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多肽介导的核酸药物递送系统研究进展


多肽介导的核酸药物递送系统研究进展
丁晓然,王升启* (军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京??100850) [摘要] 核酸药物作为新型基因治疗药物备受关注,但生物学稳定性差、易被体内核酸 酶降解、生物利用度低、靶组织内聚集浓度低等是制约其发展的主要因素。新的药物递送技 术的快速发展在一定程度上解决了核酸药物的稳定性及靶向递送问题, 极大地推动了核酸药 物的研发进展。 尤其是多肽蛋白类递送载体, 已成为核酸药物递送系统研究领域的热点之一。 介绍核酸药物递送载体多肽修饰的两种主要方式--共价缀合和非共价络合,重点综述近年来 多肽缀合物和复合物以及多肽修饰的载体在核酸药物递送系统中的应用研究, 探讨多肽介导 的核酸药物递送系统在应用中存在的问题,为新型核酸药物递送系统研发提供参考。 [关键词] 多肽载体;核酸药物;药物递送系统 核酸药物(nucleic acid drug)是目前国际上重点关注的一类新型生物技术药物,具有设 计方便、特异性强、不易产生耐药、利于快速反应等特点,可用于治疗病毒感染性疾病、心 血管系统疾病、代谢类疾病以及肿瘤等多种疾病[1]。自 1998 年第 1 个核酸类药物 VitraveneTM 被美国 FDA 批准上市后,多个核酸药物相继进入临床试验[2-3]。然而,核酸 药物存在生物学稳定性差、易被体内核酸酶降解、生物利用度低、靶组织内聚集浓度低等缺 点,其临床应用进展缓慢。近年来,天然核酸药物的化学修饰(如硫代修饰、混合骨架核酸 等)、 新型核酸类似物(如肽核酸)等可提高核酸药物稳定性的新技术以及核酸药物靶向递送技 术的快速发展, 极大地推动了核酸药物的研发进展。 2013 年 1 月 29 日, 在时隔 15 年之后, 第 3 个也是首个全身给药的核酸药物 KynamroTM 被美国 FDA 批准上市,掀起了新一轮核 酸药物研究热潮。 利用载体技术和给药体系提高核酸药物生物学活性,改善其体内分布,增强其对细胞 的靶向性以及被细胞摄取能力, 提高靶组织中药物的浓度和生物利用度, 是核酸药物研发的 重点和趋势所在。目前最为常见的核酸药物递送载体主要有以下几类:脂质体(如普通阳离子 脂质双层、脂质体 DOTAP、Lipofectine、pH 敏感脂质体等)、阳离子多聚复合物[如聚乙烯 亚胺(PEI)、聚酰胺-胺(PAMAM)等]、树枝状高聚物(DEN)和各类多聚物的微粒体(如聚氰基 丙烯酸酯纳米粒、聚乳酸纳米粒等)、基于特异性受体的配体介导的核酸分子靶向递送系统 和多肽蛋白类递送载体以及利用唾液酸蛋白、多糖、表皮生长因子、叶酸、转铁蛋白、甾体 激素、 单克隆抗体等靶向分子修饰而具有主动靶向作用的纳米粒[4-5]。 随着新载体技术和给 药体系的不断发展, 一些核酸药物研发公司相继构建了各具特色的递送技术平台, 其中具有 代表性的核酸药物递送系统包括 Arrowhead Research 公司的动态多价偶联递送系统 (dynamic polyconjugates,DPC)[6]和转铁蛋白靶向的环糊精纳米粒递送系统 (RONDELTM)[7]、[8]、Silence 公司基于脂质的 siRNA 递送系统(AtuPLEXTM)Tekmira 公 司的脂质纳米粒(LNP)技术[9]以及 Alnylam Pharmaceuticals 公司的 GalNAc-siRNA(N-乙酰 半乳糖胺与 siRNA 的结合体)肝靶向递送系统[10]等。基于上述递送系统,已有多个核酸药 物相继进入临床研究阶段(见表 1),并有多个相关药物处于申报临床研究或临床前研究的不 同阶段。 表 1 基于新型递送系统的临床在研核酸药物 Table 1 Nucleic acid drugs based on the new delivery system in clinical development 开发公司 Alnylam PharmaceuticalsSilence Therapeutics Arrowhead Research 药物 ALN-TTRscAtu027ARC-520CALAA-01 载体 GalNAc-siRNAAtuPLEX??DPCRONDEL ?? 靶标 甲状腺素运载蛋白(TTR)蛋白激酶 N3(PKN3)乙型肝炎病毒(HBV)核苷酸还原酶亚单位 M2(RRM2) 埃博拉病毒 L 聚合酶、 病毒蛋白 24(VP24)和病毒蛋白 35(VP35) 适应证

TTR 介导的淀粉样变性 (ATTR) 胰腺癌慢性乙型肝炎感染 淋巴瘤 开发阶段 临床Ⅱ期临床Ⅰb/Ⅱa 期 临床Ⅱ期临床Ⅰb 期 TekmiraTKM-EbolaLNP 埃博拉病毒感染临床Ⅰ期 在众多靶向递送技术当中,多肽蛋白类递送载体是目前研究的热点之一。其中较为简 单的一种递送系统是以阳离子肽即细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPP)或蛋白转导 域(protein transduction domains,PTD)为递送载体,而 CPP 不仅可用来提高核酸药物的 细胞摄取率,还能靶向特定细胞表面受体或组织。自 1994 年第 1 条 CPP 被 Fawell 等发现 以来,一系列新的 CPP 相继被报道。目前,尽管多肽介导的核酸药物转运机制尚未完全阐 明,但该递送载体发展迅速,已经成为核酸药物研发的重点领域[11-12]。 合成法完成,通常反应效率较高。连接多肽与寡核苷酸分子的连接臂需要具有一定的 化学稳定性,从而使肽-寡核苷酸缀合物在进入体内和随后的转运过程中保持稳定,而在靶 细胞中连接臂可被特定蛋白水解酶降解,从而释放核酸药物。例如,二硫键已被证明可用于 多肽介导的核酸药物递送系统[14]。研究发现,二硫键在缀合物到达内涵体或细胞质后才会 断裂, 这种断裂使多肽不会在细胞内影响寡核苷酸分子对其靶标的抑制作用。 但最近的体内 实验结果表明,这种断裂不是必须的。二硫键以及巯基可能会增加核酸药物的胞内摄取率, 其作用机制尚不清楚[15-16]。 共价缀合的优点在于可以得到结构明确、单一的化合物,简化了药物研发过程。但这 种修饰方法也存在一定的局限性, 如强阳离子多肽与带负电荷的寡核苷酸缀合和纯化存在一 定的难度,限制了用于缀合的多肽类型;此外,共价键修饰可能会影响带电荷核酸分子的生 物活性。因此,这种策略更适用于中性的磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(phosphorodiamidate morpholino oligomers,PMO)(Summerton 等, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 1997 年) 和肽核酸(peptide nucleic acids,PNA)的修饰(Nielsen, Methods Enzymol, 1996 年)。 1 核酸药物递送载体的多肽修饰策略 核酸药物递送载体的多肽修饰主要采用共价缀合和非共价络合两种方式。 1.1 共价缀合 共价缀合是通过二硫键、硫醚键、硫醇马来酰亚胺、磷酸二酯键等共价键而将多肽共 价缀合到寡核苷酸分子或其他载体上[13],这种缀合可经固相合成法或液相 非共价络合是通过非共价键将多肽及其衍生物与带负电荷的寡核苷酸分子络合,形成 复合物。一些肽载体含有疏水性基团(如疏水性氨基酸及脂肪酸、胆固醇等),这些疏水性基 团可与中性及带负电荷的分子络合形成复合物, 这种络合形成的复合物能够更好地携带寡核 苷酸分子透过质膜,将其高效地递送至靶部位[17]。非共价键连接时,不需要对寡核苷酸进 行末端修饰, 仅通过简单的混合即可形成复合物, 同时这种方法还能有效防止核酸酶对寡核 苷酸的降解,因此该方法应用更为广泛。 近年来,随着递送技术的不断发展,还有多种修饰策略相继被提出。如 Futaki 等采用 新一代非共价结合化学修饰多肽载体技术, 将十八烷酰基化的阳离子多聚精氨酸肽用作质粒 DNA 的转运载体获得成功[18]。而且,一些肽相关纳米载体、阳离子聚合物以及多肽复合体 /脂质体等也被用于寡核苷酸递送研究。 团队将可特异性结合整合素 αvβ3 受体的环肽 cRGD 与靶向血管内皮生长因子受体 2(VEGFR2)的 siRNA 分子进行共价缀合后发现, cRGD-VEGFR2 siRNA 可特异性进入整合 素 αvβ3 受体阳性的新生血管内皮细胞--人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC), 并抑制 VEGFR2 表达;cRGD-VEGFR2 siRNA 显微注射入斑马鱼体内后,能够抑制斑马鱼新生血管的形成; 在小鼠体内实验中,cRGD-VEGFR2 siRNA 不会诱导先天的免疫反应,且可特异性靶向肿 瘤组织,具有显著的抗肿瘤作用[21]。 1.2 非共价络合 CPP 与 PMO 的缀合物 PPMO 近年来被广泛应用于抗病毒、 抗细菌以及治疗遗传性疾 病等领域。PMO 最早由 AVI 生物制药公司(现更名为 Sarepta Therapeutics 公司)开发[22], 具有诸多优点,如不被酶降解、在细胞内稳定性强、对细胞无毒副作用、且不会激活细胞分

泌干扰素及免疫应答等。但是,由于 PMO 的分子结构中不带有任何电荷,使其无法被细胞 表面受体识别,也无法通过转染方式导入细胞内,极大地阻碍了其实际应用。而 PPMO 技 术的发展则有力地推进了 PMO 的应用研究,研究人员利用该递送技术确证了 PMO 在多种 病毒感染性疾病中均具有较好的抗病毒作用,如卡波济肉瘤相关疱疹病毒、单纯疱疹病毒、 日本脑炎病毒、麻疹病毒、登革热病毒、柯萨奇病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、西尼罗河 病毒以及冠状病毒等[23]。另外,有研究表明,相应的多肽-PMO 缀合物可干扰血凝素激活 蛋白酶 TMPRSS2 pre-mRNA 的剪接,有效降低甲型流感病毒的滴度[24]。在人呼吸道合胞 病毒感染的细胞和小鼠模型中,相应的多肽-PMO 缀合物均可有效阻断病毒复制;且在感染 早期给药,可显著降低小鼠肺组织的病毒滴度[25]。另有研究表明,对于感染猪生殖和呼吸 综合征病毒的猪, 无论是感染前还是感染后给予相应的多肽-PMO 缀合物治疗均可有效降低 病毒血症和间质性肺炎的发生[26]。 在抗细菌感染方面,Sarepta 公司与其合作者近期研究发现,靶向金葡菌促旋酶 A mRNA 的 PPMO 在动物体内显示出良好的抗菌作用,其可特异性结合靶基因,抑制细菌蛋 白质表达,还可避免传统抗生素的耐药问题。目前,该公司的这一抗菌新药正处于临床前研 发阶段。 2 多肽缀合物和复合物在核酸药物递送系统中的应用 20 世纪 90 年代 Bongartz 等(Nucleic Acids Res, 1994 年)首次报道了多肽介导的反义 核酸在细胞内的递送过程,即将 CPP 通过与反义核酸共价连接形成缀合物,介导核酸进入 细胞。这一方法随后被广泛用于 PNA、PMO、不同修饰的反义核酸以及 siRNA 等核酸药物 的修饰。Pooga 及其研究团队在体内外实验中发现,CPP 与靶向甘丙肽受体Ⅰ型 mRNA 的 PNA 共价缀合后,可有效地提高 PNA 在人黑色素瘤细胞中的摄取率;多肽共价修饰可提高 PNA 对体内甘丙肽受体的抑制作用(Pooga 等, Nat Biotechnol, 1998 年)。另有研究人员将 F-3 肽与经不同化学修饰的反义核酸共价缀合后发现, 这种共价缀合可显著提高核酸药物在 体内对转录因子 ld1 的抑制作用[19]。 Meng 等[20]经实验研究发现, 将 Tat(47-57)肽与 siRNA 缀合后,可有效介导 siRNA 进入细胞。南方医科大学的季爱民教授及其研究段。PPMO 抗 菌剂的开发将为细菌感染性疾病提供新的治疗策略[27]。另外,Sarepta 公司一直致力于遗 传性疾病--杜氏肌肉萎缩症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)治疗药物的开发,PPMO 技术也被证实可提高 PMO 对 DMD 的治疗效果[28-29]。 尽管 PMO 的安全性已经得到证实, 但是 PPMO 技术引入缀合肽链后,其安全性有待进一步评价。 清蛋白非特异性结合以及毒性等问题,只能用于寡核苷酸分子的体外转染,并不适用 于体内递送,如 lipofectin 或 lipofectamine 等。采用亲水聚合物(如 PEG 等)对脂质体表面 进行功能化修饰,则能将其改造为核酸分子的体内递送载体[38]。但 PEG 修饰后的脂质体 载体与细胞膜的相互作用减弱, 降低了核酸分子的细胞摄取率, 且修饰后的载体还不利于核 酸分子的胞内释放[39]。为了提高脂质体载体的核酸递送效率,研究人员在新的脂质体载体 中引入了多肽分子。当富含精氨酸的 CPP 结合到脂质体载体表面后,可显著提高载体的递 送效率[38], 且安全性可控[40]。另一组研究人员将阳离子脂质体用含 16 个赖氨酸残基和靶 向肽 Y 的嵌合肽进行修饰后,成功用于递送靶向荧光素酶等目标基因的 siRNA[41]。 多功能信封式纳米装置(multifunctional envelope-type nanodevices, MEND)是由 Harashima 和 Futaki 团队研发的一种基于脂质体的核酸分子胞内递送载体系统[42]。 该系统 将寡核苷酸与多聚阳离子鱼精蛋白聚合后用一种含阴阳离子和辅助脂质[如二油酰磷脂酰乙 醇胺(DOPE)]的脂质信封包裹,其中辅助脂质 DOPE 的作用是增加核酸分子的胞内释放。 除了表面修饰 PEG 外,该系统还可利用十八烷基化肽自发插入脂质膜的特点将多肽结合到 脂质体表面。为了增加核酸分子递送过程中的靶向性以及胞内释放,此研究团队在新型 MEND 系统中引入了可断裂的 PEG 连接键以及靶向特定受体的多肽或融合肽, 并利用此载 体将未修饰的反义寡核苷酸和 siRNA 递送入细胞内[43]。MEND 系统已被报道成功用于 siRNA 对肿瘤组织的靶向递送[44]。 由于多数递送载体都会引发机体免疫反应或全身性毒性,因此有研究人员提出另一种 生物衍生递送载体--外泌体。外泌体是由大多数细胞和体液分泌而自然产生的膜囊泡,能携 带多种蛋白质、mRNA 和 miRNA,参与细胞通讯和迁移、血管新生、肿瘤发生发展等生理 过程。这种外泌体是从内体-溶酶体途径衍生而来,直径 40~120 nm,在转运 RNA 至靶细 胞的过程中发挥着重要作用[45],同时它还具备将 miRNA 转运至靶细胞并诱导基因沉默的

能力[46]。因此,外泌体适核酸递送载体修饰策略的另一方向是利用合成或天然的阳离子多 聚复合物作为核酸分子的递送载体,这些线性或分枝状的多聚复合物主要包括聚-L-赖氨酸 (PLL)、PEI 等。这些多聚复合物可将寡核苷酸聚集成小颗粒(DNA 复合物),通过内吞作用 使核酸分子进入细胞。但是,PEI 等阳离子聚合物的非生物降解特性使得其潜在的安全性问 题备受关注[30];另外, PEI 会与血清中的一些蛋白相互作用, 导致其体内递送效率降低[31]。 研究人员尝试用聚乙二醇(PEG)修饰 PEI 聚合物以提高其在血清中的稳定性,但实验显示, 这种修饰方法并没有显著增加核酸的细胞摄取率以及胞内释放[32]。而进一步利用多肽修饰 这类阳离子聚合物,则能提高核酸分子的组织靶向性、细胞透膜率以及生物活性。研究人员 发现, 将 Tat 肽与 PEG 化 PEI 形成的共聚物和 2′-Ome 修饰寡核苷酸混合并给予 mdx 小鼠 后, 能改善抗肌肉萎缩蛋白 pre-mRNA 的外显子跨读(exon-skipping)[33]。 Schiffelers 等[34] 将整合素结合肽 RGD 修饰的 PEG 化 PEI 用于靶向 VEGFR-siRNA 的转运,获得成功。而 将转铁蛋白多肽修饰 PEG 化 PEI 后,也能将 siRNA 高效特异性地转运至神经细胞瘤移植 模型的肿瘤细胞中[35]。此外,借助叶酸与其受体的特异性相互作用,叶酸-PEG-siRNA 与 固定结构聚阳离子复合物可沉默目标基因[36]。浙江大学的梁文权研究团队近期还报道了一 种 CPP 修饰的甘露糖基化 PEI 衍生物(Man-PEI1800-CPP),并将其成功用于 DNA 分子的 体内递送[37]。 多肽分子与 LNP 结合而形成的复合物是核酸药物的另一递送载体。目前常用的阳离子 脂质体存在着与血合作为核酸分子递送载体。 Alvarez-Erviti 等[47]利用外泌体成功将外源性 siRNA 转运至小鼠大脑,其间,选用的外泌体来源于未成熟的树突状细胞,并将表达脑靶 向肽 RVG 的质粒转染至树突状细胞,使 RVG 与外泌体表面结合,以增强外泌体的脑靶向 性;随后借助电穿孔技术导入靶向目的基因的 siRNA,再将此 RVG-外泌体系统给小鼠静注, 致使所载 siRNA 靶向递送至小鼠大脑,特异性敲除小鼠大脑皮质和纹状体组织中的目的基 因。为进一步验证这种 RVG-外泌体系统的递送能力,在小鼠实验中,该系统还被用于递送 靶向 β-分泌酶的 siRNA,结果,在小鼠大脑皮质中可观察到靶基因显著被抑制,胞外 β 淀 粉样蛋白 1-42(Aβ1-42)的蓄积减少,而值得注意的是,RVG-外泌体递送系统重复给药后, 并没有观察到明显的毒性或免疫原性反应。 类载体递送效率的报道较少, Fucharoen 研究小组在对 PPMO 缀合物的研究过程中发 现该载体系统静脉注射的递送效率优于皮下注射[50]。 虽然肽类载体对核酸药物的递送作用已被多项研究证实,但对其所致毒性和免疫刺激 性缺乏系统性研究。 已有研究显示, Penetratin-siRNA 缀合物气管内给药可诱发先天免疫反 应[52],而其腹腔内给药则不会引起免疫反应,在小鼠模型实验中,其 100 mg?kg-1 腹腔内 给药表现出良好的耐受性[53]。 尽管 CPP 具有潜在的免疫刺激性, 但其与 PMO 的缀合物在 动物体内并未观察到有明显的免疫刺激性[54],且肽-PNA 复合物也未见报道会诱导免疫反 应。 由于 PMO 不带有任何电荷,毒副作用低,在动物体内及临床试验中具有良好的安全 性[55],因此引入的多肽序列和临床使用剂量对于 PPMO 缀合物的安全性评价至关重要。 Amantana 等[56]在大鼠体内合理评价了可抑制 c-myc 表达的 PPMO 缀合物的安全性,结 果显示, 低剂量(15 mg?kg-1)时, PPMO 具有良好的耐受性;但在高剂量(150 mg?kg-1)组中, 大鼠出现了如嗜睡、体质量下降、血尿素氮和血清肌酐升高等现象;致死剂量为 400 mg?kg-1。AVI 生物制药公司发表的 PPMO 缀合物在非人灵长类动物模型中的安全性评价 报告显示,健康猕猴以 9 mg?kg-1 剂量静注 PPMO(每周 1 次,共 4 次)后,出现剂量依赖 的肾脏肾小管变性;而 mdx 小鼠接受更高剂量 PPMO 给药后,并没有观察到明显的毒副作 用[57]。提示,PPMO 在不同物种中毒性阈值存在显著差异。类似地,一种缀合了含有赖氨 酸、 亮氨酸、 丙氨酸残基两亲肽的 PNA 也表现出严重的肾毒性, 健康小鼠接受其 40 mg?kg-1 剂量全身给药后,出现深度近端肾小管坏死,而在相同剂量条件下,PNA 与含有精氨酸或 精氨酸残基的两亲肽的缀合物却没有显现相同毒性[58]。 4 多肽介导的核酸药物递送系统在应用中存在的问题 大量研究表明,多肽载体在体内外均具有良好的递送效果,但其脱靶效应、体内分布、 不同给药途径对分布的影响以及毒副作用还有待进一步考察。 肽类载体的体内分布数据可以通过评价其诱导的生物学效应、检测直接标记的递送载 体、使用转基因动物及报告基因系统等方法来获取,但这些方法各自都有一定的局限性。比

如, 肽类载体诱导的生物学效应检测只能局限在表达靶基因的组织中开展, 不表达靶基因的 组织中检测不到相应生物学效应的改变;荧光分子或放射性同位素虽然已成功应用于标记和 示踪肽类载体[48], 但载体-核酸分子存在血清稳定性等问题, 只对肽类载体进行标记并不能 真实反映核酸分子的分布情况[49];EGFP-654 转基因小鼠模型可被用来检测 PPMO 的体内 分布,但是该模型无法反应 PPMO 对疾病病理过程的影响[50]。 为了优化药物分布模式,获得合理的安全曲线,需要对肽类载体的给药途径(静脉、腹 腔、皮下、口服或鼻腔等)作进一步考察[51]。给药方式的选择不仅要考虑多肽的性质和疾病 模型的靶向需求,还应充分考虑肽类载体的毒理学特征。目前直接比较不同给药途径间肽 5 结语与展望 多肽介导的核酸药物递送系统能显著提高药物的透膜性和靶向性,减少其毒副作用, 增强疗效,在药物靶向递送系统中具有广阔的应用前景。 公司基于 PPMO 递送技术而开发的用于治疗结核杆菌感染的 PMO 药物正处临床前研发 阶段。加拿大 BiOasis 生物技术公司最新研发的多肽载体 Transcendpep 经实验证实能有效递 送 siRNA 跨越血脑屏障进入脑细胞,特异性抑制靶基因,该项目已进入临床研究申报阶段。 可以预见, 在不久的将来, 会有更多基于多肽递送载体的核酸新药品种有望进入临床研 究。 不过,肽类载体的制备工艺、脱靶效应及毒副作用是其在核酸药物递送系统应用研究 领域中亟需解决的问题。 [参考文献] [1]Kurreck J. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modications[J]. Eur J Biochem, 2003, 270(8): 1628-1644. [2]Rayburn E R, Zhang R. Antisense, RNAi, and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible?[J]. Drug Discov Today, 2008, 13(11/12): 513-521. [3]Ricotta D N, Frishman W. Mipomersen: a safe and effective antisense therapy adjunct to statins in patients with hypercholesterolemia[J]. Cardiol Rev, 2012, 20(2): 90-95. [4]Ibraheem D, Elaissari A, Fessi H. Gene therapy and DNA delivery systems[J]. Int J Pharm, 2014, 459(1/2): 70-83. [5]Yang J, Liu H, Zhang X. Design, preparation and application of nucleic acid delivery carriers[J]. Biotechnol Adv, 2014, 32(4): 804-817. [6]Rozema D B, Lewis D L, Wakefield D H, et al. Dynamic PolyConjugates for targeted in vivo delivery of siRNA to hepatocytes[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(32): 12982-12987. [7]Davis M E. The ? rst targeted delivery of siRNA in humans via a self-assembling, cyclodextrin polymer-based nanoparticle: from concept to clinic[J]. Mol Pharm, 2009, 6(3): 659-668. [8]Santel A, Aleku M, Keil O, et al. A novel siRNA-lipoplex technology for RNA interference in the mouse vascular endothelium[J]. Gene Ther, 2006, 13(16): 1222-1234. [9]Li L, Wang R, Wilcox D, et al. Tumor vasculature is a key determinant for the efficiency of nanoparticle-mediated siRNA delivery[J]. Gene Ther, 2012, 19(7): 775-780. [10]Liu J, Zhou J, Luo Y. SiRNA delivery systems based on neutral cross-linked dendrimers[J]. Bioconjug Chem, 2012, 23(2): 174-183. [11]Lehto T, Kurrikoff K, Langel ü . Cell-penetrating peptides for the delivery of nucleic acids[J]. Expert Opin Drug Deliv, 2012, 9(7): 823-836. [12]El Andaloussi S A, Hammond S M, M?ger I, et al. Use of cell-penetrating-peptides in oligonucleotide splice switching therapy[J]. Curr Gene Ther, 2012, 12(3):161-178. [13]Lu K, Duan Q P, Ma L, et al. Chemical strategies for the synthesis of peptide-oligonucleotide conjugates[J]. Bioconjug Chem, 2010, 21(2): 187-202. [14]Lundin P, Johansson H, Guterstam P, et al. Distinct uptake routes of cell-penetrating peptide

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