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定量蛋白组学技术


定量蛋白质组学技术 摘要:定量蛋白质组学可以解析蛋白的表达水平,从而寻找差异蛋白,对一些疾病的早期诊 断有辅助作用。 定量蛋白质组学技术的发展是此事业的重点, 现今主要致力于凝胶电泳和同 位素标记质谱的定量技术发展, 而新兴的无标记定量技术也占有一定的地位。 基于各种技术 的优缺点, 人们根据所做的实验特点选择适合自己的定量方法, 或者将几种方法结合进行互 补,以求可以得到更准确的结果。 关键词:定量蛋白质组学;电泳;同位素标记;互补 在阿尔兹海默症研究中, 寻找差异表达蛋白可以帮助早期诊断, 而寻找差异表达蛋白需要对 蛋白进行定性和定量分析, 对定性的蛋白进行定量分析可以解析蛋白的表达水平, 从而提供 了辅助诊断的依据。随着研究的需求,蛋白定量分析已经发展为一门学科,可以把一个基因 组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。 现今的定 量蛋白质组学技术主要有两种,一是基于凝胶,二是基于质谱[1]。 基于凝胶的定量蛋白质技术中,最经典的是双向电泳,第一向按蛋白质的等电点进行分离, 第二向则按蛋白质的分子量分离。双向电泳最早应用于 E.coli 的蛋白定量,分离出 1000 个 蛋白左右[2]。双向电泳之所以称之为经典,是因它拥有诸多优势,一是应用的范围广,适 合用于各类材料;二是成本较低廉,无论是分析少量的样本,还是分析大量的样本,都比较 经济可行;三是出现的早,人们习惯使用且经验足;四是跟上时代的发展,自身在不断的优 化, 等等。 其中双向电泳的优化是让人们对双向电泳热爱的重点, 早期有 PH 梯度的优化 (载 体两性电解质 pH 梯度和固相 pH 梯度等) 、染色法的优化(考马斯亮蓝、银染、负染和荧光 法) ;后期预制胶的优化;缓冲液的优化,例如 2011 年,Domenico 等[3]用含有 4.5%碘乙酰 胺代替缓冲液中的二硫苏糖醇;有结合的优化,特别是与新兴的生物信息学结合,体现出诸 多优势,慢慢成为人们的关注重点[4]。 双向电泳中的荧光染色法因其更高的动力学范围和灵敏性,又被另称为双向差异凝胶电泳, 最早是由 UenlueM 等[5]使用的。双向差异凝胶电泳使用半胱氨酸来标记样品,并与多重荧 光分析结合,可以同时在同一块胶上分离不同荧光标记的样品,提高了重复性和灵敏度,同 时可以满足高通量的蛋白质分析。另外,在双向差异凝胶电泳技术中,每个蛋白点都有它自 己的内标, 并且软件全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准。 双向差异凝胶电泳 基于自身的优点, 很有发展前景, 荧光染料和相应扫描仪的成本太高, 限制了它的广泛使用, 这也是其它染色法仍被使用的重要原因。 其它方法也有自身的优缺点,考马斯亮蓝染色法的操作过程简单,而且无毒,但是染色时间 长;银染法的成本较低,灵敏度也高,但是银染过程中会发生醛类的特异反应,给后续的实 验带来少许困难;负染法中有增敏步骤,可以提高灵敏度,但是由于染色后的蛋白斑点颜色 太浅,手动切割蛋白质斑点有一些困难,若用自动切胶机,确实可以解决问题,又会提高实 验成本。基于每种染色的优缺点,人们会根据样品的种类和资金等因素选择合适的方法。 另一种定量蛋白质技术是基于质谱的技术,比较常用的是同位素编码的亲和标签(ICAT) 。 同位素编码的亲和标签是对蛋白质进行同位素标记, ICAT 试剂的羰基基团能够特异性地与半 胱氨酸侧链反应,使这些蛋白在分离时具有相同的特性,随后与质谱串联,根据质量的差异 进行区分,并进行定量。这种方法最早是由 Gygi[6]发明的。这种方法有大量的优点,一是 样品之间可以互为内部参照标准;二是烷基化反应高度特异;三是解决溶解问题,可以对膜 蛋白进行定量;四是对低丰度的蛋白的定量较好,等等。但是,存在一个特别重要的缺点, 就是对不含半胱氨酸的蛋白质无法分析。 为了使同位素编码的亲和标签技术有更广泛的使用, 不少人在这上面花费了大量时间,改进此技术,例如固相同位素标记亲和标签技术、可裂解

同位素标记亲和标签技术和同位素标记相对定量和绝对定量技术等等。 其中同位素标记相对定量和绝对定量技术(iTRAQ)是一种新且强的技术,与氨基酸 N 端及 赖氨酸侧链连接[7],在质谱中,由于平衡基因的存在,标记的蛋白表现出相同的质荷比, 随后失去平衡基因,不同的蛋白被分离且定量。它作为一种强大的定量技术,拥有大量的优 点,一是一次可以分析 8 个样本;二是与质谱串联,提高了灵敏度、降低了检测限;三是分 析时间短。但是,一个较大的缺点是成本高。 凝胶电泳是根据蛋白点的光密度值来进行差异定量, 同位素标记是比较同种蛋白经同位素标 记的串联质谱峰面积来进行差异定量。 这两种技术虽然常用, 但是样品的处理很费时, 因此, 人们为了解决这个问题,开发了无标记的质谱定量方法——Label-free,这种方法只需分析 大规模鉴定蛋白时所产生的质谱数据,用蛋白相应肽段的质谱数据就可进行定量[8]。 作为两种新兴的技术 iTRAQ 和 Label-free,虽然有一些缺点,却很大的发展前景,人们做了 大量的对比实验来对这两种技术作进一步的研究, 试图可以找到突破口, 进一步提升技术水 平。2009 年,Brozek 等[9]对革兰氏阳性菌进行研究,发现 Label-free 的检测速度更快和需要 的蛋白量较少。2012 年,Wang 等[10]对莱茵衣藻进行研究,发现 Label-free 的灵敏度较高, 但是精确度较低。通过对比实验人们得到一些改进想法,例如;Maciej 等[11]合成双标记肽 (18O 和丹磺酰基)来进行定量。 虽然在不断开发新技术,但是,依旧没有出现可以完败所有定量技术的新技术,多种定量技 术依旧被人们使用着, 人们根据所做的实验特点选择适合自己的定量方法, 或者将几种方法 结合进行互补,以求可以得到更准确的结果。 参考文献 [1] 李维平.蛋白质组学[M].北京:中国农业出版社,2009. [2] Pateick H, O’Farrell. High Resolution Two-Dimensional Electrophoresis of Proteins[J]. J Biol Chem. 1995, 250(10): 4007-4021. [3] P. Pomastowski, B. Buszewski. Two-dimensional gel electrophoresis in the light of new developments[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2014, 53: 167-177. [4] Fabio Di Domenico, Rukhsana Sultana, Eugenio Barone, et al. Quantitative proteomics analysis of phosphorylated proteins in the hippocampus of Alzheimer's disease subjects[J]. Journal of Proteomics, 2011, 74(7): 1091-1103. [5] UenlueM, MorganM E, M inden J S. Difference gel electrophoresis: a single method for detecting changes in protein extracts[J]. Electrophoresis, 1997, 18: 2071-2077. [6] Gygi SP., Rist B, Gerber SA, et al. Quantitative analysis of complex protein mixturea using isotope-coded affinity tags[J]. Nat Biotechnol, 1999, 17(10): 994-999. [7] Ross PL, Huang YN, Marchese JN, et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents[J]. Mol Cell Proteomics, 2004, 3(12): 1154-1169. [8] Brozek-Pluska B, Kopec M, Niedzwiecka I, et al. Label-free determination of lipid composition and secondary protein structure of human salivary noncancerous and cancerous tissues by Raman microspectroscopy[J]. Analyst, 2014, 5. [9] Patel, V.J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches[J]. J Proteome Res, 2009, 8(7): 3752-3759. [10] Wang, H., S. Alvarez, and L.M. Hicks, Comprehensive comparison of iTRAQ and label-free LC-based quantitative proteomics approaches using two Chlamydomonas reinhardtii strains of interest for biofuels engineering[J]. J Proteome Res, 2012, 11(1): 487-501. [11] Maciej Modzel, Halina P?óciennik, Martyna Kielmas, et al. A synthesis of new: bi-labeled

peptides for quantitative proteomics[J]. ScienceDirect, 2015, 115: 1-7.


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