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课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段


多聚酶链式反应(PCR技术), 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法,故又称为DNA体外扩增技术。

二 、基础知识
1、DNA分子的组成成分和结构

DNA 分子的基本组成单位是 脱氧核甘酸 . 共有 4 种,每个基本单位是由一分子 的 磷酸 、一分子的 碱基 、 和一分子的 脱氧核糖 构成。 那么DNA分子的平面结构怎 样呢?

1、DNA的基本单位-脱氧核苷酸

磷酸

4
5 3

O
脱氧 核糖

1

含氮碱基

C A T G

2

2、DNA分子的平面结构
5' 端 3'端
A T

氢 键
T
A

识别 : DNA分子的3′ 端与5′ 端

G

C

-OH端为3′ ; 磷酸基团的末 端为5′。

3'

C

G

5'端

2、DNA分子复制的过程
参与的组分
解旋酶

在DNA复制中的作用
打开DNA双链

DNA母链
4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶

提供DNA复制的模板
合成子链的原料 催化合成DNA子链

引物

使DNA聚合酶能够从引物的 3′ 端开始连接脱氧核苷酸

思考:体内DNA复制的条件是什么? 体外扩增DNA 如何提供相似环境?
解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 打开DNA双链 模板 合成子链原料 催化子链合成
物3′端开始连接脱氧 核苷酸

变性( 80-100℃ )

Taq聚合酶(耐高温) 20—30个核苷酸构 成DNA或RNA

引物( RNA) 使DNA聚合酶能从引

4、DNA 分子的热变性原理:
变性(加热80-100℃ ) 单链 复性(缓慢冷却) 变性的目的: 复性的目的: 解开双链 有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单 链的结合

DNA双链

一、PCR的原理( PCR的技术原理)
2、步骤:变性 ——复性——延伸
温 度(℃) 94 72 55 低温复性 高温变性 适温延伸 重复1~3步30轮

22
1 2 3 4 5 时间(min)

3、DNA复制的方向

DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延

PCR技术的原理总结
利用DNA分子的热变性原理,通过控制温度 来控制双链的解旋与结合,从而完成体外DAN分 子的扩增。
体外DNA复制的条件: 四种脱氧核苷 酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、 模板; 缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。

复制的方向:子链的5’端向 3’端延 伸。

二、PCR的反应过程 5/ 3/ 3/ 5/ 3/ 3/
引物Ⅰ

变性95oC 复性 55oC

5/

5/ 5/

3/

5/
引物Ⅱ

3/

延伸 72oC

5?

5?
5?

引物1 5? 引物2

模板DNA

第一次复制
5? 5? 5? 5?

第二次复制
5? 5? 5? 5? 5?

5? 5?

5?

25~30 次循环(复制)后,模板DNA的 含量可以扩大100万(220)倍以上。

PCR的反应过程总结 每个循环包括:变性 ——复性——延伸 从第二轮循环开始,上一次循环的产物也 可以作为模板参与反应,并且由引物Ⅰ延伸 而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合,进行DNA的 延伸,这样,DNA聚合酶只能特异性地复制处 于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度 的序列呈指数扩增。

三、 PCR反应的实验操作
设备及用具
1、PCR仪

实质上一台能够自动调控温度的仪器
2、微量离心管

一种薄壁塑料管,总容 积为0.5ml
3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体, 其上的一次性吸液枪头用一次更换一次

三、 PCR反应的实验操作
(1)按配方将所需试剂摆放在实验桌上(准备) (2)用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分(移液) (3)盖严离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管壁(混合) (4)将微量离心管放在离心机上(离心)

(5)将离心管放入PCR仪上,设置好PCR仪的循环程序(反应)
循环数 第一次 30次 最后一次 变性 94°C,10min 94℃,30s 94℃,1min 复性 - 55℃,30s 55℃,30s 延伸 - 72℃,1min 72℃,1min

四、结果分析与评价 50倍

蒸馏水 做对照

DNA 含量的测定:稀释→对照调零→

测定→计算(公式见P63)

波长 260nm 处读数

四、课题成果评价 (一)理论上DNA扩增数目的计算

1 、一条DNA,复制n次, DNA为2
(二)实验中DNA含量的测定

n
n

2 、 a条DNA,复制n次, DNA为a x2

1 、原理
可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果, DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收 峰,峰值的大小与DNA的含量有关

2 、过程
①稀释 2?L PCR反应液,加入98?L蒸馏水,即将样 品进行50倍稀释 ②对照调零

以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫 外分光光度计的读数调节至零
③测定并计算

取DNA稀释液100?L至比色杯中,测定260nm处 的光吸收值 DNA含量(?g/mL)=50×(260nm的读数)×稀释倍数

50:在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1, DNA 的含量为50?g /ml的

体内DNA复制与PCR的技术区别:
体内复制 PCR技术

解旋 引物 DNA聚合酶 复制特点

在解旋酶作用下,细 加热到94oC,双链全 胞提供ATP,部分解开 部解开,不需解旋酶 一小段RNA 一般用DNA片段

细胞自身的DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶 (不耐高温) 半保留复制,边解旋 半保留复制,完全解 边复制,多起点复制。 旋后复制,从模板链 的一端开始复制。

复制的方向 子链的5’端向 3’端 子链的5’端向 3’ 延伸 端延伸

课堂小结
多 聚 酶 链 式 反 应 扩 增 片 段 PCR原理 DNA的复制需要酶、原料、能量、引物 DNA的变性和复性受温度影响 变性 复性 延伸 移入离心管 放入PCR仪 计算

PCR过程 操作步骤

配制PCR反应体系 设置工作参数 调零

DNA

DNA扩增 测定含量 稀释

测定并读数

练习巩固
1、关于PCR技术的应用,错误的一项是
A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定

B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学
C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘ D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列 测定

2、DNA的合成方向总是从子链的哪一 端向哪一端延伸? 从子链的5’端向3’端 延伸 3、PCR技术最突出的优点是 A 原理简单 B 原料易找

C TaqDNA聚合酶有耐热性 D 快速、高效、灵活、易于操作

4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲 液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是 A 反复洗涤
C 高压灭菌

B 不怕外源DNA污染
D 在—20 ℃储存


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