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Analisis


Análisis en Genética

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Análisis Genético
FUNCION BIOLOGICA

Gen o genes implicados

Localización
Cartografiado

Función

Interacciones

TIPOS DE MUTACI?N

MUTACI?N G?NICA
-El alelo de un gen sufre un cambio, convirtiendose en un alelo diferente. -Ocurre en un único gen y mapea en un único locus cromosómico (“punto”) MUTACI?N PUNTUAL

MUTACI?N CROMOS?MICA
ALTERACIONES CROMOS?MICAS ESTRUCTURALES: -Reorganización de partes de un cromosoma ALTERACIONES CROMOS?MICAS NUM?RICAS: -Cambio en el número de cromosomas

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ESTRATEGIAS DE DIAGN?STICO GEN?TICO
LA PATOLOG?A ESTUDIADA: 1) ?Está asociada a una alteración cromosómica?
SI NO

2) ?Presentan herencia mendeliana?
NO

Diagnóstico Citogenético 4) ?Gen identificado?
SI NO

3) ?Locus localizado? SI
SI NO

Diagnóstico Indirecto con marcadores

Diagnóstico por patrón de segregación

Estudios de asociación y factores de riesgo

5) ?Muchos alelos mutados? 5) ?Un alelo prevalente?

Diagnóstico Indirecto con marcadores Diagnóstico Directo

ESTRATEGIAS DE DIAGN?STICO GEN?TICO
LA PATOLOG?A ESTUDIADA: 1) ?Está asociada a una alteración cromosómica?
NO

2) ?Presentan herencia mendeliana?

3) ?Locus localizado? SI 4) ?Gen identificado?
SI SI

5) ?Un alelo prevalente?

Diagnóstico Directo

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EL DIAGN?STICO DIRECTO
?Máximo nivel de precisión en el diagnóstico: Secuenciación del locus mutado. (inviable su generalización)

?Generalmente el diagnóstico directo de una mutación se realiza mediante el estudio de: Cambios en la estructura primaria del ADN (secuencia) Variaciones de tama?o. Pérdida o ganancia de dianas de restricción Variaciones en sus propiedades físico-químicas. Alteración de su movilidad electroforética o sus propiedades de apareamiento Cambios en los productos génicos: ARNm inestables o de tama?o distinto. Proteínas truncadas.

HERRAMIENTAS PARA LA DETECCION DE MUTACIONES

?Enzimas de restricción ?Técnicas de separación electroforética de Ac. Nucleicos ?Hibridación de ácidos nucleicos ?Amplificación enzimática del ADN

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HERRAMIENTAS PARA LA DETECCION DE MUTACIONES

?Enzimas de restricción ?Técnicas de separación electroforética de Ac. Nucleicos ?Hibridación de ácidos nucleicos ?Amplificación enzimática del ADN

Enzimas de restricción
- La utilización de ENZIMAS DE RESTRICCI?N fué el avance clave en la tecnología del DNA recombinante. -También conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiester a partir de una secuencia que reconocen
-DIANA:(Entre 4 y 8 nucleótidos. PALINDR?MICAS). ALTA ESPECIFICIDAD

-Toman el nombre de las bacterias que la producen: Taq I, HindIII y EcoRI, EcoRI: E = género Escherichia co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

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Enzimas de restricción
ABRUPTOS
- CORTES ABRUPTOS: (EXTREMOS ROMOS)

- CORTES ESCALONADOS: (EXTREMOS PEGAJOSOS).

ESCALONADOS

Algunas MUTACIONES pueden producir la pérdida de una diana o la aparición de una nueva diana donde antes no existía.

HERRAMIENTAS PARA LA DETECCION DE MUTACIONES

?Enzimas de restricción ?Técnicas de separación electroforética de Ac. Nucleicos ?Hibridación de ácidos nucleicos ?Amplificación enzimática del ADN

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Electroforesis de Ac. Nucleicos
-Método más común y eficaz para separar moléculas de ADN (o ARN) en función de su tama?o. -Matriz semisólida: Gel de Agarosa o Poliacrilamida. -Buffer a pH básico. -Parámetro discriminatorio: poro de la matriz.

HERRAMIENTAS PARA LA DETECCION DE MUTACIONES

?Enzimas de restricción ?Técnicas de separación electroforética de Ac. Nucleicos ?Hibridación de ácidos nucleicos ?Amplificación enzimática del ADN

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Hibridación de ácidos nucleicos
- MOL?CULA DE ADN: Complementariedad de bases - Alta Estabilidad -DESNATURALIZACI?N: Separación experimental de las dos hélices -Energía en forma de calor. -Rotura de química (formamida) -Disminución de la concentración salina

- RENATURALIZACI?N: Depende fundamentalmente de la complementariedad de bases. (Competencia entre moléculas de cadena simple)

Hibridación de ácidos nucleicos
?Cómo se utiliza esta propiedad para la detección de una mutación? CONSTRUCCI?N DE SONDAS (ADN O ARN): - Fragmento de ADN con una secuencia complementaria a la que se quiere identificar y marcado radioactiva, enzimatica o fluorescentemente. - Ambas en solución o una de ellas fijada a un soporte sólido (nitrocelulosa o nylon). - Los fragmentos separados en un gel pueden ser transferidos a un filtro de nitrocelulosa para ser detectados mediante una sonda: Southern blot

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?Cómo detectar la mutación en el producto génico?

- Un Northern blot permite medir el nivel de un transcrito (mRNA, rRNA, tRNA, pre-mRNA, etc.).

- El principio de medición es el apareamiento de bases (hibridación) entre la muestra y una sonda marcada (un DNA u otro RNA) de secuencia conocida.

?Cómo detectar la mutación en el producto génico?

- Un Western blot permite medir el nivel de una proteína. - El principio de medición es el reconocimiento de una proteína por un anticuerpo marcado específico que la reconoce. - Estas técnicas están limitadas por la disponibilidad de sondas (Southern y Northern) o de anticuerpos (Western).

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DNA RNA Proteínas

Fragmentos de restricción

T?CNICAS Souther Blot (DNA) Northern Blot (RNA) Western Blot (Prot)

Siembra y corrida electroforética Transferencia a papel de Nitrocelulosa Incubación con sonda (RNA/DNA: Hibridación) o Ac marcado

Revelado (Sólo aparecen las bandas que hayan hibridado con la sonda complementaria o Ac)

Exposición del filtro a Rayos X

HERRAMIENTAS PARA LA DETECCION DE MUTACIONES

?Enzimas de restricción ?Técnicas de separación electroforética de Ac. Nucleicos ?Hibridación de ácidos nucleicos ?Amplificación enzimática del ADN

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PCR (Polimerasa Chain Reaction) Reacción en cadena de la Polimerasa
- Amplifica enormemente una única copia de un gen. - Se necesita el primer (cebador) adecuado. - Se utiliza una polimerasa resistenete a la temperatura (Taq polimerasa)
B?SICAMENTE: T?CNICA DE AMPLIFICACI?N DE ADN

DNA
(molécula sencilla)

PCR Amplificación

Muchas moleculas

REACCI?N EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR

? Síntesis por DNA polimerasa ? -T A C G ? -A T G C A T G C A T G C * *
Cortos primers de DNA específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser copiada
5’ 3’

11

REACCI?N EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR

? Síntesis por DNA polimerasa ? -T A C G T ? -A T G C A T G C A T G C * *
5’ 3’

REACCI?N EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR

? Síntesis por DNA polimerasa ? -T A C G T A ? -A T G C A T G C A T G C * *
5’ 3’

12

REACCI?N EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR

? Síntesis por DNA polimerasa ? -T A C G T A C ? -A T G C A T G C A T G C * *
5’ 3’

REACCI?N EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR

? Síntesis por DNA polimerasa ? -T A C G T A C G ? -A T G C A T G C A T G C * *
5’ 3’

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REACCI?N EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR

? Síntesis por DNA polimerasa ? ? -A T G C A T G C A T G C * * -T A C G T A C G T
5’ 3’

REACCI?N EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR

? Síntesis por DNA polimerasa ? -T A C G T A C G T A ? -A T G C A T G C A T G C * *
5’ 3’

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REACCI?N EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR - Despues del primer periodo de sintesis de DNA, tenemos copiada una cadena de DNA
Primer 1 Extensión de la cadena

Cadena original de DNA

?Cómo produce este proceso una AMPLIFICACI?N?

REACCI?N EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR

- Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C)

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REACCI?N EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR - Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C) - Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa 2 1

- Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un rexceso de Primer 1 - Ahora tenemos dos copias de la molécula original

REACCI?N EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR - Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Fusión 95°C

Hibridización 50-60?C

Extensión de La cadena 75?C

Primer Ciclo - Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias

2do Ciclo 95?C 50 - 60?C 75?C

- Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias

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APLICACI?N EN EL DIAGN?STICO GEN?TICO - Detección directa de una mutación que altera una diana de restricción
PATOLOG?A: ANEMIA FALCIFORME
FENOTIPO DEL INDIVIDUO FORMA DE GL?BULOS ROJOS GENOTIPO TIPO DE HEMOGLOBINA

Normal Anemia Grave No hay Anemia

No se deforman nunca GR en forma de hoz Se deforman a O2 muy bajas

HbA HbA HbS HbS HbA HbS

A S AyS

- Hemoglobina S: Substitución de Glu por Val. - Cambio de una A por una T en el codón 6 del gen.

DETECCI?N DIRECTA DE UNA MUTACI?N QUE ALTERA UNA DIANA DE RESTRICCI?N
- Cambio de A por T en el codón 6 del gen de la Hemoglobina. Altera la diana de restricción para el enzima MstII

Normal: Hb A

- Digestión ADN genómico - Separación electroforesis en gel -Southern blot (sonda fragmento 1,2kb)

Mutante: Hb S

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VARIANTE USANDO PCR
-Obtención de oligonucleótidos que flanqueen la mutación (primers)

-Amplificación

-Digestión del ADN copia -Southern blot (revelado radioactivo)

ESTRATEGIAS DE DIAGN?STICO GEN?TICO
LA PATOLOG?A ESTUDIADA: 1) ?Está asociada a una alteración cromosómica?
NO

2) ?Presentan herencia mendeliana?

3) ?Locus localizado? SI 4) ?Gen identificado?
SI NO SI

Diagnóstico Indirecto con marcadores

5) ?Muchos alelos mutados?

Diagnóstico Indirecto con marcadores

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EL DIAGN?STICO INDIRECTO Independiente del conocimiento previo de la naturaleza molecular de la mutación. Solo se precisa conocer la localización cromosómica del locus implicado. ? ESTRATEGIA: Estudiar en la familia del propositus, la segregación conjunta de la enfermedad y marcadores polimórficos ligados al locus de la misma.

POLIMORFISMO GEN?TICO

POLIMORFISMO: Una serie de fenotipos alternativos normales y comunes

En sentido estricto: El polimorfismo se refiere a la ocurrencia de alelos multiples en un locus, donde al menos dos alelos aparecen con una frecuencia >1% en la población general.

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POLIMORFISMO GEN?TICO CARACTER?STICAS - La mayoría de los polimorfismos no tienen efecto sobre el fenotipo (caen en regiones no codificantes). - Algunos pocos afectan nuestro fenotipo (Estatura: alta/baja; Cabello: claro/oscuro; Color de ojos) - Un numero muy peque?o de polimorfismos son responsables de enfermedades genéticas.

POLIMORFISMO GEN?TICO A NIVEL MOLECULAR
- CODONES POLIM?RFICOS: (Coding Sequence Polymorphism) Variaciones en secuencias codificantes. -POLIMORFISMOS DE REPETICI?N: VNTR: (Variable Number of Tandem Repeats) Repeticiones en tándem de número variable en regiones no codificantes. VNTR Minisatélites: Docenas de nucleótidos repetidas en tándem (Ej:10, 15, 22).Paternidad, identificación genética judicial: “Huellas dactilares de ADN” VNTR Microsatélites: Repeticiones en tándem de secuencias entre 2 y 5 nucleótidos. Son los polimorfismos más utilizados en el diagnóstico genético. - RFLP: (Restriction Fragment Long Polymorphism) Polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción.

RFLPs y MICRO son utilizados para el desarrollo de pruebas diagnósticas

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POLIMORFISMOS GEN?TICOS MICROSAT?LITES
Gen estructural

Mapa Exon/ Intron

Intron 3

Alelo 1 Alelo 2

NNNCACACACACACANNN NNNCACACACACACACACANNN

(CA)6 (CA)8

Nucleótidos Polimórficos

IMPORTANTE: -Estan distribuidos homogeneamente por todo el genoma - Presentan un número elevado de alelos con frecuencias similares

VNTR - MICROSAT?LITES
-Dos individuos heterocigotos: 6 y 7 repeticiones / 4 y 8 repeticiones del dN (CA)n
Primer Primer

Primer

Primer

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POLIMORFISMOS GEN?TICOS RFLP (Polim. Long. Frag. de Restricción) 5.0 kb Alelo 1 Alelo 2 7.2 kb 2.2 kb

*

Restriction Site in DNA Sequence

Southern Blot Probe

POLIMORFISMOS GEN?TICOS RFLP (Polim. Long. Frag. de Restricción) 5.0 kb Alelo 1 Alelo 2 7.2 kb
- Dos alelos del mismo gen difieren por la presencia de un sitio de restricción variable en el alelo 1, resultando en diferentes patrones de restriccion. - La hibridación con la sonda permite discernir ambos alelos polimorficos.

2.2 kb

*

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POLIMORFISMOS GEN?TICOS: RFLP
- Pérdida o ganancia de una diana de restricción por efecto de: Substitución de un Nucleótido

Homocigo Heterocigoto Homocigo Mutante Portador Normal

Inserción o Deleción

APLICACI?N EN EL DIAGN?STICO GEN?TICO - Enfermedad ligada al X recesiva - Supongamos que existe un locus polimórfico (micro) íntimamente ligado al locus de la enfermedad

(CA)n

ALELOS

Ni?a, Heterocigota para la enfermedad

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Un día se comenzaron a secuenciar genomas...
- Las técnicas de la bioquímica clásica se concentraron en modelos experimentales: - 1 gen · una proteína, ó - unos pocos genes · unas pocas proteínas - En febrero del 2001 se reportó la secuencia completa del genoma humano. La anotación generó alrededor de 27.000 genes. - ?Seguiremos pensando sólo unos pocos genes se activan o inhiben frente a un estímulo ambiental? - ?Por qué no estudiarlos si conocemos sus secuencias?.

El enfoque Tradicional vs el enfoque Genómico

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El enfoque Genómico
? Hasta el momento se conocen los genomas completos de 800 organismos, se conocen billones de secuencias - ?Qué hacen todos esos genes? -?Cuándo se expresan ? -?Qué genes no se expresan o se sobrexpresan en una determinada enfermedad? -?Cómo funciona una droga?

Genómica Funcional: Entendendimiento de los procesos biológicos a través de la identificación de los genes y sus funciones (proteómica).

TERMINOLOG?A EN GEN?MICA

Genoma es el conjunto completo de secuencias de DNA en el material genético de un organismo. Proteoma es el conjunto completo de proteínas. Transcriptoma es el conjunto completo de genes expresados bajo condiciones particulares.

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CONCEPTO DE GENOTECA - Una biblioteca genómica o genoteca es una colección de fragmentos de DNA provenientes de un genoma que constituyen una representación adecuada de todas las secuencias de DNA presentes en ese genoma. - DOS TIPOS: ? Genotecas de DNA genómico ? Genotecas de DNAc copiado de RNAm presente en un tejido (dependiente de contexto).

GENOTECAS GEN?MICAS Y DE DNAc

GEN?MICA

DNAc

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T?CNICAS: ARRAYS DE ACIDOS NUCL?ICOS - Términos: DNA microarray, DNA chip, Biochips, Gene chip, genoma chip - Los soportes pueden ser nylon, vidrio o sílice. - Los fragmentos de DNA unidos pueden provenir de cDNA, DNA genómico u oligonucleótidos.

- Los microarray pueden contener un gran número de genes en una superficie peque?a, pueden contener un genoma completo.

MICROARRAYS
- Trabajan explotando la habilidad de los RNA o DNA marcados en solución a hibridizar con secuencias complementarias de DNA unidas sobre un soporte sólido en un sitio específico - Un chip puede contener desde varios cientos hasta miles de diferentes DNAs. - El DNA inmovilizado puede ser: Un oligonucleótido (20-80 mer) Un cDNA (500-5000 bases)

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MICROARRAYS Un ejemplo aplicado

MICROARRAYS
- Los microarrays o ‘chips de ADN’ son slides de vidrio o siliconas conteniendo miles de moléculas distintas de ADN. - Pueden contener : ? genes expresados por un tipo celular particular (ej. dermis) ? todos los genes del organismo ? genes seleccionados que uno quiere investigar (ej. proto-oncogenes)

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MICROARRAYS
CHIP DE ADN (microarray) Células dermis normales Células dermis tumorales

RNA marcado Cy5 (rojo fluorescente)

RNA marcado Cy3 (verde fluorescente)

MICROARRAYS
Verde: gen expresado sólo en célula tumoral

Blanco: gen no expresado en dermis

Rojo: gen expresado sólo en célula normal.

Naranja: gen expresado en célula normal y tumoral

Intensidad: nivel de expresión

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