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iTRAQ技术鉴定小鼠睾丸发育差异表达蛋白的研究


临床检验杂志 2010 年 11 月第 28 卷第 6 期

Chin J Clin Lab Sci, Nov. 2010 , Vol. 28 , No. 6

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764X( 2010 ) 0644103 文章编号: 1001-

· 基础实验诊断研究 ·

iTRAQ 技术鉴定小鼠睾丸发育差异表达蛋白的研究
王黎熔, 王静, 王富强, 王晖( 南京医科大学生殖医学实验室, 组织胚胎学系, 南京 210029 )
摘要: 目的 iTRAQ) 技术结合液相色谱 用同量异位素标记的相对和绝对定量 ( isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ 分别抽提 3 周龄小鼠与成年小鼠睾丸总蛋白质 , 鉴定出 20 个差异表达蛋白质, 其中 18 个为
TM

质谱技术构建 3 周龄小鼠与成年小鼠睾丸蛋白差异表达谱系 。方法

LTQ Orbitrap 质谱仪进行蛋白质鉴定 。结果 标记, 液相色谱( LC) 分离蛋白质, 殖、 分化、 凋亡及精子发生等重要细胞事件 。结论

3 周龄小鼠睾丸高表达蛋白质 , 2 个为成年睾丸高表达蛋白质 。差异表达蛋白质主要参与细胞的有丝分裂 、 减数分裂、 细胞增 用目前最新的定量蛋白质组技术 , 构建的 3 周龄小鼠睾丸与成年睾丸差异 精子发生有一定理论价值 , 为定量蛋白组学技术在雄性生殖领域的应用奠定了基础 。 表达蛋白谱系对研究睾丸功能 、 关键词: 同量异位素标记的相对和绝对定量技术 ; 蛋白质组; 睾丸发育 中图分类号: Q503 文献标识码: A

Identification for proteome profile of differentially expressed proteins in testis of comparative mouse by iTRAQ labeling WANG LIrong,WANG Jing,WANG FUqiang,WANG Hui ( Laboratory of Reproductive Medicine,Department of Histology and Embryology,Nanjing Medical University,Nanjing 210029 ,Jiangsu,China) Abstract: Objective To construct the differential expression profile of testis proteins from comparative mouse by using quantitative The total protein of 3weekold or adult mouse was extracted and labeled by isobaric tags for relative and proteomic analysis. Methods

absolute quantitation ( iTRAQ) . The lebeled proteins were isolated by liquid chromatography tandem mass spectrometry ( LCMS ) on linear ion trap mass spectrometer in integrated mode comprising pulsedQdissociation ( PQD) ( LTQ Orbitrap TM ) to identify the differentially expressed proteins. Results Twenty proteins were identified,among which 2 were highly expressed in the testis of adult mouse By using the latest quantitative proteomic technoloand 18 were highly expressed in 3weekold mouse. Further bioinformatic analysis indicated that the differentially expressed proteins were related to many cellspecific processes during spermatogenesis. Conclusions the further study on the function of testis and the mechanisms of spermatogenesis. Key words: isobaric tags for relative and absolute quantitation; proteome; testis development gy differentially expressed proteome profiles of testis proteins from 3 weeks and adult mouse were constructed. The profiles will inspire

MS ) 近年来, 运用二维电泳结合质谱技术 ( 2DMS ) 技术进行睾丸发育 / 精子发生 或液质联用 ( LCMS 所 相关蛋白质组学研究的报道较多。 然而 2DMS 在蛋白质分离上也常有不足; LC需样本量较高, 常用于全蛋白谱系构建, 样本用量少, 却无法用于功 能蛋白 质 组 学 ( functional proteomics ) 研 究
[13 ]

Usb 公司) , Sigma 心。尿素( 7 mol / L, 硫脲( 2 mol / L, 65 mmol / L ) 、 公司) , 二 硫 苏 糖 醇 ( DTT, 碘乙酰胺 ( IAA ) 、 CHAPS ( 4% W / V ) 购 自 GE 公 司; 甘 油、 iTRAQ 标记试剂盒( ABI 公司) 、 过硫酸铵( APS ) 、 四 甲基乙 二 胺 ( TEMED ) 、 复 合 蛋 白 酶 抑 制 剂 ( 1% ) ( Pierce 公司) 等配成蛋白质提取液备用。 低温高速
TM 22R ) ; 高效液相 离心机 ( Beckman 公司,Allegra X-

。我

们采用同量异位素标记的相对和绝对定量 ( isobaric tags for relative absolute quantitation, iTRAQ ) 技术标 并将液相色 记 3 周龄小鼠与成年小鼠睾丸蛋白质, 谱( LC ) 分离蛋白质技术与 LTQ Orbitrap 复合型电 场轨道阱回旋共振质谱仪联合使用, 分离鉴定 3 周 龄小鼠与成年小鼠睾丸差异表达蛋白质 。 1 1. 1 材料与方法 实验动物与仪器 清洁级 3 周龄 ICR 小鼠 2
TM

10 cm ? 75 μm 色谱柱( Thermo 公司) 。 色谱仪、 1. 2 鼠睾丸蛋白质提取 小鼠致死后冰上分离睾 称重后置入 Ep 管中, 按 W / V = 1? 6 加入 6 倍体 丸, 11 000 r / min, 积组织蛋白质提取液, 冰上匀浆, 至体 13 000 系呈均质状悬浊液。4 ? 静置 1 h 后,4 ? 、 r / min 离心 1 h。吸取上清至新的 Ep 管中, 以 Bradford 法测定蛋白质浓度, 分装后置 - 70 ? 备用。 1. 3 iTRAQ 标记 iTRAQ 技术采用 4 种或 8 种同 量异位素编码的标签, 通过特异性标记多肽的氨基

只, 成年( 约 8 周龄) 2 只, 购自南京医科大学动物中

1972 年生, 作者简介: 王黎熔, 女, 本科, 实验师, 从事生殖检验工作与生殖医学研究。 Email: anniewang@ njmu. edu. cn。 通讯作者: 王晖,

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基团, 而后进行串联质谱分析, 可同时比较 4 种或 8 种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量 。在质 任何一种 iTRAQ 标签标记的不同样本中的 谱图中, 同一蛋白质表现为相同的质荷比。 而在串联质谱 中, 信号离子表现为不同质荷比的峰 , 根据波峰的高 可以得到蛋白质的定量信息。4 份小鼠 度及面积, 睾丸蛋白质提取物中分别加入标准纯化蛋白质 ( 合 计量为 100 μg, 为本实验室制备) , 通过 iTRAQ 试剂 标记后混合进行定量测试, 标记具体程序参照试剂 盒说明书。 1. 4 LC 分离与质谱分析 采用高效液相色谱仪、 10 cm ? 75 μm 色谱柱进行 LC 蛋白质分离, 过强阳 离子柱 ( SCX ) 后盐洗脱, 冻干后上质谱仪 ( Thermo
TM 公司 LTQ Orbitrap ) 行 LC / MS 分 析。 喷 雾 电 压:

图, 经数据库比对分析后均为 nucleolin 蛋白。 这里 各取 1 张做为示例。
表1 3 周龄小鼠与成年小鼠睾丸差异表达蛋白质
蛋白质全名( 缩写) A 激酶( PRKA) 锚定蛋白质 4 ( Akap4 ) C 链( Ldhc) 乳酸脱氢酶过氧化物氧化还原酶 1 ( Prx1 ) 核不均一性核糖核蛋白类似蛋白( LOC627828 ) 假想蛋白( LOC629557 ) 心肌肌动蛋白( Actc1 ) 微管蛋白 α 类似蛋白( LOC671462 ) 胞质肌动蛋白( Actg1 ) 烯醇化酶 α( Eno1 ) 核不均一性核糖核蛋白类似蛋白 A3 ( LOC545592 ) LB 链( Ldhb) 乳酸脱氢酶组蛋白簇 4H4 ( Hist4h4 ) 核不均一性核糖核蛋白 A2 / B1 同工异构体 1( Hnrpa2b1 ) 假想蛋白同工异构体 7 ( LOC433229 ) 组蛋白 H2B ( H2bfb) 波型蛋白( Vim) 结蛋白( Des) 清蛋白 1 ( Alb1 ) 组蛋白簇 1H2 bp( Hist1h2bp) 核仁蛋白( Nucleolin) 表达差异 ( 3 周 / 成年) 0. 37 0. 44 1. 51 1. 53 1. 54 1. 55 1. 57 1. 58 1. 61 1. 65 1. 68 1. 71 1. 72 1. 73 1. 76 1. 88 1. 92 1. 98 2. 26 2. 34

2. 1 kV; 毛细管温度: 200 ? ; 母离子扫描范围: 400 1 800 m / z; 分离宽度: 3 Da; 二级质谱条件: AGC Target 1e4 , 2 次扫描, 碰撞能量: 28% PQD, 数据依 赖模式 MS / MS: Top 8 。 1. 5 数据分析 原始文件用 Bioworks 3. 3. 1 SP1 软件搜索相应的数据库, 得到鉴定蛋白质结果。 蛋 白质与肽段的 iTRAQ 定量结果通过 Bioworks 中的 PepQuan 得到, 以 MS / MS 中的 117 为基准质量 ( reference mass) ; 去除所有冗余蛋白质结果。 搜索使用 的数据库为添加了掺入的标准蛋白质与肽段序列 IPI MOUSE v3. 26 蛋白质库以及由该蛋白质库产生 SEQUEST 结 的反向序列数据库合成的正反混合库, 果过滤参数保证发现差错率 ≤1% 。 用 Ariadne Genomics 公司 Pathway Studio 软件 ( v5. 00 ) 进行差异 蛋白质参与的细胞事件的生物信息学分析 , 并进一 步对所提示的信息进行 Medline 检索以确认功能。 2 2. 1 结果 质谱数据分析 4 份混合小鼠睾丸蛋白质样

品共鉴定出 227 个蛋白质 ( 鉴定频数 > 2 ,平均为 4. 38 ? 3. 53 ) , 差异表达蛋白质为 20 个 ( P < 0. 05 , 差异在 1. 5 倍以上 ) , 其中 18 个为 3 周龄小鼠睾丸 高表达蛋白质( 3 周 / 成年表达量差异在 1. 5 至 2. 34 2 个为成年睾丸高表 倍之间, 平均为 1. 75 ? 0. 24 ) , 3 周 / 成年蛋白质表达量 达蛋白质 ( Ldhc 及 Akap4 , 差异分别为 0. 44 与 0. 37 倍 ) ( 表 1 ) 。 图 1 为质谱 鉴定 总 离 子 流 图 ( 1A ) 与 差 异 表 达 蛋 白 质 代 表 Akap4 ( 1B ) 与 nucleolin ( 1C ) 的二级质谱鉴定代表 图。其中 Akap4 共鉴定出 4 张谱图, 经数据库比对 分析后均为 Akap4 蛋白; nucleolin 共鉴定出 2 张谱 2. 2
图1 nucleolin 的二级 质谱鉴定总离子流图( 1A ) 与 Akap4 、 1C) 质谱鉴定图( 1B、

差异蛋白质参与的细胞事件

Pathway Studio

软件生物信息学分析提示, 差异表达的 20 个蛋白质 中有 12 个参与各种细胞事件。6 个参与细胞有丝 4 个参与细胞减数分裂, 10 个与细胞增殖相 分裂, 9 个参与细胞分化, 5 个与凋亡有关, 6 个与精子 关, 发生直接相关( 图 2 ) 。

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物的 Vim 还可表达于睾丸生精小管界膜或间质



相关研究亦发现 Vim 是一睾丸发育分子标志物, 其 在海豚及山羊不成熟睾丸的前体精原细胞中呈极性 分布, 而在成年睾丸中低表达 靠性。 此外, 本研究中发现的其他差异表达蛋白质目 前虽未发现与睾丸发育直接相关, 但其所参与的细 胞事件及差异表达模式提示其可能与睾丸发育或精 基于液相色 子发生相关。在定量蛋白质组学领域, 谱和质谱联用的策略可以对蛋白质进行精确定量 , 可作为二维电泳和质谱分析的一个很好的补充 , 为
图2 Pathway Studio 软件分析显示 3 周龄小鼠与成年小鼠 差异表达蛋白质参与的细胞事件
[7 ]

。 上述研究均提示

本研究所发现差异蛋白质的可信度, 所用方法的可

研究睾丸发育 / 精子发生相关蛋白质提供技术与理 论基础。 4 参考文献

3

讨论 iTRAQ 技 术 报 告 离 子 的 相 对 分 子 质 量 较 低

[ 1] Huang XY,Guo XJ,Shen J,et al. Construction of a proteome profile and functional analysis of the proteins involved in the initiation of mouse spermatogenesis[J] . J Proteome Res,2008 , 7 ( 8 ) : 34353446. [ 2]Aitken RJ, Baker MA. The role of proteomics in understanding J] . Int J Androl, 2008 , 31 ( 3 ) : 295302. sperm cell biology[ [ 3]Brewis IA, Gadella BM. Sperm surface proteomics: from protein lists J] . Mol Hum Reprod, 2010 , 16 ( 2 ) : 6879. to biological function[ [ 4]Pendyala G, Trauger SA,Siuzdak G,et al. Quantitative plasma proteomic profiling identifies the vitamin E binding protein afamin as a potential pathogenic factor in SIV induced CNS disease[J] . J Pro2010 , 9 ( 1 ) : 352358. teome Res, [ 5] Wu WW,Wang G,Baek SJ,et al. Comparative study of three proteomic quantitative methods,DIGE,cICAT,and iTRAQ,using 2D gel- or LCMALDI TOF / TOF[J]. J Proteome Res,2006 ,5 ( 3 ) : 651658. [ 6] Chen M, Hsu I, Wolfe A, et al. Defects of prostate development and reproductive system in the estrogen receptoralpha null male mice [ J] . Endocrinology, 2009 , 150 ( 1 ) : 251259. [ 7]Holt WV,Waller J,Moore A,et al. Smooth muscle actin and vimentin as markers of testis development in the harbour porpoise( Phocoena phocoena) [J] . J Anat, 2004 , 205 ( 3 ) : 201211.

( 113

121 ) , 由于低分子量区是质谱定性 ( 质量确

定) 和定量( 丰度比较 ) 较为准确的区域, 因此质谱 检测更为灵敏可靠。它在质量准确度、 分辨率、 动态 灵敏度以及多级质谱能力等方面的明显优势 范围、 使之正在各个领域迅速替代 TOF 类质谱产品
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本研究共鉴定出 20 个差异蛋白质, 其中有 12 个蛋白质参与细胞有丝分裂、 减数分裂、 细胞增殖与 分化、 凋亡及精子发生等细胞事件。 本研究中发现 Akap4 在 3 周 龄 小 鼠 睾 丸 的 表 达 是 成 年 的 37% , Ldhc 的表达量为成年的 44% , 由于此时刚刚出现精 子细胞, 故上述蛋白质的表达低于成年睾丸中的含 量符合实际生理发育状态。 nucleolin 是 3 周龄小鼠睾丸的高丰度蛋白质, 其表达量为成年的 2. 34 倍, 该表达模式也符合 3 周 龄小鼠睾丸与成年小鼠睾丸的细胞组分。 此外, 本 Actc1 、 Des 及 Vim 这一类同属于细 研究中还发现, 胞骨架的蛋白质均在 3 周龄鼠睾丸中高表达。据前 Actc1 、 Des 及 Vim 共定位于睾丸网, 人研究, 分别作 为平滑肌细胞分子标志物的 Des 及成纤维细胞标志



0612 , 0826 ) 收稿日期: 2010修回日期: 2010-

( 本文编辑: 刘群, 陈维忠)


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