当前位置:首页 >> 农林牧渔 >>

响应面设计优化盐霉素发酵条件


. 96 .

中国抗生素杂志2010年2月第35卷第2期

文章编号:1001-8689(2010)02-0096-04

响应面设计优化盐霉素发酵条件
张鹏伟1 储消和2,* 郭美锦1 储炬1 庄英萍1 张嗣良1
(1 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237; 2 浙江省升华拜克生物股份公司,湖州 313200) 摘要: 利用SAS,Minitab和Design-Expert软件,采用Placket-Burman设计和中心组合设计对盐霉素的发酵条件进行优化。 并运用响应面方法对盐霉素发酵条件进行进一步的分析,根据建立的多元二次方程确定其最佳水平,得到最佳的培养基:糊 精 4.5%,玉米浆 0.6%,黄豆粉 0.3%,氯化钾 0.3%,硝酸铵 0.3%,磷酸氢二钾 0.04%,豆油 10%,碳酸钙 0.1%。培养条件 为:接种量10%,pH 7.0,摇床转速为250r/min,培养周期10d。在此最优化条件下得到盐霉素发酵单位比优化前的产量提高了 44%。 关键词: 盐霉素; 响应面设计; 培养条件优化 中图分类号: S816.75 文献标识码: B

Fermentation condition optimization for salinomycin production using response surface methodology
Zhang Peng-wei1, Chu Xiao-he2, Guo mei-jin1, Chu Ju 1*, Zhuang Ying-ping1 and Zhang Si-liang1
(1 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237; 2 Shenghua Biok Biology Co. Ltd, Zhejiang Province,Huzhou 313220)

Abstract The fermentation condition of salinomycin prodction was optimized through Plackeet-Burman experimental design and central composite design (CCD) with the aid of SAS , Minitab and Design-Expert softwares. The levels of fermentation condition were further screened and identi?ed by response surface methodolgy. From the resulting of multi-quadratic equation, the optimized levels of in?uencing factors could be estimated. The optimized medium was obtained as follows: dextrin 4.5%, corn steep liquor 0.6%, soybeen meal 0.3%, KCl 0.3%, NH4NO3 0.3%, KH2PO4 0.04%, oil 10%, CaCO3 0.1% and initial pH 7.0. The optimized culture conditions were also established: shaker speed 250r/min, inoculum size 10% V/V, and cultivation duration for 10 days. The salinomycin production titer under this developed conditions in shaking ?ask culture was increased by 44% compared with that obtained at the unoptimized conditions, indicating the newly developed fermentation conditions for salinomycin production has a promising application in the industrial production. Key words Salinomycin; Response surface methodology; Fermentation conditions optimization 盐霉素(salinomycin)是由白色链霉菌(Streptomyces albus)发酵产生[1]。日本早已证实盐霉素具有 广泛的抗球虫谱,对鸡的柔嫩、毒害、堆型、脆 弱、巨型和哈氏球虫均有效,50mg/kg就有明显抑制 作用
[2,3]

用[4]。盐霉素以其高效、低残留、低耐药性在世界几 十个国家获得许可使用[5]。目前关于盐霉素的研究主 要集中在其应用研究方面,对其菌种及工艺研究的 报道较少。盐霉素为典型的含聚醚链(polyether chain) 结构的抗生素,通过乙酸和丙二酸的缩合进行生物 合成[6~7]。盐霉素为构成聚醚链的丙二酸被甲基和乙

。此外,盐霉素对大多数革兰阳性菌有抑制

作用,对梭菌等革兰阳性厌氧菌也有较强的抑制作

收稿日期:2009-09-21 资助项目:国家支撑项目(2007 BAI26B02)和生物反应器工程开放课题资助(204060) 作者简介:张鹏伟,男,生于1984年,在读硕士研究生。*通讯作者,Email:cxhe@biok.com。

响应面设计优化盐霉素发酵条件 张鹏伟等

. 97 .

基高度取代的线性脂族分子,沿着分子链有 一系列的四氢吡喃环和四氢呋喃环 。研究表明,
[8]

摇匀。然后于90℃水中加热20min,取出冷却后用分 光光度计在420nm处测定其A值,最后根据标准曲线 来确定样品的效价。 1.1.5 响应面方法(response surface methods, RSM)的 设计P-B实验,从发酵培养基各种成分筛选出对 盐霉素效价影响比较显著的因素。利用SAS软件对 试验结果进行分析;然后通过中心组合试验对影响 比较显著的因素进行进一步的优化,得到盐霉素产 量达到最大时的最佳培养条件。 (1) P-B实验设计和结果分析方法 根据单因素 的实验结果和文献的报道,选取发酵培养基的组分 的10个因素作为考察对象,每个因素取高、低两个 水平,分别记做1和-1。利用SAS统计软件对实验结 果进行各个因素的显著性分析。 (2) 中心组合实验设计和结果的分析方法 通过 SAS软件对P-B实验结果的分析,得到三个对盐霉素 设计试验

盐霉素生物合成过程和其他聚醚类抗生物质相同, 即C2-C4的脂肪酸直接进入盐霉素合成,由 6mol乙 酸、6mol丙酸和3mol丁酸缩合而成 。由于其发酵时
[9]

通常采用油作为基质,常引起发酵液粘稠,供氧不 足
[10]

,为此需要开发一新型价廉而流变特性好的培 Plackeet-Burman(P-B)试验和中心组合实验是比

养基。 较常见的发酵条件优化的实验设计
[10~12]

,在生化、 。本文通

微生物工程等方面的应用也越来越多

[13~16]

过运用P-B试验和中心组合实验对盐霉素培养基和培 养条件的优化,然后进行响应面分析,找到了一种 最优的培养组合,进一步为工业化生产水平奠定了 基础。 1 1.1 1.1.1 1.1.2 材料和方法 材料 菌种 培养基 斜面培养基(%):甘油18,酵母浸膏2.3,氯 化钠1.9,硝酸钠1.1,琼脂22;pH自然。 摇瓶种子培养基(%):蔗糖9.7,玉米浆25, 磷酸氢二钾2.0,豆油3.4,轻质碳酸钙1.1,酵母浸膏 0.2;pH6.7~6.8。 摇瓶发酵培养基(%):糊精6,黄豆粉0.5, 玉米浆0.8,磷酸二氢钾0.01,氯化钾0.22,硝酸铵 0.5,豆油16,轻质碳酸钙0.3,pH 6.7~6.8。 1.1.3 培养方法 (1)菌种活化和种子培养 将4℃保藏的斜 盐霉素产生菌Streptomyces albus F -1#

效价影响比较显著的因素,然后进行3因素5水平的 20组中心组合设计实验,设计实验的中心点编码为 0,实验的实际浓度选取PB实验中高低水平浓度的 中点值,即糊精4.0%,硝酸铵0.3%,油12%,初始 pH7.2,其余非显著因素浓度取初始培养基配方值。 2 2.1 结果与讨论 P-B筛选实验 按照1.1.5(1)的实验设计方法考察糊精 (X 1 )、黄豆粉(X 2 )、玉米浆(X 3 )、氯化钾 (X 4)、硝酸铵(X 5)、磷酸氢二钾(X 6)、豆油 (X7)、碳酸钙(X8)、接种pH(X9)和接种量(X10)10 个因素对响应值Y(盐霉素的效价)的影响,各个因 素的水平和实验结果见表1和表2。
表1
变量

由浙江升华拜克生物股份有限公司科研中心提供。

面接种到新鲜的斜面上,28℃生化培养箱中培养 6~7d,取一环斜面活化菌种接入30ml种子培养基, 在28℃温度下,250r/min摇床中振荡培养28h。 (2)发酵培养 取种子培养液以10%的接种量
糊精(%) 大豆粉(%) 玉米浆(%) KCl(%) NH4NO3(%) KH2PO4(%) 油(%) CaCO3(%) 接种pH 接种量 %

P-B试验因素和水平表
因子 低水平(-1) X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 3 0.3 0.6 0 0.2 0 8 0.1 7.0 5 水平 高水平(1) 6 0.7 1.0 0.3 0.5 0.04 12 0.8 8.0 10

接入30ml发酵培养基,在33℃下,250r/min摇床中培 养10d,每个样品做五个平行样,结果取平均值。摇 瓶培养试验的装液量均为30ml的培养基于250ml的锥 形瓶中。 1.1.4 盐霉素浓度的检测方法 吸取试样适量,用无 水乙醇定容至100ml,超声波提取20min,冷却后过 滤,取滤液1ml,用无水乙醇定容至10ml,取稀释液 0.5ml于具塞试管中,加入无水乙醇4.5ml,显色剂5ml,

. 98 . 表2 P-B试验结果(U/ml)
序号 效价 1 12316 2 35053 3 6053 4 5895 5 4741 6 14105 7 18421 8 9368

中国抗生素杂志2010年2月第35卷第2期

9 10526

10 6263

11 15947

12 12211

利用SAS软件对以上的结果进行分析(表3), 对效价影响比较明显(P<0.05)的因素有X 1 (糊 精),X 5(NH 4NO 3)和X 7(油),X 1、X 5和X 7都是 负相关。同时,相关系数R2=0.9972,可知本试验结 果拟合度很高。因此可以根据PB试验可以确定非显 著性因素的水平:黄豆粉0.3%,玉米浆0.6%,KCl 0.3%,KH2PO4 0.04%,CaCO3 0.1%,pH7.0,接种量 10%。 2.2 中心组合试验设计及结果 按照1.1.5(2)确定的三个因素的编码水平和试 验设计方法设计中心组合试验,各因素编码水平和 试验结果见表4和表5。

2.3

响应面分析 对中心组合响应面试验结果运用SAS,Minitab

和Design-Expert软件进行统计分析,以效价为响应 值,并应用一元二次方程对试验结果进行响应面回 归分析(表6)。 Yi是预测相应值,Xi 是自变量,βi为自变量一次 性系数,βii为变量的平方相系数,βij为自变量交叉相 乘积的系数,Xij为两个自变量的交叉乘积。

Y = β0 + ∑ βi X i + ∑ βii X 2ii + ∑ βi X i X j
i ii ij

相应的二次方程表述如下: Y= +
12 0

+
13

1

X1+

2

X2+
23

3

X3+

11

X12+

22

X22+

33

X32

X1X2+

X1X3+

X2X3

从统计分析的结果来看,模型的F值为46.08,
表3
变量 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 参数估计 -2904.67 -2482.50 -1014.83 39.17 -4376.67 1768.33 -4029.17 312.67 -435.50 2799.83

P-B试验结果分析
标准误差 296.80 296.80 296.80 296.80 296.80 296.80 296.80 296.80 296.80 296.80 t-Value -9.79 -8.36 -3.42 0.13 -14.75 5.96 -13.58 1.05 -1.47 9.43 P>︱t︱ 0.0103 0.1440 0.1759 0.9071 0.0046 0.2270 0.0054 0.4026 0.2800 0.2111

Lack of Fit值为0.5145,较高的F值和不显著的Lack of Fit参数(0.5145>0.05)说明所选择的模型能够对数 据进行很好的拟合,同时模型的Prob值< 0.0001和影 响不显著的Lack of Fit值说明试验得到的数据结果与 模型吻合度较好。 通过统计回归分析,拟合得出的方程如下: Y=63.88+1.66X1-0.27X2-1.23X3-7.27X12-4.09X224.17X32-0.5X1X2+0.45X1X3+2.03X2X3 根据响应面分析三维图及等高线图可以看出糊 精、豆油、硝酸铵3个因素对效价的影响,如图1~3。 根据以上数据分析,进行偏导微分处理得到影 响最为显著的三个因素的最优浓度为:糊精4.5%、 油10%和硝酸铵0.3%。 2.4
1 0.35 14 4.5 1.68 0.4 16 5.0

表4 试验因素和水平表
变量 因子 -1.68 NH4NO3(%) 油(%) 糊精(%) X1 X2 X3 0.2 8 3.0 -1 0.25 10 3.5 水平 0 0.3 12 4.0

回归模型实验验证 经过实验设计和模型分析得到的优化培养基配

方(%):糊精4.5,玉米浆0.6,黄豆粉0.3,氯化钾 0.3,硝酸铵0.3,磷酸氢二钾0.04,豆油10,碳酸钙0.1。 培养条件:接种量10,pH7.0,摇床转速250r/min,

表5
序号 效价 序号 效价 1 19654 11 16896 2 14954 12 20224 3 20066 13 16769 4 20351 14 13282

中心组合试验结果(U/ml)
5 15691 15 14677 6 15279 16 19685 7 14328 17 15850 8 13440 18 16896 9 14740 19 17561 10 15945 20 20478

响应面设计优化盐霉素发酵条件 张鹏伟等 表6 以效价为响应值的统计分析结果
来源 模型 A B C A2 B2 C2 AB AC BC 单方和 1166.667 37.39917 1.017265 20.61035 761.1952 240.5684 251.0896 2.000000 1.445000 32.80500 DF 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 均方 129.6 37.40 1.020 20.61 761.2 240.6 251.1 2.000 1.440 32.81 F值 46.08090 13.29470 0.361619 7.326592 270.5906 85.51754 89.25765 0.710962 0.513670 11.66156 Prob > F < 0.0001 0.0045 0.5610 0.0221 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 0.4188 0.4900 0.0066

. 99 .

图3

以效价为响应值糊精和油的响应曲面图

(1)采用响应面方法(RSM)对初始发酵培养 基进行优化后的发酵培养基及优化条件得到效价为 22534U/ml,比优化前(15684U/ml)相比产量提高 了44%,与模型预测值21497U/ml之间的误差<5%。 从盐霉素的代谢途径中可以看出,盐霉素的合成途 径多为聚多酮途径,起始单位是三碳单位丙二酰辅 酶A,以植物油和动物油作为培养基碳源能提供更多 的三碳和二碳单位,有利于盐霉素合成。而糊精作 为碳源时,尽管也可以转化为短链脂肪酸参与盐霉 素的合成,但是大部分进入TCA循环 [17]。上述结果
图1 以效价为响应值油和NH4NO3的响应曲面图

与我们的筛选结果吻合,糊精和硝酸铵保证了菌体 的快速生长。虽然油能够为盐霉素的合成提供前提 物质,但是油的浓度并不是越高越好。这是由于油 对发酵液溶氧的影响很大,过量的油会吸附在菌丝 上,严重影响菌丝的生长和代谢,最终也影响了效 价的高低。说明合适的油的浓度对于菌体生长和产 素是很重要的,但不是越多越好。 (2)将SAS, Minitab和Design-Expert软件用 于抗生素发酵的优化中,集实验设计,结果数值分 析,图表直观分析和模型回归分析于一体,体现了 一种利用多种工具功能的时效性,不但减少了工作 量,也使实验设计和分析简单化,而且取得了比传 统优化方法更好的试验结果,为盐霉素等抗生素发 酵条件的优化提供了新的思路。

图2

以效价为响应值糊精和NH4NO3的响应曲面图

参 考 文 献 培养10d。在此条件下得到的效价为比优化前相比产 量提高了44%,与模型预测值之间的误差<5%。 3 结论
[1] Miyazaki Y, Shibuya M, Sugawara H, et a1. Salinomycin, a new polyether type antibiotic[J].J Antibiot, 1974, 27 (11):814~821.

(下转155页)

那西肽对肉仔鸡生长性能及胴体品质的影响 史莹华等 长猪的饲养试验[A]//饲用抗生素研究与应用[C]. 北京:中 国农业大学出版社,2000:160~164. [8] 沈建忠,肖希龙,刘金凤. 诺肽霉素预混剂对肉用仔鸡的 饲养试验[A] //饲用抗生素研究与应用[C]. 北京:中国农业 大学出版社,2000:155~159. [9] 张震宇,程文虹. 那西肽在肉鸭饲料中的应用效果[J]. 饲料 博览,2005,(9):40~41. [10] 叶莹,戴贤君. 日粮中添加那西肽对宝石鲈生长性能的影 响[J]. 中国计量学院学报,2006,17(3):254~256. [11] Stahly T S, Willams N H, Zimmerman D R. Impact of carbide

. 155 . on rate, ef?ciency and composition of growth in pigs with a low and high level of immune system activation [J]. J Anim Sci, 1995, 72: 165~174. [12] 朱淑斌,刘长有,魏国生. 那西肽对生长肥育猪作用效果 的研究[J]. 中国畜牧杂志,2005,41(10):44~46. [13] 胡志军,邹晓庭. 那西肽对肉鸭生产性能的影响 [J] . 中 国动物保健,2006,(5):61~62. [14] 李红军,邹晓庭. 那西肽对肉仔鸡生长性能、胴体组成 及相关血清生化指标的影响[J]. 中国畜牧杂志,2005, 41(2):24~26.

(上接99页)
[2] Miyazaki Y, Shibata A,Yahagi T, et a1. Method of producing polyether type antibiotics as well as salinomycin antibiotics[ M]. 1978. [3] 徐奇友,许红.盐霉素及其在饲料中的应用[J].饲料博览, 2002,(6):31~32. [4] 佟建民,沈建忠.饲用抗生素研究与应用[M].北京:中国农 业大学出版社,2000:1~17. [5] 刘秀全.高效多功能饲料添加剂一盐霉素[J].饲料工业, 1997,18(4):9~11. [6] 储炬,李友荣.现代工业发酵调控学[M].北京:化学工业出 版社,2002:187~199. [7] 顾觉奋,祝兴伟.组合生物合成聚酮类药物研究进展[J].中 国新药杂志,2006,15(19):1620~1625. [8] Lvnen F.Biosynthetic pathways from acetate to natural products[J]. Pure Appl Chem,1967,14(1):137. [9]Westley J.Polyether Antibiotics[M].New York: Marcel Decker. 1982: 43~102. [10] Procházka P, Noh?nek M, Vanek Z, et al. Utilization of a lipid substrate for submerged fermentation of Strepmyces albus[J]. Folia Microbiol, 1983,28: 406~408 [11] 李野,张小平,张克强,等.蜡质芽抱杆菌DLSL-2发酵条件 探讨及培养基优化[J]. 微生物学通报,2005,32(2):45~49. [12] 李永红,刘波,赵宗保,等.圆红冬孢酵母菌发酵产油脂 培养基及发酵条件的优化研究[J].生物工程学报,2006, 22(4):650~656. [13] 董函竹,刘沛溢,谭天伟.发酵生产S-腺苷-L-蛋氨酸培养 条件的优化研究[J].微生物学通报,2006,33(1):110~113. [14] 高兴蓉,姚善泾,朱健,等.麦考酚酸产生菌液体发酵条 件的优化[J].中国医药工业杂志,2007,8(4):273~276. [15] 倪勤 .SAS最优化软件速成[M].北京:科学出版社,1998. [16] 胡升,梅乐和,姚善泾.响应面法优化纳豆激酶液体发酵 [J].食品与发酵工业,2003,29(I):13~17. [17] 陈代杰.短链脂肪酸在盐霉素生物合成中作用机制的初步 探讨 [J].抗生素,1988,13(3):214~222.


相关文章:
更多相关标签: