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2013届高考生物一轮复习学案:第10单元 DNA重组技术的基本工具和基因工程的基本操作程序


第十单元 学案

现代生物科技专题

DNA 重组技术的基本工具和基因工程的基本操作程 序

考纲要求 1.基因工程的诞生 Ⅰ 2.基因工程的原理及技术 Ⅱ 复习要求 1.理解基因工程的实质 2.理解基因工程操作的四步曲及其操作实例 基础自查 一.基因工程的概念 基因工程是指 ,通过 以新的遗传特性,创造出 水平上进行设计和施工的,又叫做 二.基因工程的基本工具 1.限制性核酸内切酶(限制酶) (1)来源: 。 (2)功能:

技术,赋予生物 。基因工程是在 。

。 (3)结果:产生的 DNA 片段末端通常有两种形式: 2. DNA 连接酶 (1)两种 DNA 连接酶(E· coliDNA 连接酶和 T4-DNA 连接酶)比较: ①相同点: 。 ②区别:



(2)与 DNA 聚合酶作用的异同:

3.载体 (1)载体具备的条件:

(2)最常用的是 其它载体: 三.基因工程的基本操作程序 第一步: 原核基因采取直接分离获得,真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有 。 2.PCR 技术扩增目的基因 (1)原理: (2)过程:: 。

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第二步: 1.目的: 2.组成: (1)启动子: (2)终止子: (3)标记基因的作用: 第三步: 2.常用的方法: a、将目的基因导入植物细胞方法: b、将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是 体细胞多是 。 C、将目的基因导入微生物细胞:最常用的原核细胞是 。 第四步: 1.首先要检测 2.其次还要检测 3.最后检测 用 4.有时还需进行 状。 课堂深化探究 一.对基因工程概念的理解 别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 与杂交育种相比 与诱变育种相比 原理 二.基因工程的基本操作工具 1.与 DNA 分子相关的酶 (1)几种酶的比较 种类 项目 作用底物 作用部位 作用特点 作用结果 (2)限制酶与 DNA 连接酶的关系
2

。 。 。 。

。 。此方法的受 ,其转化方法是:

,方法是采用 。 ,方法是采用 。 ,方法是 , 。 的鉴定。 转基因抗虫植物是否出现抗虫性 如

基因拼接技术或 DNA 重组技术

限制酶

DNA 连接酶

DNA 聚合酶

解旋酶

2.载体 (1)作用

(2)具备的条件

(3)种类

特别提醒 ①一般来说, 天然载体往往不能满足人类的所有要求, 因此人们根据不同的目的 和需要,对某些天然的载体进行人工改造。 ②限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外, 这样才能保证标记基因的完整 性,有利于对目的基因的检测。 三.基因工程操作程序 基因工程技术生产凝乳酶的过程

1.基因工程的操作程序分析 (1)目的基因的获取途径

(2)基因表达载体的构建

特别提醒 ①插入的目的基因的表达需要调控序列, 因而用作载体的质粒的插入基因部位之 前需有启动子,之后需有终止子。 ②两次使用的限制酶为同一种酶,这样形成的黏性末端碱基之间互补,便于连接。 (3)将目的基因导入受体细胞(转化) 生物种类 常用方法
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植物细胞

动物细胞

微生物细胞

受体细胞 转化过程

体细胞

受精卵

原核细胞

(4)目的基因的检测与鉴定 类 型 导入检测 分子 检测 转录检测 翻译检测 检测内容 方 法 结果显示

个体水平检测 特别提醒:1.在整个工程中,只有第三步将目的基因导入受体细胞过程中不发生碱基互补 配对,其他步骤均发生配对。 2.切割质粒和目的基因的限制酶必须是同一种酶,以获得相同的黏性末端,利于基因表达 载体的构建。 3.插入的目的基因只是结构基因部分,其表达需要调控序列,因而用作载体的质粒的插入 部位前须有启动子,后须有终止子。 4.PCR 技术与 DNA 复制的比较 PCR 技术 相 同 点 不 同 点 原理 原料 条件 解旋 方式 场所 酶 结果 DNA 双链复制(碱基互补配对) 四种游离的脱氧核苷酸 模板、ATP、酶等 DNA 在高温下变性解旋 体外复制 热稳定的 DNA 聚合酶(Taq 酶) 在短时间内形成大量的 DNA 片段 解旋酶催化 主要在细胞核内 细胞内含有的 DNA 聚合酶 形成整个 DNA 分子 DNA 复制

对应训练 1.下列关于基因工程的叙述,错误的是( ) A.目的基因和受体细胞均可来自动物、植物或微生物 B.限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶是两类常用的工具酶 C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性 D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组 DNA 的细胞和促进目的基因的表达 2.下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述,错误的是( )。 A.一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列 B.限制性核酸内切酶的活性受温度影响 C.限制性核酸内切酶能识别和切割 RNA D.限制性核酸内切酶可从原核生物中提取 3.如图是利用基因工程技术培育转基因植物,生产可食用疫苗的部分过程示意图,其中 Pst Ⅰ、Sma Ⅰ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是( )。

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A.图示过程是基因工程的核心步骤 B.表达载体构建时需要用到限制酶 SmaⅠ C.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 D.除图示组成外,表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 4.下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图,有关叙述正确的是(

)

A.过程①获取的目的基因,可用于基因工程和比目鱼基因组测序 B.将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因,不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白 C.过程②构成的重组质粒缺乏标记基因,需要转入农杆菌才能进行筛选 D.应用 DNA 探针技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达 限时训练 题组一 基因工程及基本操作 1.科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的 DNA 分子重组,并且在大肠杆 菌体内表达成功。请根据图回答问题:

(1)此图表示的是采取 合成基因的方法获取 基因的过程。 (2)图中①DNA 是以 为模板, 形成单链 DNA, 在酶的 作用下合成双链 DNA,从而获得了所需要的基因。 (3)图中③代表 DNA,含 基因。 (4)图中④表示 。 2.下图为 DNA 分子在不同酶的作用下所发生的变化,图中依次表示限制酶、DNA 聚合酶、 DNA 连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )

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A.①②③④ B.①②④③ C.①④②③ D.①④③② 3.下列关于基因工程的叙述,不正确的是(多选)( ) A.基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因 B.细菌质粒是基因工程常用的运载体 C.通常用一种限制性核酸内切酶处理含目的基因的 DNA,用另一种处理运载体 DNA D.为培育成抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体 题组二 基因工程的操作程序 4.下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程,请据图回答下列有关问题。

(1) 若 限 制 酶 Ⅰ 的 识 别 序 列 和 切 点 是 —↓GATC— , 限 制 酶 Ⅱ 识 别 序 列 和 切 点 是 —G↓GATCC—,那么在①过程中,应用限制酶________切割质粒,用限制酶________切割 抗虫基因。 (2)将通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有________的培养基上,若能够生长说明已导入 了普通质粒或重组质粒,反之则说明没有导入。 (3)要确定抗虫基因导入后,是否能稳定遗传并表达,需进行检测和鉴定工作,则在个体水 平上的鉴定过程可简述为:________。经筛选分析,该植株细胞中含有一个携带抗虫基因的 DNA 片段,因此可以把它看作是杂合子。理论上,该转基因植株自交产生的 F1 代中,仍具 有抗虫特性的植株占总数的________。 (4)⑤过程所用的现代生物技术称为________,从遗传学角度来看,据细胞通过⑤过程,能 形成棉植株的根本原因是细胞具有____________________。 5.干扰素是病毒侵入人体后由淋巴细胞产生的一种免疫活性物质,它具有广谱抗病毒的作 用。利用现代生物技术生产干扰素的流程如下:

(1)过程①产生的物质 A 是______,cDNA 文库______(大于/小于)人的基因组文库。 (2)过程④用到的工具酶是______________,过程⑤需先用____________________处理受体 细胞,过程⑥通常采用________技术。 (3)过程⑧和⑨的关键技术分别是________、________。 (4)基因工程的核心步骤是图中的________________(填标号)。
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题组三综合题 6.(2011· 安徽理综 31)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。 将人干扰素基因导入家蚕细胞 并大规模培养,可提取干扰素用于制药。 (1)进行转基因操作前,需用________酶短时处理幼蚕组织,以便获得单个细胞。 (2)为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达,需要把来自 cDNA 文库的干扰素基因片段正确 插入表达载体的________和________之间。 (3)采用 PCR 技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。 PCR 反应体系的主要成分应 该 包含:扩增缓冲液(含 Mg2+)、水、4 种脱氧核糖核苷酸、模板 DNA、________和________。 (4)利用生物反应器培养家蚕细胞时,贴壁生长的细胞会产生接触抑制。通常将多孔的中空 薄壁小玻璃珠放入反应器中, 这样可以________, 增加培养的细胞数量, 也有利于空气交换。 7. (2010· 天津理综, 7Ⅰ)下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。 图中 tetR 表示四环素抗性基因,ampR 表示氨苄青霉素抗性基因,BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ直线所示 为三种限制酶的酶切位点。

据图回答问题。 (1)图中将人乳铁蛋白基因插入载体,需用________________限制酶同时酶切载体和人乳铁 蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含________的培养基上进行。 (2)能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是________(填字母代号)。 A.启动子 B.tetR C.复制原点 D.ampR (3)过程①可采用的操作方法是________(填字母代号)。 A.农杆菌转化 B.大肠杆菌转化 C.显微注射 D.细胞融合 (4)过程②采用的生物技术是________________。 (5)对早期胚胎进行切割,经过程②可获得多个新个体。这利用了细胞的________性。 (6)为检测人乳铁蛋白是否成功表达,可采用________(填字母代号)技术。 A.核酸分子杂交 B.基因序列分析 C.抗原—抗体杂交 D.PCR 8.(2009· 上海卷)人体细胞内含有抑制癌症发生的 P53 基因,生物技术可对此类基因的变化 进行检测。

(1)目的基因的获取方法通常包括________和________。 (2)上图表示从正常人和患者体内获取的 P53 基因的部分区域。与正常人相比,患者在该区 域的碱基会发生改变,在上图中用方框圈出发生改变的碱基对,这种变异被称为________。 (3)已知限制酶 E 识别序列为 CCGG,若用限制酶 E 分别完全切割正常人和患者的 P53 基因 部分区域(见上图),那么正常人的会被切成________个片段,而患者的则被切割成长度为

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________对碱基和________对碱基的两种片段。 (4)如果某人的 P53 基因部分区域经限制酶 E 完全切割后,共出现 170、220、290 和 460 个 碱基对的四种片段, 那么该人的基因型是________(以 P+表示正常基因, P-表示异常基因)。 9.(2009· 福建卷)转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有 PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、 ApaⅠ等四种限制酶切割位点。请回答下列问题。

(1)构建含抗病基因的表达载体 A 时,应选用限制酶________,对________进行切割。 (2)培养板中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长,欲利用该培养基筛选已导入抗病 基因的香蕉细胞,应使基因表达载体 A 中含有________,作为标记基因。 (3)香蕉组织细胞具有________,因此,可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织 细胞培育成植株。图中①、②依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的________。 高考真题体验 1.(2012 浙江高考6)天然的玫瑰没有蓝色花,这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因 B, 而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因 B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰,下列操作正 确的是( ) A.提取矮牵牛蓝色花的 mRNA,经逆转录获得互补的 DNA,再扩增基因 B B.利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因 B C.利用 DNA 聚合酶将基因 B 与质粒连接后导入玫瑰细胞 D.将基因 B 直接导入大肠杆菌,然后感染并转入玫瑰细胞 2. (2012 高考全国新课标卷 40)根据基因工程的有关知识,回答下列问题: (1)限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段,其末端类型有 和 。 (2)质粒运载体用 EcoRⅠ切割后产生的片段如下:

为使运载体与目的基因相连,含有目的基因的 DNA 除可用 EcoRⅠ切割外,还可用另一种 限制性内切酶切割,该酶必须具有的特点是 。[来源:z#zs#tep.com] (3)按其来源不同,基因工程中所使用的 DNA 连接酶有两类,即 DNA 连接酶 和 DNA 连接酶。 (4)反转录作用的模板是 ,产物是 。若要在体外获得大量反转录产物,常采 用 技术。 (5)基因工程中除质粒外, 和 也可作为运载体。 (6)若用重组质粒转化大肠杆菌,一般情况下,不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细 胞,原因是 。 3.(2012 福建高考32)现代生物科技专题。肺细胞中的 let-7 基因表达减弱,癌基因 RAS 表 达增强,会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将 let-7 基因导入肺癌细胞实验表达,发 现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图1。

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请回答: (1)进行过程①时,需用 酶切开载体以插入 let-7 基因。载体应用 RNA 聚合酶识 别和结合的部位,以驱动 let-7 基因转录,该部位称为 。 (2)进行过程②时,需用 酶处理贴附在培养皿壁上的细胞,以利于传代培养。 (3)研究发现,let-7 基因能影响 RAS 的表达,其影响机理如图2。据图分析,可从细胞 提取 进行分子杂交,以直接检测 let-7 基因是否转录。肺癌细胞增殖受到抑制,可能 是由于细胞中 (RASmRNA/RAS 蛋白)含量减少引起的。 4. (2012 天津高考 7)生物分子间的特异性结合的性质广泛用于生命科学研究。以下实例为 体外处理“蛋白质-DNA 复合体”获得 DNA 片段信息的过程图。

据图回答: (1)过程①酶作用的部位是 键,此过程只发生在非结合区 DNA,过程② 酶作用的部位是 键。 (2)①、②两过程利用了酶的 特性。 (3)若将得到的 DNA 片段用于构建重组质粒,需要过程③的测序结果与 酶的 识别序列进行对比,以确定选用何种酶。 (4)如果复合体中的蛋白质为 RNA 酶聚合,则其识别、结合 DNA 序列位基因的 。 (5)以下研究利用了生物分子间的特异性结合的有 (多选) A.分离得到核糖体,用蛋白酶酶解后提取 rRNA B.用无水乙醇处理菠菜叶片,提取叶绿体基粒膜上的光合色素 C.通过分子杂交手段,用荧光物质标记的目的基因进行染色体定位 D.将抑制成熟基因导入番茄,其 mRNA 与催化成熟酶基因的 mRNA 互补结合,终止后者 翻译,延迟果实成熟。 5. (2012 江苏高考 32)图 1 表示含有目的基因 D 的 DNA 片段长度(bp 即碱基对)和部分碱 基序列,图 2 表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有 Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4 种限制性核酸内切酶, 它们识别的碱基序列和酶切位点分别为 C↓CGG、 G↓GATCC、 ↓GATC、 CCC↓GGG。请回答下列问题

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(1)图 1 的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由 连接。 (2)若用限制酶 SmaI 完全切割图 1 中 DNA 片段,产生的末端是 末端,其产物长度 为 。 (3)若图 1 中虚线方框内的碱基对被 T-A 碱基对替换,那么基因 D 就突变为基因 d。从杂 合子中分离出图 1 及其对应的 DNA 片段,用限制酶 Sma I 完全切割,产物中共有 种不 同长度的 DNA 片段。 (4)若将图 2 中质粒和目的基因 D 通过同种限制酶处理后进行连接,形成重组质粒,那么 应选用的限制酶是 。在导入重组质粒后,为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌,一般需要 用添加 的培养基进行培养。经检测,部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因 D 不能正确表达,其最可能的原因是 。 6.(2011· 四川理综,5)北极比目鱼中有抗冻基因,其编码的抗冻蛋白具有 11 个氨基酸的重 复序列,该序列重复次数越多,抗冻能力越强。下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意 图,有关叙述正确的是( )。

A.过程①获取的目的基因,可用于基因工程和比目鱼基因组测序 B.将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因,不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白 C.过程②构成的重组质粒缺乏标记基因,需要转入农杆菌才能进行筛选 D.应用 DNA 探针技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达 7.(2011 ?浙江)将 ada(腺苷酸脫氨酶基因)通过质粒 pET28b 导人大肠杆菌并成功表达腺 苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是( ) A.每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒 B.每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点 C.每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个 ada D.每个插入的 ada 至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子 8.(2010· 全国Ⅱ,5)下列叙述符合基因工程概念的是( )。 A.B 淋巴细胞与肿瘤细胞融合,杂交瘤细胞中含有 B 淋巴细胞中的抗体基因 B.将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌,获得能产生人干扰素的菌株 C.用紫外线照射青霉菌,使其 DNA 发生改变,通过筛选获得青霉素高产菌株 D.自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其 DNA 整合到细菌 DNA 上 9.(2010· 浙江理综,2)在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中,下列操作错误 的是( )。
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A.用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸 B.用 DNA 连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体 C.将重组 DNA 分子导入烟草原生质体 D.用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞 10.(2010· 江苏卷)下列关于转基因植物的叙述,正确的是( )。 A.转入到油菜的抗除草剂基因,可能通过花粉传入环境中 B.转抗虫基因的植物,不会导致昆虫群体抗性基因频率增加 C.动物的生长激素基因转入植物后不能表达 D.如转基因植物的外源基因来源于自然界,则不存在安全性问题 11.(2009· 浙江卷)下列关于基因工程的叙述,错误的是( )。 A.目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物 B.限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶是两类常用的工具酶 C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性 D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组 DNA 的细胞和促进目的基因的表达

学案

DNA 重组技术的基本工具

和基因工程的基本操作程序 答案与解析
基础自查 一.基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外 DNA 重组和转基因技术,赋予 生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在 DNA 分子水平上进行设计和施工的,又叫做 DNA 重组技术。 二.基因工程的基本工具 1.限制性核酸内切酶(限制酶) (1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2)功能:能够识别双链 DNA 分子的某种特定的核苷酸序列,并使每一条链中特定部位 的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,具有专一性。 (3)结果:产生的 DNA 片段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端。 2. DNA 连接酶 (1)两种 DNA 连接酶(E· coliDNA 连接酶和 T4-DNA 连接酶)比较: ①相同点:都缝合磷酸二酯键。 ②区别:E· coliDNA 连接酶来源于 T4 噬菌体,只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间 的磷酸二酯键连接起来;而 T4DNA 连接酶能缝合两种末端,但连接平末端的之间的效率较 低。 (2)与 DNA 聚合酶作用的异同: DNA 聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键。DNA 连接 酶是连接两个 DNA 片段的末端,形成磷酸二酯键。 3.载体 (1)载体具备的条件:①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点,供外源 DNA 片段插入。
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③具有标记基因,供重组 DNA 的鉴定和选择。 (2)最常用的是质粒, 其它载体: 噬菌体的衍生物、动植物病毒 三.基因工程的基本操作程序 第一步:目的基因的获取 1. 反转录法和化学合成法 2.PCR 技术扩增目的基因 (1)原理:DNA 双链复制 (2)过程:: DNA 解链;引物结合到互补 DNA 链,热稳定 DNA 聚合酶从引物起始互补 链的合成。 第二步:基因表达载体的构建 1.目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达 和发挥作用。 2.组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因 (1)启动子:是 RNA 聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出 mRNA,最终获得所 需的蛋白质。 (2)终止子:也是一段有特殊结构的 DNA 片段 ,位于基因的尾端。 (3) 鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标 记基因是抗生素基因。 第三步:将目的基因导入受体细胞 2.常用的方法: a、 农杆菌转化法 基因枪法和 花粉管通道法等。 b、 显微注射技术 受精卵。 C、 大肠杆菌 先用 Ca2+ 处理细胞,使其成为感受态细胞 ,再将重组表 达载体 DNA 分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收 DNA 分子,完成转化过程。 第四步:目的基因的检测和表达 1.转基因生物的染色体 DNA 上是否插入了目的基因 DNA 分子杂交技术。 2.目的基因是否转录出了 mRNA 用标记的目的基因作探针与 mRNA 杂交。 3.目的基因是否翻译成蛋白质 转基因生物中提取蛋白质 抗体进行抗原-抗 体杂交。 4.个体生物学水平的鉴定。 课堂深化探究 一.对基因工程概念的理解 别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 与杂交育种相比 与诱变育种相比 原理 二.基因工程的基本操作工具 1.与 DNA 分子相关的酶
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基因拼接技术或 DNA 重组技术 生物体外 基因 DNA 分子水平 剪切→拼接→导入→表达 人类需要的基因产物 克服远缘杂交不亲和的障碍 定向改造生物性状 基因重组

(1)几种酶的比较 种类 项目 作用底物 作用部位 限制酶 DNA 分子 磷酸二酯键 切割目的基因及 载体,能专一性 识 别 双链 DNA 分子的某种特定 的核苷酸序列, 并且使每一条链 中特定部位的两 个核苷酸之间的 磷酸二酯键断开 形成黏性末端或 平末端 DNA 连接酶 DNA 分子片段 磷酸二酯键 DNA 聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 解旋酶 DNA 分子 碱基对间的氢键

作用特点

将双链 DNA 片 段“缝合”起来, 恢复被限制酶切 开了的两个核苷 酸之间的磷酸二 酯键

只能将单个脱氧 核苷酸添加到脱 氧核苷酸链上

将 DNA 两条链之 间的氢键 打开

作用结果 (2)

形 成 重 组 DNA 分子

形 成 新的 DNA 分子

形成单链 DNA 分子

① 原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 ②DNA 连接酶起作用时不需要模板。 2.载体 (1)①作为运载工具,将目的基因转移到宿主细胞内。 ②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。 (2) ①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。 ②有多个限制酶切割位点,以便与外源基因连接。 ③具有特殊的标记基因,以便进行筛选。 (3)①质粒:一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核 DNA 之外,能够自我复制的很小的双 链环状 DNA 分子。 ②λ 噬菌体的衍生物。 ③动植物病毒。 三.基因工程操作程序 1.(1)目的基因的获取途径 ①从自然界中已有的物种中分离出来,如从基因组文库或 cDNA 文库中获取。 ②人工合成目的基因 常用的方法有反转录法和化学合成法。 ③利用 PCR 技术扩增目的基因 通过 PCR 技术可对已获取的目的基因进行扩增,以获取大量的目的基因。 (2)基因表达载体的构建

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(3)将目的基因导入受体细胞(转化) 生物种类 常用方法 受体细胞 植物细胞 农杆菌转化法 体细胞 将目的基因插入 Ti 质粒 的 T? DNA 上→农杆菌 →导入植物细胞→整合 到受体细胞的 DNA 上→ 表达 检测内容 导入检测 分子 检测 转录检测 翻译检测 目的基因是否进入受体细 胞 目的基因是否转录出 mRNA 目的基因是否翻译成蛋白 质 动物细胞 显微注射技术 受精卵 将含有目的基因的表达 载体提纯→取卵(受精 卵)→显微注射→受精卵 发育→获得具有新性状 的动物 方 法 微生物细胞 Ca2+处理法 原核细胞 Ca2+处理细胞→感受态 细胞→重组表达载体 DNA 分子与感受态细胞 混合→感受态细胞吸收 DNA 分子 结果显示 杂交带 杂交带 杂交带

转化过程

(4)目的基因的检测与鉴定 类 型 DNA 分 子 杂 交 (DNA 和 DNA 之间) 分子杂交(DNA 和 mRNA 之间) 抗原—抗体杂交

个体水平检测

包括做抗虫、抗病的接种实验,以确定是否有抗性以及抗性的程度;对 基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较, 以确定功能活性是否相 同

对应训练 1.【解析】①基因工程中有 3 种工具,但工具酶只有 2 种。②工具酶本质为蛋白质,载体本 质为小型 DNA 分子,但不一定是环状。③标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导 入受体细胞,常见的有抗生素抗性基因、发光基因,表达产物为带颜色物质等。④受体细胞 中常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物—— 大肠杆菌、酵母菌等。一般不用支原体,原因是它营寄生生活;一定能用哺乳动物成熟红细 胞,原因是它无细胞核,不能合成蛋白质。 【答案】D 2.解析 考查基因工程中工具酶的有关知识。限制性核酸内切酶的化学成分是蛋白质,它的 活性受到温度和 pH 的影响;限制性核酸内切酶的特点是能识别双链 DNA 中特定的核苷酸 序列,可在特定的位点进行切割,但不能识别和切割 RNA;限制性核酸内切酶主要是从原 核生物体内分离出来的。 答案 C 解析 图示过程为基因表达载体的构建过程, 是基因工程中的核心步骤。 构建过程中需要将 目的基因完整切割下来,此时要用到限制酶 PstⅠ、EcoRⅠ。抗卡那霉素基因是标记基因, 目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子 和标记基因等。 答案 B
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4.【解析】过程①中通过逆转录法获得的目的基因,可用于基因工程,但该目的基因中不存 在内含子和非编码序列, 因此不能用于比目鱼的基因组测序; 将多个抗冻基因编码区相连形 成的能表达的新基因可能不再是抗冻基因;利用农杆菌的目的是将重组质粒导入受体细胞, 而不是筛选重组质粒; 应用 DNA 探针技术, 可以检测受体细胞中是否成功导入了目的基因, 但不能检测目的基因是否完全表达。 【答案】B 限时训练 题组一 基因工程及基本操作 1.答案:(1)人工 胰岛素原目的 (2)胰岛素原信使 RNA 逆转录 (3)重组 胰岛素原 (4) 将重组 DNA 分子导入受体细胞 解析:本题是对基因工程操作程序的考查。操作时,首先要获取目的基因,然后让目的基因 与载体结合构建成重组 DNA 分子,再通过一定方法把重组 DNA 分子导入受体细胞使其扩 增和表达 2.C [限制酶可在特定位点对 DNA 分子进行切割;DNA 聚合酶在 DNA 分子复制时将脱 氧核苷酸连接成脱氧核苷酸链;DNA 连接酶可将限制酶切开的磷酸二酯键连接在一起;解 旋酶的作用是将 DNA 双链解开螺旋,为复制或转录提供模板。] 3.ACD [基因工程经常以抗菌素抗性基因为标记基因;质粒是基因工程常用的运载体;通 常用同一种限制酶切割目的基因和运载体, 以获得相同的黏性末端; 受体细胞可以是受精卵, 也可以是体细胞。D.为培育成抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵 为受体 题组二 基因工程的操作程序 4.解析 本题极易出错的部分有:在第(1)小题中没有看清目的基因插入的位置,从而不能确 定用限制酶Ⅰ还是Ⅱ来切割质粒还是切割抗虫基因。第(3)小题检测抗虫性状在个体水平上 是否表达, 应该让害虫吞食转基因棉花的叶片, 观察害虫的存活情况, 这个地方也有出错的, 主要没有看清是在哪个水平上进行检测的。 在切割质粒时应遵循一个原则:不能同时将两个标记基因切开,至少保留一个,所以只能用 酶Ⅱ切割,而从目的基因两侧碱基序列可知,只能用酶Ⅰ才得到含目的基因的 DNA 片段。 如果导入了重组质粒, 此时重组质粒中四环素抗性基因能正常表达, 而氨苄青霉素抗性基因 已被破坏,所以涂布在含有四环素的培养基上,能够生长的话,说明导入了重组质粒(普通 质粒)。如果把携带一个抗虫基因的 DNA 片段看作杂合子,可以认为是 Aa,自交产生的 F1 3 中仍具有抗虫特性的植株占总数的比例为 。把一个细胞培养成一个植株的技术称为植物组 4 织培养。 答案 (1)Ⅱ Ⅰ (2)四环素 (3)让害虫吞食转基因棉花的叶片,观察害虫的存活情况,以 3 确定其是否具有抗虫性状 (4)植物组织培养 发育成完整个体的全部遗传物质 4 解析 (1)cDNA 来自 mRNA 的逆转录或根据 mRNA 的碱基序列人工合成,cDNA 文库小于 基因组文库。(2)构建基因表达载体用到限制酶和 DNA 连接酶。将目的基因导入大肠杆菌须 用 Ca2+处理受体细胞;导入动物细胞用显微注射法。(3)过程⑧的关键技术是胚胎移植,过 程⑨的关键技术是细胞核移植。(4)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建,即④。 题组三综合题 6.解析 本题综合考查基因工程、细胞工程和 PCR 技术,意在考查考生对基础知识的理解。 胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理可以将动物组织分解成单个细胞; 基因表达载体包括启动子、 目 的基因、终止子、标记基因等,其中启动子和终止子有利于目的基因的表达,标记基因有利

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于目的基因的检测;PCR 技术中需要原料(4 种脱氧核苷酸)、缓冲液、模板 DNA、引物和耐 热 DNA 聚合酶等;在生物反应器中放入多孔的中空薄壁小玻璃珠的目的:一方面有利于细 胞的贴壁生长,避免接触抑制;另一方面有利于气体交换。 答案 (1)胰蛋白(或胶原蛋白) (2)启动子 终止子 (3)对干扰素基因特异的 DNA 引物对 TaqDNA 聚合酶 (4)扩大细胞贴壁生长的附着面积 7.解析 (1)由图示可知: 需用 HindⅢ和 BamHⅠ限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因, 因 酶切后 tetR 四环素抗性基因结构被破坏而 ampR 氨苄青霉素抗性基因结构完好,故用含氨 苄青霉素的选择培养基可筛选含有重组载体的大肠杆菌。(2)启动子是一段特殊的 DNA 序 列,是 RNA 聚合酶识别和结合的位点,可调控基因的特异性表达。(3)过程①表示把重组载 体导入受体细胞的过程,当受体细胞为动物细胞时,常采用显微注射法。(4)过程②表示把 早期胚胎移植到代孕母牛子宫的过程,属于胚胎移植技术。(5)经过程②得到新个体是细胞 全能性的体现。(6)人乳铁蛋白基因是否成功表达,关键看是否有其表达产物即人乳铁蛋白, 可用抗原—抗体杂交法检测该蛋白是否存在。 答案 (1)HindⅢ和 BamHⅠ 氨苄青霉素 (2)A (3)C (4)胚胎移植技术 (5)全能 (6)C 8.解析 本题主要考查基因工程相关知识。 (1)目的基因的获取方法有直接分离和化学方法人工合成两种;(2)仔细对比正常人与患者的 基因序列可知是 CG 碱基对变为了 TA 碱基对,这种变化属于基因突变;(3)正常人 P53 基因 有两个限制酶 E 的识别序列, 完全切割后可产生三个片段, 患者 P53 基因中有一个限制酶 E 的识别序列发生突变,且突变点位于识别位点内,这样患者就只有一个限制酶 E 的识别序 列,切割后产生两个片段,分别为 290+170=460 对碱基,220 对碱基;(4)正常人的 P53 基因经限制酶 E 完全切割后产生三个片段,290 对碱基、170 对碱基和 220 对碱基,患者产 生两个片段 460 对碱基和 220 对碱基,则该人的基因型应为 P+P-。 答案 (1)从细胞中分离 通过化学方法人工合成 (2)见下图

基因碱基对的替换(基因突变) (3)3 460 220 (4)P+P- 解析 本题考查基因工程的有关知识。(1)从图可看出,只有 PstⅠ、EcoRⅠ两种酶能保持抗 病基因结构的完整性,所以构建含抗病基因的表达载体 A 时,应选用限制酶 PstⅠ、EcoRⅠ 两种酶,对抗病基因的 DNA 和质粒进行切割。 (2)卡那霉素能抑制香蕉愈伤组织细胞的生长,欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉 细胞,应使基因表达载体 A 中含有抗卡那霉素基因,以此作为标记基因。 (3)香蕉组织细胞具有全能性,因此,可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细 胞培育成植株。图中①、②依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的脱分化和再分化。 答案 (1)PstⅠ、EcoRⅠ 含抗病基因的 DNA、质粒 (2)抗卡那霉素基因 (3)全能性 脱分化、再分化 高考真题体验

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1.【答案】A 【解析】提取矮牵牛蓝色花的 mRNA,逆转录得到 DNA,然后扩增,可获得大量的基因 B, A 正确; 从基因文库中获取目的基因, 只要根据目的基因的相关信息和基因文库中的信息进 行筛选对比即可,不需要用限制酶进行切割,B 错误;目的基因与质粒的连接需要用 DNA 连接酶,而不是 DNA 聚合酶,C 错误;目的基因需要和运载体连接后形成重组质粒再导入, 而且应该用农杆菌进行感染,而不是大肠杆菌,D 错误。 2.【答案】 (1)黏性末端 平末端 (2)切割产生的 DNA 片段末端与 EcoRⅠ切割产生的相同 (3)E· coli T4 (4)mRNA(RNA) cDNA (DNA) PCR (5)噬菌体 动植物病毒等 (6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源 DNA)的能力极弱 【解析】(1)当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将 DNA 的两条链分别切开时,产生 的是黏性末端,而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时,产生的则是平末端。 (2)为使运载体与目的基因相连,不同的限制酶应切割出相同的黏性末端,它们必须要能 识别相同的核苷酸序列,并且使每条链中相同的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 (3)DNA 连接酶,根据酶的来源不同,可以将这些酶分为两类:一类是从大肠杆菌中分离 得到的,称为 E· DNA 连接酶;另一类是从 T4 噬菌体中分离出来的,称为 T4DNA 连接 coli 酶。 (4)反转录是以 RNA 为模版来合成 DNA 的过程。可以在体外短时间内大量扩增 DNA 的 技术叫 PCR(多聚酶链式反应) (5)基因工程中除质粒外,还有 λ 噬菌体的衍生物、动植物病毒等。 (6) 大肠杆菌细胞外有细胞壁和细胞膜, 能阻止其他物质的进入, 只能通过 Ca2+处理细胞, 使细胞处于能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。 3.【答案】(10 分) (1)限制性核酸内切酶(或限制) 启动子 (2)胰蛋白 (3)RNA RAS 蛋白 【解析】(1)过程①表示基因表达载体的构建,在该过程中需要用限制酶对载体进行切割 以便于目的基因的插入(限制性核酸内切酶,简称限制酶,写其他的不得分);启动子是一 段特殊的 DNA 序列,是 RNA 聚合酶结合和识别的位点,RNA 聚合酶结合到该位点,可驱 动转录过程。 (2)过程②表示动物细胞培养,培养过程中出现接触抑制后可以用胰蛋白酶处理,使之分 散成单个的细胞,之后分装到其他培养瓶里面进行传代培养。 (3) 判断目的基因是否在受体细胞中转录, 可用分子杂交技术来进行, 从细胞中提取 mRNA 和用放射性同位素或者荧光标记的目的基因单链 DNA 片段进行杂交。根据题中信息“肺组 织细胞中的 let-7 基因表达减弱,癌基因 RAS 表达就增强,引发肺癌”导入 let7 基因后,肺 癌细胞受到抑制,说明 RAS 基因表达减弱,导致细胞中的 RAS 蛋白质含量减少进而导致癌 细胞受抑制。 4【答案】(1)磷酸二酯键,肽键 (2)专一 (3)限制性核酸内切酶 (4)启动子

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(5)ACD 【解析】(1)DNA 酶作用的部位是 DNA 的磷酸二酯键,蛋白酶作用的部位是肽键。 (2)①②过程利用了各种酶催化一种或一类化学反应的特性,即专一性。 (3)DNA 要构建重组质粒,需要用限制性核酸内切酶切割,再与质粒重组。 (4)RNA 聚合酶识别和结合在基因的启动子上,驱动基因转录。 (5)蛋白酶能特异性的酶解蛋白质,分子杂交手段也是利用各物质分子结合的特异性,抑 制成熟基因转录出的 mRNA 与催化成熟酶基因的 mRNA 碱基互补结合,也具有特异性,光 和色素易溶于有机溶剂,与酒精并不是特异性的溶解,所以选 ACD。 5.【答案】(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖 (2)平 537bp、790bp、661bp (3)4 (4)BamH I 抗生素 B 同种限制酶切割形成的末端相同,部分目的基因 D 与质粒 反向链接 【解析】(1)DNA 单链中相邻两个碱基之间通过“脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖”连接。 (2)Sma I 识别的序列为 GGGCCC,切割后会产生平末端;图 1 所示的 DNA 分子中含有 两个 Sma I 的识别位点,第一个识别位点在左端 534bp 序列向右三个碱基对的位置;第二个 识别位点在右端 658bp 序列向左三个碱基对的位置,从这两个位点切割后产生的 DNA 片段 长度分别为 534+3, 796-3-3, 658+3, 即得到的 DNA 片段长度分别为 537bp、 790bp 和 661bp。 (3)在杂合子体内含有基因 D 和基因 d,基因 D 的序列中含有两个识别位点,经过 SmaI 完全切割会产生 537bp、790bp 和 661bp 三种不同长度的片段,基因 d 的序列中含有一个识 别位点,经过切割后会产生 1327bp 和 661bp 两种长度的片段,综上,杂合子中分离到该基 因的 DNA 片段经过切割后会产生 4 种不同长度的片段。 (4) 能够获取目的基因并切开质粒的限制酶有识别序列为 GGATCC 的 BamH I 和识别序列 为 GATC 的 Mbo I,若使用 Mbo I 会同时破坏质粒中的抗生素 A 抗性基因和抗生素 B 抗性 基因,所以要用 BamH I 来切割目的基因和质粒,切割后保留了完整的抗生素 B 抗性基因, 便于筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。 因为目的基因和运载体是用同种限制酶切割的, 目的 基因两端的末端和质粒切割后的两个末端都能进行互补, 可能出现目的基因反向连接在运载 体上的情况,导致基因 D 不能正确表达。 6.解析 将多个抗冻基因编码区相连成能表达的新基因,合成的蛋白质为新的蛋白质,不能 得到抗冻性增强的抗冻蛋白,故选项 B 正确;过程①是利用反转录法合成目的基因,由于 没有非编码区和编码区中的内含子,不能用于比目鱼基因组测序;用作载体的质粒,必须具 有标记基因才能便于检测和筛选;应用 DNA 探针技术,可检测转基因抗冻番茄中目的基因 的存在和转录,但不能检测是否成功表达,故选项 A、C、D 错误。 答案 B 7.【解析】受体大肠杆菌成功表达腺苷酸脱氨酶,说明每个大肠杆菌细胞至少含有一个重组 质粒,且每个 ada 至少指导合成一个腺苷酸脱氨酶分子。重组质粒的形成需先用限制性核酸 内切酶切割目的基因和质粒形成相同的黏性末端,再在 DNA 连接酶的作用下连接起来,连 接起来的序列中会 含有限制性核酸内切酶的识别位点。不同的限制性核酸内切酶识别位点 不同,不是每个限制性核酸内切酶的识别位点都能插入 ada,C 项错误。 【答案】C 8.解析 基因工程是在生物体外,通过对 DNA 分子进行人工“剪切”和“拼接”,对生物的基 因进行改造和重新组合, 然后导入受体细胞内进行无性繁殖, 使重组基因在受体细胞内表达, 产生出人类所需要的基因产物。所以 B 为基因工程,而 A 为动物细胞工程,C 为诱变育种, D 无人为因素不属于基因工程。 答案 B
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9.解析 限制性核酸内切酶用于提取目的基因和切割载体,烟草花叶病毒的遗传物质是 RNA,不能用限制性核酸内切酶切割,A 项错误;DNA 连接酶可以连接具有相同黏性末端 的目的基因和载体,B 项正确;受体细胞可以是受精卵和体细胞,也可以是去除细胞壁的原 生质体,C 项正确;目的基因为抗除草剂基因,所以未成功导入目的基因的细胞不具有抗除 草剂的能力,筛选时应该用含除草剂的培养基筛选转基因细胞,D 项正确。 答案 A 10.解析 抗除草剂基因导入到油菜的染色体后则可以通过花粉传入环境中;转抗虫基因的 植物可杀死无抗性昆虫, 对昆虫的抗性具有选择作用, 所以会导致昆虫群体抗性基因频率增 加;转基因技术打破了生殖隔离,动物的生长激素基因转入植物后可以表达;来源于自然界 的目的基因导入植物体后,可能破坏原有的基因结构,具有不确定性,外源基因也可能通过 花粉传播,使其他植物成为“超级植物”等,所以转基因技术存在着安全性问题。 答案 A 11.解析 载体上的抗性基因有利于筛选含重组 DNA 的细胞, 但由于它和目的基因是相互独 立的,并不能促进目的基因的表达。 答案 D

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