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关于教育的PPT


基于磁性石墨烯基纳米复合物修饰 印刷电极的新型过氧化氢传感器 研究
系 别:化学与化学工程系 专业年级:2012材料化学



员 :李升杰、张飞、李时庆、
江峻亮、周胜林

指导教师:杨欣

职称:讲师
1

作品撰写的目的和基本思路

过氧化氢(H2O2)在食品工业、临床应用、环境分析等领域应 用广泛。同时,它也是葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶等一系列酶促 反应的重要副产物。因此,发展灵敏、快速、低成本的H2O2检测方 法与仪器具有重要意义。 该论文首先以印刷电极(SPCE)为基材,在外加磁场作用下在 SPCE表面共修饰金磁微粒(Fe3O4-Au)包被辣根过氧化物酶(HRP)以 及石墨烯-Nafion膜,制备了外磁场可控的H2O2快速检测用一次性 电化学生物传感器。然后对磁性石墨烯基纳米复合物制备、传感器 构建以及检测条件、等进行了优化。最后在优化的实验条件下对实 际样品中的痕量H2O2进行了检测,实验结果令人满意。
2

作品科学性、先进性及实际应用价值

本论文采用金磁微粒(Fe3O4-Au)包被辣根过氧化物酶(HRP)以及 石墨烯-Nafion膜共修饰丝网印刷电极构建了一种新型的过氧化氢 (H2O2)快速检测用电化学生物传感器。该传感器相对于已报道的文 献,能够实现HRP的直接电子传递,该传感器具有灵敏快速、制备 容易、样品用量少、可抛弃、外磁场可控、抗干扰性强、等优点。

本论文构建的平台技术具有通用性,可进一步推广至其它食品 或药品的检测。并可作为气相色谱、液相色谱、色谱-质谱联用等 方法的有益补充,在食品以及药物分析方面具有理论意义和潜在的 实际应用价值。对于保障食品安全以及开发石墨烯基纳米复合物的 新功能具有重要意义。 3

1. 摘要
构建一种新型的磁场可控过氧化氢(H2O2)快速检测用电化学传感器。在印刷 碳电极(SPCE)表面涂敷一层石墨烯(GS)/Nafion(Nf)膜,通过外磁场作用将包被 了辣根过氧化物酶(HRP)的金磁微粒[Fe3O4-Au 简称:GMP]吸附到其表面构建可 用于H2O2检测的一次性电化学传感器。采用X-射线衍射(XRD)、电化学交流阻抗 谱(EIS)、扫描电镜(SEM)表征复合纳米材料及传感电极的制备过程;采用循环伏 安(CV)法和计时-电流(i-t)法研究H2O2在该生物传感器上的电化学行为。在优化 的实验条件下,该电极能实现HRP的直接电子传递(DET),对H2O2有显著的电催化 作用,在2.0×10-5~2.5×10-3 mol/L浓度范围内H2O2有良好的线性响应,线性 相关系数为0.9994,检测限为1.2×10-5mol/L。该传感器灵敏快速、制备容易、 样品用量少、可抛弃、外磁场可控、抗干扰性强,有望用于食品中痕量H2O2的检 测。
4

论文概况
摘要 实验部分 结果与性能分析
结论
2014-12-5

5

2. 实验部分 2-1 仪器与试剂
仪器:HI660D电化学工作站;三电极集成SPCEs(其中:工作 电极为复合纳米微粒修饰电极,参比电极为印刷Ag/AgCl电极,对 电极为印刷碳电极);Hitachi S-4800N型能谱扫描电镜;X-射线 粉末衍射仪;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器。

试剂:辣根过氧化物酶(HRP,活性≥250 U/mg,);石墨;过 氧化氢(30%);Nafion溶液;磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.1 mol/L, 用NaH2PO4、Na2HPO4和NaCl配制);5 mg/mL Fe3O4/Au纳米金磁微 粒;Nafion溶液及其它试剂均为分析纯;隐形眼镜护理液;实验 用水均为二次蒸馏水。所有实验均处于N2保护下进行。

6

2-2实验步骤
GS的制备

实 验 步

Fe3O4-Au-HRP的制备 修饰电极的制备


传感器对H2O2的检测

7

8/20

2-2.1

GS的制备

首先采用改进的Hummers法制得氧化石墨。将0.1 g GO溶解于 100 mL蒸馏水,超声3 h,成为均匀分散的黄色透明GO胶体溶液 。GO胶体呈亮黄色,经过氧化后已在碳原子层之间引入大量的 羧基、羟基等亲水性基团而易溶于水。将上述溶液放入250 mL 三颈瓶中,水浴80 ℃加热,加入50 μ L肼还原24 h,最后得黑 色絮状沉淀,洗涤、抽滤、真空干燥得到GS粉末。 GS在水溶液 中由于∏-∏共轭以及强的分子间作用力而容易团聚,故将2.0 mg GS加至1.0 mL 0.5% Nafion溶液中并超声2 h形成均一稳定 的GS/Nafion复合物,Nafion溶液的增溶作用明显改善了GS的水 溶性,由于其带负电的磺酸基与GS的负电荷相互排斥而有效防 止GS团聚,得到分散性较好的GS/Nafion溶液。
8

9/20

2-2.2

Fe3O4-Au-HRP的制备

按照购买的Fe3O4/Au说明书上生物蛋白包被步骤和包被量。 首先,300 μ L Fe3O4-Au溶液溶解于300 μ L Tris-HCl缓冲液中 (pH=7.5),轻轻震荡,将离心管置于磁性分离器中磁性分离,弃 上清液。然后,300 μ L HRP溶液(30 mg/mL)加入上述溶液中37 ℃下振荡反应30 min后重新磁性分离(标记为:Fe3O4-Au-HRP), 弃上清液。上述Fe3O4-Au-HRP溶液定容至1.0 mL PBS, 轻摇重悬 磁粒,4 ℃保存备用。

9

10/20

2-2.3

修饰电极的制备

100.0 mg GS溶解于100.0 mL Nafion溶液中(w=0.2%)并强 超声1 h形成均一稳定的GS-Nafion溶液,滴加上述溶液10 μ L 均匀涂覆于SPCE表面,待其自然干燥得到SPCE│GSNafion电极;继续滴加10 μ L Fe3O4-Au-HRP溶液,在电极底 部加一块磁铁,借助磁力将Fe3O4-Au-HRP吸附于电极表面, 自然晾干即得SPCE│GS-Nafion/Fe3O4-Au-HRP电极。需要更 新电极表面时, 移去磁铁并用pH=6.0 PBS 冲洗电极表面,即 可实现电极再生。

10

11/20

2-2.4 传感器对H2O2的检测
滴加1.0 mL的PBS溶液(pH=6.5)于SPCE│GS-Nafion/Fe3O4-AuHRP电极的工作电极表面并通氮除氧15分钟,采用循环伏安(CV) 法检测HRP的在电极表面的直接电子传递现象(Direct electron transfer, DET);在上述溶液中再加入不同浓度的H2O2,CV法 检测电极对不同浓度H2O2的催化响应;采用计时电流(i-t)法进 行H2O2定量分析。传感器检测系统及工作电极表面形貌见下图 。CV法电位范围:+0.4 V~-0.8 V,扫描速率:0.1 V/s;i-t 实验工作电位:-0.3 V;实验前溶液通N2除氧15 min,实验过 程中保持N2氛围。

11

12/20

传感器(A)以及工作电极表面(B)反应机理示 意图
Workin g electrode

Reference el ectrode

H2O 2

ee-

H2O

HRP Fe 3O 4 -Au

GS -Nafion film

El ectrode leader Insulator Cou nter elec trode

HRP(Ox) HRP(Re )

Switch Joi nt C V /EI S/i-t

e-

React io n area

CHI660D

M agnetic fie ld

A

B

12

3.结果与性能分析 3-1石墨、氧化石墨以及GS的XRD表征
60000

Intensity/a.u.

40000

a b c
10 20 30 40

20000

0

2θ /deg

图可以在2θ=26°附近看到石墨明显的衍射峰;氧化石墨的衍射峰下降至 2θ=10.6°(图2-a),这可能是因为在石墨的碳原子层间引入了大量的氧化 基团;GS的 XRD图谱如图2-c 所示,在2θ=23°附近的衍射峰与石墨的衍 射峰接近,这可能是由于部分氧化官能团的去除。。

13

3.结果与性能分析
3-2 传感器制作过程各阶段获得电极的扫描电镜表征

图a显示SPCEs表面具有比较明显的块状石墨结构;在SPCE表面涂覆 GS-Nafion溶液以后(图b)SPCE│GS-Nafion电极出现了分散的褶皱状石 墨烯片层结构。在外磁场作用下,Fe3O4-Au-HRP微粒被进一步吸附于 SPCE│GS-Nafion电极表面用于构建SPCE│GS-Nafion/Fe3O4-Au-HRP电 极,得到图c,电极表面均匀分散着粒径约为200~500 nm的纳米颗粒,与 蛋白质粒径相似,这说明HRP包被在电极表面。
14

3.结果与性能分析
3-3 传感器制作过程各阶段获得电极的阻抗表征 通过电化学交流阻抗谱(EIS)对不同电极的电子转移性能进行研究(如图4)。 在Nyquist图中表示为X轴(Z’)上的实部与Y(-Z’’)轴上的虚部。频谱包括 一个半圆形部分和一个线性部分。其中:高频的半圆部分对应电子转移控制 过程,低频的线性部分对应电子转移扩散过程。SPCE电极的EIS由一条直线 组成,其半圆直径很小,说明 [Fe(CN)6]3-/4- 的扩散较为容易 (4-a) ;在 SPCE 表面涂覆 GS-Nafion 溶液以后 (4-a) ,半圆的直径增大,这可能是由于 Nafion 具 有 较 大 的 电 阻 , 阻 碍 了 [Fe(CN)6]3-/4- 的 扩 散 。 与 SPCE│GSNafion 电极的 EIS 相比,SPCE│GS-Nafion/Fe3O4-Au-HRP 电极的半圆直径进 一 步 变 大 , 这 表 明 [Fe(CN)6]3-/4- 的 扩 散 进 一 步 受 到 阻 碍 , SPCE│GSNafion/Fe3O4-Au-HRP的电化学活性比SPCE│GS-Nafion电极更低。以上结果 表明GS-Nafion/Fe3O4-Au-HRP成功的固定在电极。
750

a
500

-Z''/Ω

250

b
0 750

c
1500 2250

0

Z'/Ω

15

3.结果与性能分析
3-4 传感器制作过程中各阶段获得电极的电化学 特性
在pH=6.5 0.1 mol/L的PBS中,测定了不同电极的CV曲线。 SPCE│HRP-Nafion电极(5-a)没有出现HRP的氧化还原峰,推断是 因为HRP的电化学活性中心被深深地包埋在蛋白质的核壳结构中, 这使得酶的活性中心与电极表面之间的距离比电子能传递的有效 距离远,而且,由于Nafion的不导电进一步阻碍了其电子的传递; SPCE│GS-HRP-Nafion电极(b)以及SPCE│GS-Nafion/Fe3O4-AuHRP电极(c)均在-0.3 V附近出现明显的还原峰电流,能明显观察 到HRP的DET;与上述电极相比SPCE│GS-Nafion/Fe3O4-Au-HRP电 极的还原峰电流最强,HRP的DET现象更为明显。这可能是由于GS 以及Fe3O4-Au复合纳米微粒的引入,协同起到缩短酶的活性中心 与电极表面之间的距离的作用,同时加速了电子传递速率。实验 进一步发现,SPCE│GS-Nafion/Fe3O4-Au电极(5-d)仅仅具有大的 背景电流,并未出现明显的电流响应。 16

3.2 修饰电极制备以及检测条件的优化
1、修饰电极表面GS/HRP/Nafion的滴加量
电极表面GS-Nafion滴加量会影响H2O2的响应电流,实验 发现,0.5 mmol/L H2O2的还原峰电流随着GS-Nafion滴加量 的增加而变大,这是由于电极表面的催化活性位点随着GS的 增加而增多,当用量超过10 μ L时,电流反而降低,这可能 是因为电极表面不导致的Nafion增多反而阻碍了电子传递, 故本实验选用10 μ L GS-Nafion溶液涂覆到SPCE电极表面。

2、pH的选择
考察了缓冲溶液pH对0.5 mmol/LH2O2响应电流的影响,当 缓冲溶液的pH=6.5时,修饰电极对H2O2的还原电流达到最大, 推测是因为HRP活性在pH=6.5时保持最佳。因此,选择pH=6.5 的PBS作为检测实验的底液

3、温度的选择
考察了酶电极在15~40 ℃范围内对0.5 mmol/LH2O2的响 应电流,实验结果表明温度在25 ℃时响应电流达到最大,说 17 明此时HRP活性最强,因此选择实验在25℃时进行。

3.4电极的精密度、制备重复性、稳定性 18/20 和抗干扰性
精密度:采用同一根电极分别测定0.5 mmol/L H2O2 五次,得到其组内变异系数为4.4%,说明该酶电极具有良好 的精密度。 制备重复性:由于使用的SPCE是同一批次印制,因此 彼此结构完全相同(包括电极材料、面积和碳层厚度等),且 只使用一次即抛弃。所以我们比较了采用5个同一批次制备的 H2O2传感器,对0.5 mmol/L的H2O2进行测定,获得组间变异 系数为3.6%(n=3),说明该酶电极具有较好的制备重复性。 稳定性:酶电极在4℃冰箱中存放30天后仅下降为原来 的90.2%。表明制作的酶电极在30 d内比较稳定,电极表面 HRP的生物活性保持良好,这可能是由于Fe3O4-Au具有优良的 生物兼容性。 抗干扰性:于0.5 mmol/LH2O2中分别加入1.0 mmol/L 葡萄糖、柠檬酸、抗坏血酸等干扰物质,结果发现这些物质 18 对测定无干扰,说明电极具有良好的选择性。

3.5 实际样品检测

19/20

为验证本方法在实际样品检测中的可行性,对某双氧水隐形 眼镜护理液中H2O2含量进行测定(表2)。采用传统的高锰酸钾滴 定法测得其中H2O2含量为0.90 mol/L。采用本实验构建的传感 器,在最佳实验条件下采用i-t法测定5次,均值为0.91 mol /L ,样品回收率(检出量/加入量×100%)在96.0%~102.0%之间, 说明本方法可用于实际样品中H2O2的现场快速测定。
表2 实际样品中H2O2检测结果 (N=6, 浓度单位: mmol/L) Tab.2 Determination results of H2O2 in real samples (n=6, mmol/L)
Samples KMnO4 titration This method Added Found R.S.D/% Recovery/%

1

0.90

0.93

1.0

1.89

3.3

96.0

2

0.91

0.89

1.0

1.91

3.1

102.0

3

0.89

0.91

1.0

1.92

3.9

101.0

19

4. 结论

20/20

制备了基于Fe3O4-Au包被HRP以及GS-Nafion膜共修饰 SPCE的新型H2O2传感器。该修饰电极由于修饰了复合纳米微 粒而具有很高的表面活性,即能扩增响应电流,又能实现HRP 和电极之间的DET,表现出对H2O2典型的催化还原效应,相比 其他H2O2生物传感器还表现出低成本、可再生、稳定性强、 可抛弃、等优点。对实际样品的分析与KMnO4滴定法获得的结 果一致。为开发GS-Fe3O4-Au基复合纳米微粒在食品或药物残 留分析的应用开创了可能性。

20

21/20

谢谢!

21


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