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酪蛋白的制备


上海大学生命科学实验中心

课 学 程: 号:

验 预 习
姓 名:

报 告
日 期:

同组者: 温 度:

指导老师: 湿 度:

实验时间:

(一律用 A4 纸、钢笔书写或打印,不得涂改,经教师签字后方为有效,附在实验报告中一并交。 如无此原始记录或丢失,报告不批示成绩) 实 验 名 称:酪蛋白的制备 1.目的:学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法,并依此加深对等电点概念的印象。 目的: 目的

2.原理、仪器设备、材料和试剂: 原理、仪器设备、材料和试剂 原理 原理:牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质。其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的 80%。酪蛋白是白 色、无味的物质。不溶于水、乙醇及有机溶剂,但溶于碱溶液。牛乳在 pH4.7 时酪蛋白等电聚沉后剩余 的蛋白质统称乳清蛋白。乳清蛋白不同于酪蛋白,其粒子的水合能力强、分散性高,在乳中呈高分子状 态。 ? 在处于其等电点时,兼性离子/粒子在溶液中的溶解度降低;如果我们将牛奶的 pH 调到 4.7,就可 获得酪蛋白沉淀;下一步,用乙醇、乙醇-乙醚混合物、乙醚来洗涤沉淀物,以去除脂溶性杂质,就可得 到较纯的酪蛋白。 试剂:95%乙醇;无水乙醚;乙醇—乙醚混合液 (V/V=1∶1) 。 ? ? 0.2mol/L pH4.7 醋酸—醋酸钠缓冲液 3000mL: A 液:称取 NaAc 3H2O 54.44g,定容至 2000mL。

? B 液:称取优级纯醋酸(含量大于 99.8%)12.0g 定容至 1000mL。 ? 取 A 液 1770mL,B 液 1230mL 混合即得 pH4.7 的醋酸—醋酸钠缓冲液 3000mL。

仪器:离心机 ;抽滤装置 ;研钵 ;布氏漏斗 ;容量瓶。

3.操作步骤及现象记录 操作步骤及现象记录 1.将 20mL pH4.7 的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至 40℃。将 20mL 牛奶加热至 40℃,在搅拌下缓慢地加 入 20mL 预热的 pH4.7 的醋酸-醋酸钠缓冲液。 2.用精密 pH 试纸调 pH 至 4.7,可见溶液变为乳白色悬浮液。待悬浮液冷却至室温,3000rpm 离心
1

15min,弃上清,得酪蛋白粗制品。用 6mL 水洗脱沉淀 1 次,3000rpm 离心 10min,弃上清 在沉淀中加入 6mL95%乙醇,搅拌片刻,将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤 3.用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀 1 次,最后用乙醚洗涤沉淀 1 次,抽干。将沉淀摊开在表面皿上,风 干,得酪蛋白纯品。准确称量,计算含量和得率
酪蛋白 测得含量

含量=

(g%)
100mL牛奶

得率=
理论含量

×100%

含量:酪蛋白

克/100 毫升牛奶

准确称重,计算含量和得率。

得率 =

测得含量 × 100% 理论含量

式中理论含量为 3.5 克/100 毫升牛奶

4.思考题 思考题
2

? 1.

制备高产率纯酪蛋白的关键是什么?

答: 1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质,故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度 计测定。2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂,最好在通风橱内操作。3、目前市面上出售的 牛奶是经加工的奶制品,不是纯净牛奶,所以计算时应按产品的相应指标计算。

? 2.

试设计另一种提取酪蛋白的方法。

答:用盐析法,加重金属离子、有机酸、有机溶剂等,都可以使蛋白质沉淀下来。蛋白质沉淀后,离心 10 分钟(3000r/min) 。水洗两次,离心 10 分钟(3000r/min) 。 加入乙醇,搅拌,悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀 2 次。最后用乙醚洗沉淀 两次,抽干。沉淀风干,得酪蛋白纯品。加入有机溶剂是除去脂类杂质。 采用 3000g,30min 离心的方法,最后酪蛋白沉到最下面。

? 3.

用乙醇、乙醇-乙醚和乙醚洗涤蛋白质的顺序是否可以变换?为什么?

答:不能颠倒次序。经过这个次序以后,结晶吸附的溶剂改为乙醚,乙醚沸点低,容易挥散干净,得到 纯的结晶。乙醇和乙醚的溶解性能产很远,乙醇实际上介于水和有机溶剂之间,而乙醚是完全的有机溶 剂,他们各自去洗涤各自能溶解的物质,从无机(水)到有机(乙醚) 。最后用乙醚是因为 它会很快挥 发掉 不留痕迹,可得到纯粹的蛋白质。

4.

等电点沉淀蛋白质的原理是什么?

答:在等电点时,蛋白质分子以两性离子形式存在,其分子净电荷为零(即正负电荷相等),此时蛋白质 分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥,分子相互之间的作用力减弱,其颗粒极易碰撞、凝聚而 产生沉淀,所以蛋白质在等电点时,其溶解度最小,最易形成沉淀物

3


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