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4 iTRAQ技术简介 20110929


iTRAQ 技术简介
iTRAQ 技术 iTRAQ 技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation, ABI)2004 年开发的同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术,是一种新的、功能强大的可同时对四种样品 进行绝对和相对定量研究的方法,这种方法是建立在 iTRAQ 试剂的基础上。 iTRAQ 技术原理: 技术原理: iTRAQ 试剂为可与氨基酸 N 端及赖氨酸侧链连接的胺标记同重元素 (isobaric)。在质谱图中,任何一种 iTRAQ 试剂标记的不同样本中的同一蛋白质 表现为相同的质荷比。 在串联质谱中,信号离子表现为不同质荷比(114~117)的峰,因此,根据波 峰的高度及面积,可以得到蛋白质的定量信息。 iTRAQ 试剂结构: 试剂结构: iTRAQ 试剂是一种小分子同重元素化学物质,包括三部分: 一端是报告部分 reporter group 另一端是肽反应部分 peptide reactive group 中间部分是平衡部分 balance group 其中: reporter group:质量为 114Da、115 Da、116 Da、117 Da,因此 iTRAQ 试剂共四种。 ? peptide reactive group:将 reporter group 与肽 N 端及赖氨酸侧链连接,几乎可以 标记样本中所有蛋白质。 ? balance group:质量为 31 Da、30 Da、29 Da、28 Da,使得四种 iTRAQ 试剂分 子量均为 145 Da,保证 iTRAQ 标记的同一肽段 m/z 相同。

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图 1 iTRAQ 试剂结构

图 2 iTRAQ 试剂标记原理 综上: 4 个来源不同的相同蛋白样品在一级质谱上表现相同 Balance group 在二级质谱发生中性丢失 Reporter group 在二级质谱产生4个报告离子,分别是 114、115、116 和 117 通过分析报告离子的峰强度比值就可以分析同一个蛋白在不同样品间的表达 量比值 操作流程: 操作流程:

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iTRAQ 技术主要特点: 技术主要特点: 1.分离能力强、分析范围广 2.定性分析结果可靠,可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息 3.MS 具备高灵敏度、检测限低 4.分析时间快,分离效果好 5.自动化程度高 6.iTRAQ 技术不仅可发现胞浆蛋白,还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白 iTRAQ 技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于 10KD 或大于 200KD 的蛋 白 iTRAQ 技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation, ABI)2004 年开发的同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术,是一种新的、功能强大的可同时对四种样品 进行绝对和相对定量研究的方法,这种方法是建立在 iTRAQ 试剂的基础上。 AB 公司 itraq 技术平台: 技术平台: 1. 寻找差异表达蛋白,并分析蛋白功能。 2. 定性与定量分析蛋白:分析结果可得出各样品中蛋白名称及蛋白量的比值 3. 差异基因筛选:利用统计学方法筛选差异表达的蛋白和差异表达的基因 4. Pathway enrichment 分析:找出差异表达基因在生物学通路中的位置,以阐明 其生物学功能以及不同基因之间的相互作用。

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图 3 红色代表上调的基因/蛋白,绿色代表下调的基因/蛋白 5. 转录因子预测分析 分析每个转录因子在上调基因和下调基因的分布情况, 转录因子预测分析: 寻 找有差异的转录因子。

图 4 黄色为差异蛋白,天蓝色为转录因子 iTRAQ 技术 样品准备 技术-样品准备 1.蛋白运输:24 小时内可以 4 度运输 2.蛋白长期保存:-20 度 3.待检测蛋白要求:蛋白量最低 50ug,浓度最低要为 5ug/uL 10ul,否则同位素 无法标记。 4.蛋白提取试剂要求:使用普通的组织、细胞裂解液即可,切忌不要使用二维电 泳试剂提取。

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