1/Y0~ CX/CP图,可以看出 1/Y0与CX/CP呈很明显的线性关系,经回归可得: 1/Y0=1.466+1.771(CX/CP) 相关系数R=0.97 计算得到菌体和产物的真实转化率分别为0.56g/g与 0.68g/g。 (4-11)

由于培养基中除葡萄糖外尚有玉米浆和几种必须氨基酸提
供部分碳源,共可折算成2g/L的葡萄糖,这样对上述数据进行 修正,得到:菌体的真实转化率(YX)为0.51g/g;产物的真实转

化率(YP)为0.62g/g(产物以赖氨酸盐酸盐计)。
四、赖氨酸发酵的最大理论转化率 文献中发表的赖氨酸发酵的定量反应方程式如下: 2C6H12O6+2NH3+5O2→C6H14N2+8H2O+6CO2 3C6H12O6+4NH3+4O2→2C6H14N2+10H2O+6CO2 4C6H12O6+6NH3+3O2→3C6H14N2+12H2O+6CO2
1.18C6H12O6+2NH3+0.08O2→C6H14N2+3.08H2O+1.08CO2

(4-12) (4-13) (4-14) (4-12)

赖氨酸合成的中间产物草酰乙酸可由TCA循环或磷

酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化途径获得。当草酰乙酸通
过TCA循环合成时,赖氨酸合成的理论转化率为0.51g/g (式4-12);当草酰乙酸通过PEP羧化合成时,赖氨酸的

理论转化率为0.86g/g(式4-15)。式(4-13)是张克旭给
出的发酵反应方程式,按此式赖氨酸的理论转化率为 0.68g/g。J.Simon研究后指出赖氨酸发酵的理论转化率为

0.76g/g(式4-14)。
由此可见,赖氨酸发酵理论转化率的研究结果不统 一,目前较为广泛接受的是:赖氨酸的最大理论转化率 为0.86g/g,即发酵反应方程式为(4-15)。

但式(4-15)的系数为非整数,也不能全部化为整数。从

宏观原理出发对微生物反应过程的理论转化率进行讨论,可以
发现,对于一个给定的生物化学反应,参与反应的分子也随之 给定,一个非整数分子不再是原来给定的分子,故在生物化学

反应中各反应物的系数应为整数,式(4-15)不满足这一条件,
因此对赖氨酸发酵的最大理论转化率有必要更加深入地进行讨 论。

1、黄色短杆菌中赖氨酸的合成途径
在短杆菌属的细菌中,赖氨酸是由天门冬氨酸经α,ε-二氨 基二酸途径合成。中间代谢产物丙酮酸、草酰乙酸、天门冬氨 酸产生途径如P96图4-21所示。

葡萄糖 3-磷酸甘油醛 磷酸烯醇式丙酮酸 PK PEPC 草酰乙酸 乙醛酸 苹果酸 延胡索酸 图4-21 中间代谢产物的形成 PK:丙酮酸激酶 PDH:丙酮酸脱氢酶系 PEPC:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 异柠檬酸 丙酮酸 PDH 乙酰辅酶A 天门冬氨酸

可见,草酰乙酸的合成可以有3条途径:①由乙酰辅酶A经

三羧酸、乙醛酸循环产生;②由磷酸烯醇式丙酮酸经PEPC
(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)催化产生;③由丙酮酸经丙酮酸 羧化酶催化产生。天门冬氨酸的合成可以有两条途径:①由天

门冬氨酸转氨基酶催化草酰乙酸而产生;②由延胡索酸经天门
冬氨酸酶催化产生。 在黄色短杆菌中缺乏天门冬氨酸酶和丙酮酸羧化酶,因此

对于黄色短杆菌属由葡萄糖合成赖氨酸途径为:
(1)通过TCA循环
葡萄糖 丙酮酸 乙酰辅酶A 草酰乙酸 天门冬氨酸 赖氨酸

(2)由磷酸烯醇式丙酮酸经PEPC催化
葡萄糖 P-烯醇式丙酮酸 草酰乙酸 天门冬氨酸 赖氨酸

2、赖氨酸合成的最大理论转化率 根据黄色短杆菌中赖氨酸合成示意图(图4-22),按照以 上两条途径对赖氨酸的合成进行分析,同时在能量平衡计算时 采用如下几个设定:①葡萄糖通过主动运输进入细胞内,每输 送1mol基质消耗1molATP;②呼吸链中NAD(P)H氧化磷酸化的 效率是P/O=3,FDAH2氧化磷酸化的效率是P/O=2;③赖氨酸 形成期,菌体的浓度和组成不变;④葡萄糖的氧化和能量的释 放通过HMP途径完成。由此最终可写出途径A和途径B的总反

应式为:

途径A:
2C6H12O6+2NH3+5O2+29ADP → C6H14O2N2+6CO2+8H2O+29ATP (4-22)

途径B:
6C6H12O6+10NH3+O2 → 5C6H14O2N2+6CO2+16H2O (4-23)

根据式(4-22)和式(4-23)进行计算可得,微生物以途径

A合成赖氨酸的理论转化率为0. 51g/g;微生物以途径B合成赖氨
酸时,物质和能量的利用最有效,转化率达到其最大值,为 0.85g/g。

五、黄色短杆菌FB42的代谢流分析
根据前面的分析,黄色短杆菌产赖氨酸的真实转化率为 0.62g/g,和最大理论转化率0.85g/g相比差距很大,说明FB42菌

株中合成赖氨酸的代谢途径有其特异性。

葡萄糖 3-磷酸甘油醛 磷酸烯醇式丙酮酸 PK PEPC 草酰乙酸 乙醛酸 苹果酸 延胡索酸 图4-21 中间代谢产物的形成 PK:丙酮酸激酶 PDH:丙酮酸脱氢酶系 PEPC:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 异柠檬酸 丙酮酸 PDH 乙酰辅酶A 天门冬氨酸

赖氨酸的合成途径中至少存在35个节点(或称代谢流交叉 点),在进行理论转化率分析时往往归结于极少数的几个被称 为中心点的节点。在赖氨酸合成的代谢途径中代谢中心点为 PEP节点。在PEP节点,代谢流有两个去向:一是在PEPC的催 化下形成草酰乙酸,另一是在丙酮酸合成酶的催化下形成丙酮

酸。
黄色短杆菌中丙酮酸合成酶(变构酶)对PEP的亲和力是 PEPC的10倍,受天门冬氨酸的抑制,而乙酰辅酶A对该酶有强

烈的激活作用。Vallion研究了不同操作条件下PEP节点的代谢
流分配关系,结果表明:PEP节点的代谢流分配非常稳定,几乎 不受操作条件的影响,只和菌种本身有关。

由前面的研究知道,只有当所有的草酰乙酸都是由PEP羧 化而形成时,赖氨酸的合成才能达到最大的理论转化率,这是 一种理想情况。事实上由于PEP节点具有很强的菌种特异性, 因此对于某一具体的菌种其真实转化率很难达到理论的最大值, 通常在0.51~0.85g/g之间波动。

按FB42的真实转化率为0.62g/g,对PEP节点的代谢流进行
计算,结果见图4-23,图4-23同时计算出了理想状态下草酰乙酸 (OAA)节点的代谢流分配。

从图4-23的计算结果可以看出:①FB42菌株中PEP节点的代
谢流分配为草酰乙酸:丙酮酸=0.14;②合成赖氨酸的前体草酰 乙酸主要由TCA循环获得;③草酰乙酸进入TCA循环的比例大

于合成天门冬氨酸,表明草酰乙酸优先进入TCA循环。

由此可以得到如下的启示:①由于大部分草酰乙酸都是由 TCA循环获得,因此在发酵过程中必须保持TCA循环酶系的活 力,过高的初糖和过低的溶氧都会对TCA循环的酶系产生抑制 作用,有可能造成转化率的下降;②由于草酰乙酸优先进入 TCA循环,如果在实际发酵过程中溶氧过高,TCA循环活性过 于旺盛,大量的草酰乙酸进入TCA循环将造成天门冬氨酸形成 的减少,也有可能造成转化率降低;③FB42菌株中PEP节点的 代谢流分配为草酰乙酸:丙酮酸=0.14,表明即使在最理想的状 态下,FB42菌株中赖氨酸不可能全部由PEP羧化途径获得, FB42所能达到的最大转化率为0.62g/g。从这个意义上讲,发酵 控制所要解决的问题是如何优化操作过程,使发酵过程的表观 转化率尽可能接近FB42的真实转化率。若要进一步提高真实转 化率,则需要通过诱变育种或基因工程的手段,对菌种进行改 造,筛选出PEP羧化酶活性高的变异株。

第四节 分批发酵过程的控制及分批发酵动力学 一、初糖浓度对发酵的影响 图4-24的实验结果表明:菌体浓度存在一个饱和值,只要满 足一定的初糖浓度,菌体的生长都能达到这个饱和值。只是不 同的初糖浓度时菌体达到饱和值的时间不一样。随着初糖浓度

的逐渐升高,菌体浓度达到饱和值的时间将逐渐延长,表明初
糖浓度对FB42的生长有抑制作用。 对于发酵而言,表4-16的结果表明:初糖浓度在3.8%~18%

范围内发酵可正常进行,说明FB42有一定的耐高糖能力。初糖
浓度为11~15%时,转化率最高,达到0.33g/g,生产强度为 0.808~0.810g/(h.L);初糖浓度10%时,生产强度最大,为

0.85g/(h.L)。综合考虑,取初糖浓度15%进行分批发酵。

二、溶氧对发酵的影响 由表4-17知道,过高、过低的溶氧对发酵均不利,过低对发 酵尤为不利,表现为菌体浓度下降、产酸降低,发酵时间延长。 合适的溶氧为KLa=400h-1~500h-1。从图4-28可知,产物形成比速 π在KLa=406.2h-1时最大。

对于菌体生长来说,在满足一定的溶氧水平前提下,菌体
在不同的溶氧水平时其生长量均能达到一个饱和值,但菌体的 生长速度不同。结合图4-27和图4-26发现,当KLa=531.8h-1时,

菌体的生长比速最大,过高的KLa反而对菌体的生长有抑制作用。
综合菌体生长和产物形成的结果表明,菌体生长和产物合 成所需的合适溶氧水平不一致。

三、pH对发酵的影响 pH对许多酶的催化过程有很大的影响,pH变化能改变体系 酶的环境和营养物质的代谢流,使得诱导物和生长因子在活性 和非活性之间变化。表4-18表明,pH的变化对赖氨酸的发酵影 响很大:当pH7.0时产酸最高,pH偏高或偏低,产酸均降低。

pH对菌体生长量总的来说影响不大,但进一步的研究(图4-29
和图4-30)却发现pH同时影响了菌体的生长比速和产物的形成 比速,偏低的pH对菌体生长有利,实验范围内pH6.0时菌体的

生长比速最高,而产物形成比速在pH7.0时最高。
四、发酵过程的溶氧与pH控制 通过前面的研究可以得出结论:初糖以15%为好,对于溶氧

和pH恒定的操作,KLa在400~550h-1之间,pH7.0时发酵较佳。

溶氧和pH对菌体生长和发酵的影响是不完全相同的,如能 对溶氧和pH进行更好的控制,有希望提高发酵过程的转化率。 1、发酵过程的动力学分析 由图4-31可以看出:菌体生长比速μ开始较大,随后明显下 降;产物生成比速π开始随μ的变化而有一定的降低,但当μ很低

时,π仍很大,符合GadenⅡ类发酵特征,即:发酵前期以细胞
生长为主,中后期以产物形成为主,产物的形成与菌体的生长 仅有一定程度的相关性。

形成的赖氨酸包括两个来源:①随菌体生长而产生;②由
已完成生长的细胞转化底物为赖氨酸。据此,赖氨酸的形成动 力学可以描述为:

π=αf1+f2

(4-24)

f1为菌体动力学,f1=f1(S、P、O2、pH),α为相关系数

f2为具有活性的细胞催化底物合成赖氨酸的酶反应动力学,
f2=f2(S、P、O2、pH)。 当发酵处于中后期时,f1→0,式(4-24)可以简化为:

π=f2
2、分批发酵过程的控制

(4-25)

结合式(4-24)分析,可以看出:首先必须控制条件使得菌

体在较佳的环境中得到生长,即使f1取得最大值;随即必须控制
条件使得菌体在较佳的环境中最大限度地催化底物合成产物, 即使f2取得最大值。为此,必须对发酵过程进行分段控制。具体 结果见P105。

3、溶氧控制方式与pH控制方式的比较 由前面的实验结果知道,分别溶氧和pH都使得赖氨酸的发 酵水平得到了提高,但两种控制所得到的结果是不一样的。溶 氧控制方式提高了发酵过程的转化率;pH控制方式缩短了发酵 周期,提高了发酵的生产强度;同时使用溶氧和pH分段控制, 所得结果并不很理想,说明这两种控制方式的结合所产生的效 果没能表现出加和性,两种控制方式互有影响或干扰。 五、赖氨酸分批发酵动力学 从前面对分批发酵的研究看出,虽然通过控制反应器的溶 氧水平在一定程度上提高了发酵过程的转化率,但同真实转化 率相比,仍有较大差距,因此必须开展流加发酵研究。要使流 加发酵最优化,必须首先在分批发酵的基础上建立起较为合理 的动力学模型。

Moser曾对分批发酵动力学进行了较为详细的论述, 按建模方式将动力学模型分为3类:①机制模型;②数学 拟合模型;③正规模型(Formal Kenitics)。微生物的反 应过程非常复杂,特别是在分批发酵过程中,建立机制模 型几乎不可能。目前各国生化工程学者所提出的模型大都

属于后两类,这些模型实质上就是现象模型。
从工程角度出发,一个好的模型至少要具备两个特征: ①模型能够定量地描述发酵过程的变化;②主要影响因子

的作用能够在模型中反应出来。
1、赖氨酸分批发酵动力学模型的建立 以下几个方程都曾用于描述赖氨酸分批发酵过程。

μ=0.125s s≤2.8% dx x ?μ max 1? ( )x dt xmax

(4-26) (4-27) (4-28)

dx s ?μ max ( )x dt Ks ? s

式(4-26)为经验模型,使用范围很窄。式(4-27)

为Logistic模型,能很好地反应分批发酵过程中因菌体浓度
的增加对自身生长的抑制作用,这在分批发酵中是普遍存 在的,但该模型很特别,是一个典型的S型曲线,用于拟

合分批发酵的菌体生长过程有广泛的适用性。式(4-28)
为Monod方程。

本章第三节对FB42菌株的动力学特性考察结果表明在基 质限制条件下,菌体生长符合Monod方程。但在分批发酵过 程中基质浓度均维持在较高水平,当残糖<1%时意味着发酵 终点的到来,可见在分批发酵中葡萄糖作为菌体生长限制基 质的作用几乎不能得到体现,因此,不能用Monod方程描述

分批发酵中菌体的生长行为。
在对FB42分批发酵的研究中发现:①菌体的生长有一最 大饱和浓度;②提高初糖浓度菌体的生长速度下降,底物对

菌体生长有抑制作用。Logistic模型可以很好地解释第一个现
象,但底物对μ的抑制作用在Logistic模型中没有反映。考虑 到底物的抑制作用,提出一个描述分批发酵菌体生长的动力

学模型为:

dx x 1 ?μ max x(1 ? )( ) dt xmax 1 ? s / K i
该模型的推导过程如下:

(4-29)

假设分批发酵中菌体的生长比速主要受两个方面影响,基
质的浓度和发酵过程中其它抑制物的积累。基质对菌体生长的 影响可用Andrews模型表达: s 1 μ ?μ max ( )( ) s ? K s 1? s / K i

(4-30)

在一般分批发酵中,s>>Ks,式(4-30)可简化为:

1 μ ?μ max ( ) 1? s / K i

(4-31)

关于抑制物的积累而引起生长比速的减少可以用下式表示: μ=μmax(1-a.i) 的生长模型为: (4-32) i代表抑制物的浓度。结合式(4-31)和式(4-32),菌体

1 μ ?μ max ( )(1 ? a.i) (4-33) 1? s / K i 假定抑制物的浓度与生长比速的减少呈线性关系,即a≡常
数。又若假定抑制物的生成速度与菌体的生成速度呈比例,则:
di/dt=b.dx/dt (4-34) 若以t=0,i=0为式(4-34)的初始条件进行积分,得: i=b(x-x0),将此带入式(4-33)得: ab 1 μ ?μ max (1 ? ab x0)(1 ? x)( ) 1 ? ab x0 1 ? s / K i

(4-35)

设μmax(1+abx0)≡K/, (1+abx0)/ab≡xmax,则式(4-35)变为:

dx x 1 / ? K x(1 ? )( ) dt xmax 1 ? s / K i

(4-36)

从式(4-36)中可以看出K/的含义已经不是菌体的最

大生长比速,其值大于μmax。但由于分批发酵中,x0一般
很小,而xmax相对较高。若设x0=2g/L,xmax=20g/L,计算 可得1+abx0=1.1≈1,所以K/≈μmax ,代入式(4-36)即得式 (4-29),即: dx x 1 ?μ max x(1 ? )( ) dt xmax 1 ? s / K i

用式(4-29)能很好地描述分批发酵过程的菌体生长情 况。 2、产物形成模型 产物的形成可以Luedeking-Piret,s式(4-37)表示,即:

dP dx (4-37) ?α ?β x dt dt 式中α≠0、β=0可表示Ⅰ类发酵;α≠0、β≠0可表示Ⅱ类
发酵;α=0、β≠0可表示Ⅲ类发酵。 该方程既能反映出伴随菌体生长产物的形成速度,也能 反映出独立于菌体生长之外,细胞催化底物形成产物的速度, 能适用于任何一个发酵过程。

但该方程仅仅是一个总体描述,不能反映出基质浓度变 化对产物形成的影响。Bajpai曾经提出了一个基质非竞争模 式(4-38)用于描述青霉素发酵产物的形成过程,模型计算 值与实验值吻合很好,很好地解释了高浓度碳源对青霉素形 成的抑制作用。 dP s 1 ? K( )( )x dt s ? K sp 1 ? s / K ip

(4-38)

但赖氨酸发酵不同于青霉素发酵,前者属于Ⅱ类发酵, 后者属于Ⅲ类发酵。鉴于高浓度基质对赖氨酸发酵中产物形 成的抑制作用的存在,将式(4-37)和式(4-38)结合起来有 可能反映出赖氨酸发酵中底物抑制现象,对发酵过程进行很 好的描述。

将式(4-37)和式(4-38)结合后,得到式(4-39)。 dP dx s 1 (4-39) ? K1 ? K 2 ( )( )x dt dt s ? K sp 1 ? s / K ip 用式(4-39)对分批发酵的实验数据进行拟合,得到的
结果表明该模型能很好地描述发酵中赖氨酸的形成过程。 3、基质消耗模型 常用的基质消耗模型是基于发酵过程中底物消耗的物料 平衡而建立的方程式:
ds (? ) ? dt ds dt ?
X

?? ? ?? ? ?? ?
ds dt ?
P

ds dt

即:

m

ds 1 dx 1 dp (? ) ? ? ? mx dt Y X dt Y P dt 该模型能很好地描述发酵中基质浓度变化。

(4-40)

4、赖氨酸分批发酵动力学模型

综上所述,得出赖氨酸分批发酵的动力学模型为:

dx x 1 ?μ max x(1 ? )( ) dt xmax 1 ? s / K i

(4-29) (4-39)

dP dx s 1 ? K1 ? K 2 ( )( )x dt dt s ? K sp 1 ? s / K ip
ds 1 dx 1 dp (? ) ? ? ? mx dt Y X dt Y P dt
六、分批发酵动力学模型的评价 1、模型合理性的几个验证 P110 2、模型适用范围的评价

(4-40)

对初糖分别为4%、8%、12%和18%发酵的实验值和模 型计算值的比较结果表明:模型对初糖低于15%的发酵拟合 较好,在初糖为18%时模型计算值与实验值有较大的偏差, 说明模型在描述赖氨酸分批发酵时在初糖低于15%的范围内 具有较好的适用性。

七、分批发酵的模型分析
1、初糖浓度对产物形成速度的影响 结合式(4-29)和式(4-39),产物的形成速度为:

dP x 1 s 1 ? [ K 1μ max (1 ? )( ) ? K2( )( )]x dt s ? K sp 1 ? s / K ip xmax 1 ? s / K i ? Ax
(4-42)

从式(4-42)中可以看出,维持高的菌体浓度对产物的 形成是有利的。初糖浓度过低会造成x的下降,使得产物的形 成速度下降;但初糖浓度过高又会造成A的下降,使得产物 的生成比速下降。所以要获得高的产物形成速度,初糖浓度 有一最佳值。

2、初糖浓度对产物表观转化率(Y)的影响
将式(4-40)积分可得:
t xt ? x 0 p t ? p 0 ? ? m? xdt s 0 ? st ? 0 YX YP

(4-43)

由于在分批发酵中s0>>st,xt >>x0,p0=0,并令:

? xdt ? xt
0

t

, 则由式(4-43)得:

xt ? mx t ) Y p pt ? ( s 0 ? YX ? xt ? mx t s0 YX Y? Yp s0

(4-44)

(4-45)

由前面的分析知道,保持高浓度菌体是获得高转化率的 首要条件,将xt≈xmax代入式(4-45),并进一步简化得:

xmax mx t Y ? (1 ? ? )Y p s0 s0 Y X

(4-46)

由式(4-46)可以看出,s0对Y的影响可能表现出两种情

况:①因s0的增加,Y增加,表现出正效应,此时提高s0对提
高转化率有利;②因s0的增加,Y减小,表现出负效应,此时 提高s0对提高转化率不利。

所以要使分批发酵获得最高的转化率,有一最适的初
糖浓度。通过分批发酵操作模型的研究,可以得到如下结 论:

①分批发酵要获得高的生产强度,有一最适的初糖浓
度,其值为10%; ②分批发酵要获得最高的转化率,也有一最适初糖浓 度,其值为15%。 可见在分批发酵中不能同时获得最高的生产强度和转 化率。但从式(4-42)中不难看出若在一定的初糖浓度下发 酵,通过流加的方式提高总糖浓度,并维持发酵过程中的 糖浓度处于合适的水平,就有可能同时获得高的转化率、 高的生产强度和高的产物浓度。

第五节 赖氨酸流加发酵的最优控制
一、最小值原理简介 1、状态和状态方程 系统的状态:任何时刻都能用来描述系统性态的一组变 量。这组变量时间的函数。只有一个变量称为状态变量,多 于一个则称为状态向量。 因此系统的状态可以用下列一组状态方程来表示: dxi /dt=f1(x1,…,xn,t) (4-47)

? ? 写成向量式为: dx ? f ( x, t ) dt ? ?0 x(t 0) ? x
其中x(t)=x1(t),…,xn(t)T是状态向量。

x(t0)=xi0

i=1,…,n

(4-48)

2、控制向量 按一定的目的给系统的输入称为控制。当控制是随时间而 变化的一组变量时,称为控制向量,以u(t)表示。 受控系统中,系统的状态方程含有控制变量u1(t),…,ur(t):

dxi/dt=fi(x1,…,xn,u1,…,ur,t)
xi(t0)=xi0 i=1,…,n 写成向量的形式为:

(4-49)

? ? ? dx ? f ( x, u , t ) dt ? ? x(t 0) ? x0

(4-50)

此处u(t)=[u1(t),…,ur(t)]T表示控制向量。

3、目标泛函

由于受控系统的控制目标是多种多样的,一般用下列形式
来表示控制系统的性能指标:

J ??

1

0

? ? ? f 0( x, u , t )dt ? g[ x (t ), t ]

(4-51)

J称为最佳控制问题的目标泛函或实现准则,它可以表示系
统由开始控制到结束所消耗的时间,或表示这一段时间内系统 的消耗、误差、受益等等。 4、受控系统的最佳化问题 受控系统的最优化问题就是在所有能把系统状态从x0转移 到x1的控制中,找出最经济的控制(或相应得目标泛函J取最小 值),式(4-49)相应的解称为最佳轨迹。

在具体问题中,时间区间[t0,t1]上的t1可以是不确定的,x1

也不完全已知。庞特里金的最小值原理就是应如何求解受控系
统的最优化,特别是控制向量受约束的受控系统的最优化问题 的需要而提出的一种数学方法。

二、连续系统的最小值原理
(一)、协变向量λ(t)和哈密顿函数H 协变向量λ(t)的引入具有严格的数学含义,它和状态向量维

数相等,都是n维,且和状态向量满足下列正则方程组:

dλ ?H ( x, u ,λ , t ) ? dt ?x dx ?H ( x, u,λ , t ) ?? dt ?λ

(4-52) (4-53)

哈密顿函数H(x,u,λ,t)=f0(x,u,t)+λTf(x,u,t)

正则方程组或哈密顿方程组,有2n个微分方程,含有2n+r
个未知数x1(t),…,xn(t);λ1(t),…, λn(t); u1(t),…,ur(t)。 (二)、最小值原理

协变向量和状态向量的最优轨迹分别以λ*和x*表示,最优控
制轨迹以u*表示。最小值原理为哈密顿函数H(x*,u, λ*,t)作为u的 函数,在u(t)=u*(t)时达到最小值,即:

H(x*,u*, λ*,t)≤ H(x*,u*, λ*,t)
(三)正则方程组的求解

(4-54)

x、u、λ都包含在正则方程组中,因此,最佳控制的求解就 转化为正则方程组的求解。

1、正则方程组的边界条件

①在t0处:x(t0)=x1,这是n个边界条件;
②在t1处:对于已指定的分量xj(t1)=xj1直接取作边界条件; 对于没有任何条件的分量取边界条件为:

?g t1 λ L (t1) ? ? ? xL
所以t1处同样可得n个边界条件。

(4-55)

③若终止时间t1未确定,则增加条件:

?g ( ? H ) t1 ? 0 ?t

(4-56)

2、正则方程组的求解 正则方程组或哈密顿方程组有2n个微分方 程,含有2n+r个未知函数。不等式(4-54)即: H(x*,u*, λ*,t)≤ H(x*,u*, λ*,t)中隐含着关于u的r 个方程(是x、λ和u应满足的r个条件),所以 当正则方程组的2n个边界条件给定后,连同式 (4-54)可以完全确定出最佳控制u(t),最佳轨 迹x(t)和相应的协变向量λ(t)。

由于边界条件通常给定在区间[t1,t0]的两个 端点上,故这类问题称为两点边值问题。如果构成 两点边值问题的微分方程组是线性的,称之为线性 两点边值问题,反之称为非线性两点边值问题。对 于线性两点边值问题可以用解析法求解,对于非线 性两点边值问题可以用数值法进行试探迭代,使其 逼近最优解,步骤如下: ①给出初始的λ(t0) ; ②对正则方程组积分,u的关系式应用最小值 原理;

③检查终点时刻积分出的λ(t1) 是否和边界条件吻合,满足

要求的话,所得的轨迹即为最佳轨迹,否则按牛顿-拉普逊迭代
公式重新选择λ(t0) ,重复步骤①。 (四)哈密顿函数的一个重要特性

最佳控制u(t)、最佳轨迹x(t)和相应的协变向量λ(t0) 代入哈
密顿函数H(x,u,λ,t),则在t0≤t≤ t1上,H可看着t的函数,沿着 最佳轨迹有:

dH ?H ? dt ?t

当H不是t的显函数时(这时系统称为自控系统),有 dH/dt=0,即沿着最佳轨迹,哈密顿函数恒取常数,如果式 (4-51)中也不明显含t,且终止时间未指定,则由式(4-56) 知该常数值为零。

三、流加发酵系统的最优化问题
对于流加发酵系统,控制变量在状态方程中呈线性。 这类系统终点最优化问题数学模型可以表达为: 目标泛函 状态方程 J=φ[x(tf)] x=f(x)+g(x)u, 0≤t≤tf (4-57) (4-58)

式(4-57)和(4-58)中u表示控制向量,x表示n维的 状态量,tf表示终点的时间,f(x)、g(x)和φ(x)分别为3个n维 的函数,且对于所有的x有:

g ( x ) ? [0 ?φ ? [0 ?x

T

0 0

... ...

0]
T

0]

(4-59)

应用庞特里金的最小值原理,当H函数取最小值时,目标 泛函J取最小值,H函数为: H(x,λ,u)=λTf(x)+ λTg(x)u 式(4-60)中λ可以下式求解:
?f ?g ? λ ?? [ λ ( x) ? ( x )u ] ?x ?x
?φ λ (t f ) ? ? tf ?x

(4-60)

(4-61) (4-62)

式(4-61)中的λ表示对时间t的微分。从式(4-60)中可见, u与H呈线性关系,所以最佳控制u可以通过分析λTg的符号来决 定。若λTg为正,则u=umin;若λTg为负,则u=umax;但当时间间 隔[ti,ti-1] λTg为零时,最小值原理没有显示u应取何值,这一阶 段称为单一阶段(singular interval),相应的控制称为单一控制

(singular control)。
单一控制阶段,最优控制的求解可引用文献上介绍的方法。 对上述最优化问题有:

Hu(x,λ,u)= λTg(x)
在单一控制阶段有: λTg(x) =0

(4-63)
(4-64)

由于在单一控制阶段上,λTg(x)与t无关,恒等于零,所以 在单一控制阶段λTg(x)对时间t的任意阶导数均为零,有:
d ( T g ( x)) ? 0 λ d tk
k

(4-65)

应用式(4-65)可求得u的表达式,即不断对λTg(x)求t的微

分,直至表达式中显含u。Gabasov等对单一控制阶段的必要条
件进行了补充,指出式(4-65)求出的最佳控制还必须满足:
2k ? d [( ) H u ( x, u,λ )] ? 0,k ? 0,1,2,... (?1) ?u dt k

(4-66)

四、流加发酵最优控制的算法 考虑产物的形成,f(x)、g(x)、u的具体表达式为:

f(x)=[μx1,-σx1,πx1,0,1] g(x)=[0,Sf,0,1,0] u=F Fmin≤F≤Fmax

(4-67) (4-68) (4-69)

式(4-69)中F表示底物的流加速度,最佳控制的F为: ? F max ,λ T g<0 ? F ? ? F s ,λ T g ? 0 (4-70) ? F min ,λ T g>0 ? F(s)的求解应用式(4-65)得:

d T ? T g ? ?λ T f x g ?λ T q ? 0 ( g ( x)) ?λ λ dt

(4-71)

式(4-71)中fx表示f对x的微分,q=fxg。由于式(4-71)中 不显含F,有必要对式(4-71)继续作时间t的微分:

d T ? T q ?λ T q ? ?λ T f x q ?λ T q x x ? (λ q) ?λ dt ? ?λ T f x q ?λ T q x ( f ? gF ) (4-72)
式(4-72)中qx为q对x的微分,由于其中显含F,所以可

以求解出单一控制阶段的流加速度Fs:

?λ T ( f x q ? q x f ) /λ T q x g Fs

(4-73)

由式(4-60)可以看出,对于流加发酵系统,哈密顿函数 不显含t,所以沿最优轨迹哈密顿函数恒等于常数H*,如果终

点时间不确定,则H*=0,这样由式(4-60)、(4-64)、(471)可以得到单一控制阶段在最佳控制下关于λ的3个关系式:

? T f ? H* λ ? T λ ? g ?0 ? Tq?0 λ ?

(4-74)

表4-25给出了具体条件下的目标泛函和边界条件。通过上

面的分析得出流加发酵系统最佳控制F的具体表达式,即最优
控制F包含Fmin、Fmax和Fs3种方式。因此,如果能知道:① Fmin、Fmax和Fs 3种方式在发酵过程中的排列顺序;②确定各

种流加方式在最优控制过程中被分配的时间,则运用给定的
目标泛函和边界条件,就可以用数值解进行试探迭代,求出 最优控制F。

得出Fmin、Fmax和Fs合乎逻辑的排列顺序,必须建立在

对发酵过程分析的基础上。对于流加发酵过程,不论流加速
度取何种方式——最大、最小或单一速度,必须首先使菌体 生长处于最佳状态,然后促使菌体在最佳的条件下形成目的

产物。根据这一论点,可将一般的发酵过程分为3类:
类型Ⅰ、细胞生长无抑制和阻遏,产物形成受抑制和阻 遏; 类型Ⅱ、细胞生长受抑制和阻遏,产物形成无抑制和阻 遏; 类型Ⅲ、细胞生长和产物形成同时受到抑制和阻遏。

(一)、细胞生长无抑制和阻遏,产物形成受抑制和阻


由于菌体生长无抑制和阻遏,所以当限制性基质浓度最 高时,菌体的生长处于最佳。流加过程为发酵开始时,F必

须取Fmax,当菌体达到一定浓度后(相应的时间为t1),停
止流加。经过一段时间,反应器中限制性基质、菌体、产物 浓度达到单一阶段的要求(相应的时间为t2),进入单一阶

段,开始流加,流加速度为Fs,单一阶段一直维持至发酵体
积达到极限(相应的时间为t3)后,停止流加,发酵继续进 行,当最终满足要求后发酵结束(相应的时间为tf)。过程 见图4-39(Ⅰ-A)。

上述为类型Ⅰ的一般结论,在不同的发酵起始条件
下流加方式会有所改变。如果发酵起始条件可以任意选 定,流加发酵可能一开始就处于单一阶段,这时的流加

方式见图4-39(Ⅰ-C),Ⅰ-C中t1=t2=0;同样,发酵一
开始限制性基质浓度可能很高,这时流加发酵一开始为 分批发酵过程,随着发酵进入单一状态(t2)后,开始流 加,流加速度为单一流加速度Fs,直至反应体积达到饱 和(t3)停止流加,当最终状态到来时(tf),发酵结束, 见图4-39(Ⅰ-B);发酵起始时限制性基质浓度低而菌 体浓度高时,其流加方式见图4-39(Ⅰ-D)。

从图4-39中可以看出,发酵的起始条件对流加方式的影响

很大,具体的起始条件可以使流加方式简单化。类型Ⅰ中Ⅰ-C
最为理想, Ⅰ-B次之, Ⅰ-A最差。由前面的分析可知,有4个 时间需要求解,即t1、t2、t3和tf。由于发酵体积最大为Vf,所

以t3为单一流加阶段当反应体积达到Vf的值;而tf可以通过发酵
最终条件是否满足来确定;因此比较难求解的仅仅是t1和t2。 1、t1和t2已知

由于Fmin、Fmax、Fs的排列顺序以及各段在最优化过程中
被分配的已知,而且单一控制流速由式(4-70)给出,所以最 佳控制F的求解变成了一个标准的两点边值问题,可以用试探 迭代法求解,结合发酵的具体情况进行简化。具体见P118。

2、t1和t2未知

和t1、t2已知的情况处理一样,只是增加了几个步骤。具体
运算见P119。 (二)细胞生长受到抑制和阻遏,产物形成无抑制和阻遏

由于细胞生长受抑制和阻遏,最优菌体生长处于单一控制
阶段。假定初始时基质浓度很低,流加过程为发酵开始时,F 必须取Fmax,当达到单一控制的条件时(此时为t1),进入单

一控制阶段,流加速度为Fs,直到菌体生长满足一定的要求
(对应的时间为t2);随后必须使得产物的形成处于最优,因 产物形成无抑制和阻遏,所以F应取Fmax,这样一直维持到流 加结束(对应的时间为tf)。过程如图4-39(Ⅱ-A)所示。

同样,类型Ⅱ的流加方式也会因发酵起始条件的不同而有

所变化。发酵开始时基质浓度较高,流加过程如图4-39(Ⅱ-B)
所示;当发酵的起始条件满足单一阶段的要求时,流加过程如 图4-39(Ⅱ-C);特别地,当发酵开始的菌体浓度很高,流加

过程控制的目的就简单地变为最优化目标产物的形成,流加过
程如图4-39(Ⅱ-D)所示。具体运算见P119~120。 (三)细胞和产物形成同时受抑制和阻遏

由于细胞生长受抑制和阻遏,最优化菌体生长处于单一控
制阶段。假定初始时基质浓度很低,流加过程为发酵开始时, F必须取Fmax,当达到单一控制的条件时(此时为t1),进入单 一控制阶段;因产物的形成也受抑制和阻遏,因此单一控制阶 段必须控制底物的浓度使得开始时是最优化菌体的生长,随后

转变为最优化产物的形成,这样一直维持到发酵体积为vf,流加 结束(相应的时间为t2)。整个发酵过程如图4-39(Ⅲ-A)所示。 图4-39中(Ⅲ-B)为发酵开始时基质浓度较高,(Ⅲ-C)为发 酵初始条件刚好满足单一控制阶段的要求。具体运算见P120。 五、赖氨酸流加发酵的优化控制

(一)最优流加方式的模型计算
赖氨酸流加发酵的动力学模型如下,模型参数见表4-26:

1 μ ?μ max (1 ? )( ) xmax 1 ? s / K s s 1 π ? K 1μ ? K 2 ( )( ) s ? K sp 1 ? s / K ip 1 1 σ ? μ ? π?m YX Yp

x

(4-75) (4-76) (4-77)

从模型中看出,产物的形成和菌体生长同时受到抑制,为 类型Ⅲ。可选流加方式如图4-39(Ⅲ-A~Ⅲ-C)所示,考虑到 实际发酵中起始阶段总能维持一定的初糖浓度,因此最优流加 方式包括最小、单一、最大3个阶段,如图4-39 (Ⅲ-B)。

优化的目的是获得最高的产物浓度,因此J=-Pr。由表4-25
可知λ1(tf)=λ2(tf)=λ5(tf)=0,λ3=-1,H*=0。这样关于λ的3个关系 式(4-74)可以写为:

f1λ1+f2λ2 =-f3λ3
sfλ2 +λ4=0 q1λ1+q2λ2 =-q3λ3 得:
?λ 1 ? ? r1 ? ? ? ??? λ ? 2 ? ? r 2 ? ? rλ 3 ?λ 3 ? ?? s f r 2 ? ? ? ? ?

(4-78) (4-79)

式(4-79)中,

f 2 q3 ? f 3 q 2 f 3 q1 ? f 1 q3 ,2 ? r1 ? r f 1 q2 ? f 2 q1 f 1 q2 ? f 2 q1
将式(4-79)代入(4-73)中,得:

r ( f x q ? qx f ) Fs ? T r qx g
T

(4-80)

从式(4-80)中可以看出Fs与λ无关,最优控制的求解只 要确定时间t1即可。具体运算见P121。 表4-27为模型计算的初始值,计算出的最优化流加方式以 及菌体、残糖、产物的变化曲线如图4-40所示。

最优化流加方式包括:分批阶段(0~11.1h),单一控制 阶段(11.1~63.9h),停止流加后的分批阶段(63.9~72.4h)。 从图中可以看出单一控制阶段分为明显的两个过程。在 11.1~17.4h之间流加速度增加很快,此时葡萄糖浓度很快从 13.5g/L增加到22.4g/L;当t>17.4h流速突然从0.35L/h降低到

0.128L/h,其后流加速度一直缓慢地增加,增加的趋势几乎呈
线性变化,此阶段葡萄糖浓度一直维持在22.4g/L。 菌体浓度的变化:在发酵开始阶段增加很快,当t>17.4h

后,菌体浓度基本达到饱和。
产物浓度的变化:整个发酵过程中一直保持增长的趋势, 按此最佳操作,发酵72h后,发酵液中产物浓度为85.85g/L,

总转化率为0.429g/g。

(二)单一控制阶段的发酵本质 模型计算结果表明,在单一控制阶段通过优化流加方式, 使得发酵终点的产物浓度和转化率均大大高于分批操作。 单一控制阶段的实质是当发酵结束时为了获得最高的产物 浓度,在单一控制阶段基质的浓度以维持产物转化率处于最大。

具体见P122~124
(三)最优化流加操作方式的简化 从前面对单一控制阶段的讨论知道,直接按最优化流加方

式进行实际操作非常困难,因此需要通过适当的简化以获得能
进行实际操作的次优化流加方式。

由于在实际操作中,菌体浓度能很快接近其最大值,所以 流加培养的开始阶段在流加阶段中所占份额很小,因此可以考 虑使流加培养过程从开始到结束均维持基质浓度处于22.5g/L, 这样整个发酵过程为: ①开始的一段分批发酵过程;

②当基质浓度为22.5g/L时开始流加,在流加阶段一直维
持基质浓度处于22.5g/L; ③流加结束后再经一个分批发酵阶段,直至发酵结束。

按此过程,模型计算初值仍选用表4-27的数据,所得结果
和按最优化方式计算出的结果非常接近(发酵液中产物浓度为 85.65g/L,总转化率为0.428g/g)。

(四)流加发酵全过程的模型分析 流加发酵的全过程包括分批阶段和流加阶段,对于一定的 总糖,在分批阶段和流加阶段应如何分配才最为合理是一个需 要考虑的问题。 分批发酵阶段所消耗的糖为(s0×V0),流加阶段所消耗

的糖为(s总-s0×V0 ),可见在总糖一定时,上述分配比例仅
仅和s0、V0有关。 下面讨论总糖为3.2kg、Vf=16L时, s0、V0对整个发酵的

影响,依次决定适宜的x0、V0,并进一步分析流加阶段基质浓
度变化时对整个发酵的影响。 1、 s0变化对流加发酵全过程的影响

从图4-42可以看出,在较低的初糖浓度范围内,流加发酵 过程能保持高的转化率,初糖浓度提高,转化率呈下降的趋势, 且初糖浓度越高转化率下降的幅度越大,进一步说明高浓度基 质对赖氨酸合成存在抑制作用。因此在流加发酵中不但要保持 流加阶段处于最适的条件,在开始的分批阶段也应维持较适当

的初糖浓度。
2、V0的变化对流加发酵全过程的影响 V0增加意味着更多的糖消耗于分批发酵中。图4-43的结果

表明,当初糖浓度为150g/L时,随着V0增加,发酵过程的总转
化率呈下降趋势。 在初糖浓度较低时(50g/L),V0的变化对发酵结果的影

响如图4-44所示。

图4-44的结果表明,初糖浓度较低时V0的增加对发酵过程 的总转化率影响不大,总转化率随V0的增加几乎保持不变。不 但如此,由于V0的增加,分批阶段所获得的菌体量也增加,有 利于缩短发酵总时间,发酵过程的生产强度几乎随V0的增加呈 线性的增加。

从上述对s0和V0的分析可以得出如下结论:分批发酵阶段
应保持较低的s0,在此基础上V0应尽可能取最大值。然而,当 Vf、s总和s0一定时,V0的增加将导致流加液中基质浓度sf增加。

由于实际生产中sf常常不可能取很大的值,所以V0的取值也是
有限制的,可按下式计算。 V0 =(Vfsf-s总)/(sf-s0) (4-103)

3、流加阶段基质浓度变化对发酵过程的影响 P126 模型计算结果表明:流加阶段糖浓度(s)>22.5g/L时, 随s升高发酵过程的转化率降低;当s< 22.5g/L时,随s升高发 酵过程的转化率升高;s= 22.5g/L时,发酵过程可获得最高转 化率。s处于22.5g/L附近时,糖浓度变化对转化率的影响不明

显(图4-46)。
(五)流加发酵优化控制的结果 P127~128


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