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第三章 蛋白质工程


蛋白质工程与食品产业

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蛋白质的功能与结构 蛋白质工程的诞生 蛋白质工程的基本步骤和改造方法 食物蛋白质改性技术 蛋白质工程在食品产业中的应用

一、蛋白质的功能与结构
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1.1蛋白质的功能 1.2蛋白质的结构

1.1蛋白质的功能
(1)蛋白质是构成生命的重要物质之一
? 蛋白质是一类重要而复杂的生物大分子,它广泛地存在于所有生 物界的机体之中,具有许多重要的作用; ? 构成生物体新陈代谢的几乎全部的化学反应都是在活性蛋白质-酶 的催化下进行的; ? 高等动物免疫反应,主要是通过蛋白质,即抗原和抗体来完成的 ;

? 运动时的肌肉收缩靠的是某些蛋白质的相互作用来完成的;
? 运输氧和二氧化碳的是血红蛋白; ? 具有代谢和调节功能的是多种蛋白质激素。

(2) 蛋白质的应用
? 蛋白质是人类赖以维持生命的重要营养来源之一。人们需要从各 种肉、蛋、奶、豆类等主要食品中获得所需的蛋白质营养。 ? 用蛋白质诊断和治疗某些疾病。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶用于帮 助消化,治疗某些消化不良性疾病;胰岛素用于治疗严重的糖尿 病;转氨酶作为肝病变的指标等。 ? 食品工业和轻工业中主要应用蛋白质或利用蛋白质的性质制造各 种产品。例如,酿造业要用蛋白酶来增加酱油的鲜味等。用于人 类衣着的羊毛、纺织品和皮革主要组成是蛋白质。

1.2蛋白质的结构
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氨基酸是蛋白质的基本结构单位,各种氨基酸之间通过 肽键彼此按直线形头尾相连,构成不同长短的肽链。

肽键的形成

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肽链又以一定方式折叠盘绕成独特的空间结构,这时才产生具有 生物活性的天然蛋白质。 多肽链的折叠可分为四种不同层次的结构。一级结构:仅指肽链 中的氨基酸线型排列顺序,不考虑空间的排列。

牛胰岛素的氨基酸序列

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二级结构:主链原子的局部空间排 列,不包括侧链构象和与其他链段 的相互关系,如?-螺旋、?-折叠等 主链构象单元就是二级结构。

?-螺旋 ?-折叠

三级结构:蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再 进一步盘曲或折叠形成具有一定规律的三维空间结构。

碳酸酐酶的多肽骨架示意图

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四级结构:具有二条或二条以上独立三级结构的多肽 链组成的蛋白质,其多肽链间通过次级键相互组合而 形成的空间结构。其中,每个具有独立三级结构的多 肽链单位称为亚基。四级结构实际上是指亚基的立体 排布、相互作用及接触部位的布局。如血红蛋白分子 中四个亚基之间的空间关系。

血红蛋白的结构

二、蛋白质工程的诞生
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蛋白质工程是指基于蛋白质结构功能的研究结果,通 过基因工程技术,改造现有蛋白质和设计制造新蛋白 质,因而也称为第二代基因工程。
蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物 学、分子遗传学等学科的基础之上,融合了蛋白质晶 体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计 等多学科而发展起来的新兴研究领域。

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内容主要有两个方面:
根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质; 确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系;

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在此基础之上,实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能
,设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质,这也是蛋白质工程最 根本的目标之一。

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生物理论和技术在下列九方面的发展促进了蛋白质工
程的诞生:
①新的克隆技术,特别是完整的cDNA的克隆技术; ②快速测定DNA序列的方法; ③从DNA序列推算蛋白质序列的较好的计算机程序系统;

④蛋白质序列数据库的建立,使一级结构相似的蛋白质能被很快
地鉴定出来,并由此研究其功能上的相似性;

⑤对原核生物和真核生物基因表达调控的进一步深入了解;
⑥用于基因体外诱变的化学、酶学和合成技术的进展; ⑦X-光晶体学的进展,包括较好的长晶体策略、同步辐射的应用、电子

区域检测器的出现,以及计算机辅助数据分析;
⑧用计算机图像系统为工具直接观察晶体数据; ⑨核磁共振技术的改进,使溶液中的原子分布能得到直接检测。

三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法
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3.1 蛋白质工程研究的基本步骤 3.2 蛋白质改造方法

3.1 蛋白质工程研究的基本步骤
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分离纯化目的蛋白,使之结晶,并作X晶体衍射分析,结合核磁 共振等其他方法的分析结果,得到其空间结构的尽可能多的信息 ;
对目的蛋白的功能作详尽的研究,确定它的功能域;

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通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相互关系的分 析,找出关键的基团和结构;
在蛋白质结构与功能研究的基础上,借助于计算机图像显示和分 子辅助设计,提出对目的蛋白分子的改建或构建方案,并用基因 工程的方法去实施; 对经过改造的蛋白质进行功能性测定,看看改造的效果如何。

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蛋白质工程的程序

3.2 蛋白质改造方法
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3.2.1 天然蛋白质的改造 3.2.1.1 基因的定向诱变技术 3.2.1.2 结构域的拼接

3.2.1.1 基因的定向诱变技术
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一般,含有单一或少数几个突变位点的基因定向改变
可以采用M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术、寡核苷 酸介导的PCR诱变技术、随机诱变技术和盒式突变技 术。

(1)M13-DNA寡聚核苷酸 介导诱变技术
.将要改造的蛋白质的目的基因插入到M13
单链DNA中

作为模板,以含有要改变的碱基的一段寡聚 核苷酸作为引物,在体外用DNA聚合酶进行 双链DNA的合成,用DNA连接酶连接成环状

将杂合DNA双链再转入大肠杆菌中

将含突变目的基因的M13噬菌体筛选出来, 提取它们的DNA,用限制性内切酶把突变目 的基因切下,并重组到表达质粒中

(2)寡核苷酸介导的PCR诱变技术
将目的基因克隆到质粒载体上

设计两对引物

由于两个反应物中引物的位置不同, PCR扩增后,产物有不同的末端

将两管PCR产物混合、变性、复性、 退火,形成有两个切口的环状DNA, 转入大肠杆菌。

(3)随机诱变技术
将待突变基因克隆到质粒上,使基 因旁有两个特殊的限制性酶切位点 用大肠杆菌核酸外切酶EIII从 3’-凹陷端降解DNA 反应一段时间后终止反应,再用 Klenow片段补平
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 的Klenow片段是完整的 DNA聚合酶Ⅰ的一个片 段,只有在5’→3聚合 酶活性和3’→5’外切 酶活性,失去了5’→3 外切酶活性

用修复后的质粒转化大肠杆菌

(4)盒式突变技术
在目标基因中选择合适的限 制性内切酶位点

用含有突变序列的DNA片段来置 换目标基因上的一段DNA序列

产生突变序列被集中在目标基因 的一个特定区域的突变家族

进行盒式突变,需要解决两个关键问题:
? 一个是在目标基因序列中,要有适当的限制性内切酶识别位点, 使得用以取代天然DNA序列的盒式突变序列可以有效地插入到目 标基因中。 ? 另一个是如何得到各种合适的、用以取代目标基因中特定DNA片 段的突变DNA片段。值得注意的是,突变序列的两端必须分别具 有与目标基因上相匹配的的限制性内切酶识别位点。

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盒式突变技术的实际应用:
加酶洗衣粉是人们日常生活中常用的东西,在洗衣粉中常加入 的酶是枯草杆菌蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶有一个弱点,一遇到漂 白剂,就会被破坏而失去活性。枯草杆菌酶氧化失活的原因是由 于第222位的甲硫氨酸的被氧化造成的,但还不知道哪一种氨基酸 替换甲硫氨酸能维持酶的活性,并同时使它具有抗氧化的特性。 使用盒式突变技术,1985年发现只有半光氨酸取代的突变酶活力 比原酶提高138%,并可在过氧化氢(一种氧化剂)存在1小时不 丢失酶活力。这样就制成了合乎需要的漂白加酶洗衣粉了。

3.2.1.2 结构域的拼接
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结构域是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次。在 较大的蛋白质分子中,由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系 ,形成二个或多个在空间上可以明显区别它与蛋白质亚基结构的 区别。 结构域拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几个结构 域连接在一起,形成融合蛋白,它兼有原来两种蛋白的性质。

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金属硫蛋白是一类小分子量的球蛋白,哺乳动物中的金属硫蛋白 分子由61个氨基酸残基组成,分为两个结构域,分别叫α结构域和 β结构域。α结构域能结合4个金属离子,趋向于与镉和汞结合;而 β结构域能结合3个金属离子,趋向于与锌和铜结合。α结构域结合 镉的能力比β结构域高出1000倍以上。 用计算机分子模型软件对金属硫蛋白的空间结构进行分析表明, 天然金属硫蛋白的两个结构域之间具有较大的独立性,是可以拆 分和构建的,因而构建α结构域的“二倍体”的设想是可行的。 用化学合成的方法分别合成结构域和连接肽段的基因,并设法将 它们拼接起来。再插入载体并转入植物细胞中,使金属硫蛋白的α 结构域多倍体基因在植物中表达。

3.2.2 合成全新蛋白质
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基于天然蛋白质结构改造的蛋白质工程可以优
化蛋白质的活性,而全新蛋白质设计是合成具

有新奇的结构与功能的新蛋白质。

从头设计一个蛋白质的基本步骤:
从已知三维结构的数据库中挑选出 一个合适的片段,进行修改和组合 构建一个多肽链骨架 模型

优化目标蛋白的三维模型

依据氨基酸残基的统计学数据和排 列的优先顺序,确定每个残基位置 上的氨基酸

检验和考核所给定的目标蛋白质结 构是否合理,对所设计的模型做进 一步修正

几轮的设计、检验和再设计,获得 一个正确折叠和带有人们预期功能 的目标蛋白质

四 食物蛋白质改性技术
? 随着食品工业飞速发展,迫切需要大量具有功能特性和营养特性
蛋白质,作为食品原料成分或添加基料; ? 大力开发具有优良特性蛋白质资源;

? 对现有蛋白质进行改性,以满足人们特殊需求;
? 人类食用蛋白质主要有两大类,即植物蛋白和动物蛋白; ? 植物蛋白周期短,资源丰富,产量大等优点,在食用蛋白中占 70%以上,而动物蛋白则不足30%。

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蛋白质是由各种氨基酸相互联结而构成的具有空间结构生物大分子。
其理化性质(尤其分子量、氨基酸组成、静电荷和表面疏水性)与功能 特性直接相关。

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蛋白质改性就是用生化因素(如化学试剂、酶制剂等)或物理因素(如热
、射线、机械振荡等)使其氨基酸残基和多肽链发生某种变化,引起蛋 白大分子空间结构和理化性质改变,从而获得较好功能特性和营养特

性蛋白质。

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非酶法改性是最常用改性技术,反应简单、应用广泛和效果显著
等特点;

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缺点: 反应条件苛制,试剂专一性不强,终产品中除去未反应试

剂较困难等。
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酶法改性反应速度快,条件温和,专一性强,更重要的是一些低 廉微生物酶出现。

酰化作用
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蛋白质酰化反应是酶化试剂(琥珀酸酐、乙酸酐等)与氨基酸中亲核基
团(如氨基等)发生如下反应:

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酰化反应主要发生在Lys(赖氨酸)的ε-NH2上,Tyr(酪氨酸 )酚 基反应活性次之,His(组氨酸)咪唑基和Cys(半胱氨酸)巯基只 有相当少一部分可参与反应,Ser(丝氨酸)和Thr(苏氨酸)羟基是 弱亲核基,在水介质中基本不被酰化。

酰化作用
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在酰化反应中,原蛋白质分子带正电铵离子被带负电酸根所取代,净负 电荷增加,使蛋白质等电点向低值移动;
蛋白质分子内和分子间原氨基与羟基的引力变为斥力,导致螺旋结构多 肽链趋于伸展状态并使蛋白质分子间作用减弱,蛋白质-水之间作用增 强,从而增加蛋白质溶解性、持水性、持油性、乳化性和发泡性等。 特定功能性质改善程度取决于反应条件,尤其是酰化作用类型和程度, 可通过测定残留氨基数量确定酰化度。

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酰化蛋白质营养价值也倍受人们关注,有研究表明,蛋白质琥珀酰化程 度提高,干扰蛋白质利用的生物作用,不利于动物消化吸收。

磷酸化作用
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蛋白质磷酸化改性是有选择利用蛋白质侧链活性基团,如Ser、Thr、 Tyr(酪氨酸)的-OH及Lys的ε-NH2,形成-C-O-Pi或-C-N-Pi酯化反 应(后者对酸不稳定,在pH≦7环境下发生水解,而前者稳定),使之 变成(Ser、Thr)Tyr-PO32-,从而引进大量磷酸根基团,蛋白质磷酸化 作用可通过非酶法或酶法予以实施;
常用化学磷酸化试剂有磷酰氯(POCl3)、磷酸(不能直接用于蛋白质磷 酸化,而需与C13CCN(三氯乙腈)首先结合,再进一步反应)、 P2O5/H3PO4、三聚磷酸钠(STP)等; 。

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对磷酸化酪蛋白和磷酸化大豆蛋白研究发现,蛋白质磷酸化作用
对其消化性无显著影响。

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POCl3磷酸化部位不专一,二种酰化作用均可发生,且易引起蛋

白质交联作用;
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STP需弱碱反应条件,并且引发一些副反应;

磷酸化作用
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磷酸化改性后蛋白中,由于引进大量磷酸根基团,从而增加蛋白质体系
电负性,提高蛋白质分子之间静电斥力,使之在食品体系中更易分散, 相互排斥,因而提高溶解度,聚集稳定性,降低等电点,而且其净电荷

只有在相当低环境中才会被中和,故可有效拓宽在食品中应用范围。
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磷酸化改性蛋白由于负电荷引入,大大降低乳状液表面张力,使之更易 形成乳状液滴,同时也增加液滴之间斥力,从而更易分散,因此改性蛋

白乳化能力及乳化稳定性都有较大改善。

脱酰胺作用
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脱酰胺作用是将蛋白质中天冬酰氨和谷氨酰胺脱去酰胺基生成天冬 氨酸和谷氨酸;(酸、碱、酶法)
在酸性条件下,去酰胺反应是直接水解蛋白质酰胺键中氨,脱氨形 成羧酸进行的。由于温度高,不仅在酸的催化下肽键水解控制不好 ,蛋白质也有部分变性。 用碱催化去酰胺改性仅台湾有报道,这种方法虽速度快,但使蛋白 质中氨基酸发生消旋作用,使必需氨基酸L-对映体减少和消化率降 低,并产生赖丙氨酸,毒理研究表明它对小鼠肾有毒害作用;

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? 在蛋白酶中存在一些能去酰胺的酶,如木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等; ? 肽谷氨酰胺酶(PGase)、谷氨酸胺转胺酶(TGase)在一定条件下也能发生去酰 胺反应; ? 从土壤中提取PGase包括Ⅰ和Ⅱ两种类型,它们对未变性蛋白质的活性相当 低,但对水解蛋白质有较高活性,从发芽小麦中分离PGase对未变性蛋白质 有较高活性; ? PGase应用于去酰胺作用是最实际可行的,蛋白质需先用蛋白酶或其它方法 预处理,被破坏紧缩结构的蛋白质就成此酶最适底物。

? TGase在无伯胺存在情况下,可催化蛋白质Gln(谷氨酰胺 )残基释放出侧 链基团中氨,此时水将作为酰基受体而发生去酰胺反应。

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无论采用化学或酶法改性,面筋蛋白去酰胺作用导致蛋白质电荷密度增 大,从而由于静电排斥而导致蛋白质结构变化; 这些结构变化导致疏水性残基暴露,因而增加表面疏水性,且伴随着带 负电荷极性基团出现,使改性蛋白具有两亲性,从而使其可作为乳化剂 或泡沫稳定剂; 即使表面疏水性增加,蛋白质溶解性也同样有所提高,这是蛋白质-蛋白 质之间相互作用减弱所致。 去酰胺度在2%-6%可提高蛋白质功能特性。

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酸法去酰胺改性后会导致有苦涩感,不过这可通过碱法异丙醇提取加以 克服,即去酰胺后再采用异丙醇处理。

糖基化作用
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将碳水化合物以共价键与蛋白质分子上氨基(主要为Lys的ξ-氨基)
或羧基相结合化学反应(包括美拉德反应),称之为蛋白质糖基化作 用;

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提高蛋白质功能特性。一般来说,合成糖基化蛋白在较低离子强度
或天然蛋白等电点处仍表现出较高溶解性;

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糖基化提高蛋白质热稳定性,且随着糖基化程度提高,糖基化蛋白

质功能特性也随之提高。

共价交联作用
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转谷氨酰胺酶(TGase)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和脂
肪氧化酶(LO)等能使蛋白质发生交联作用。

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TGase能催化酰基转移反应,使伯胺与一定蛋白质或多肽链谷氨酰胺

侧链酰胺基相互作用,从而产生改性蛋白质和氨。

图中a和b分别为酰基转移反应和蛋白质Gln(谷氨酰胺)残基和Lys 残基之间交联反应,而c便为前面提及脱酰胺反应。

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用POD/H2O2处理不同蛋白质,可使其酪氨酸残基氧化为二酪氨酸 和三酪氨酸。 添加到小麦面粉中,可提高面团形成能力和烘焙能力;

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机制可能在于过氧化物酶催化酚和其氧化产物酚及蛋白质氨基交联 反应;
PPO可使食品中酪氨酸残基和酚类化合物氧化为醌,也能与半胱氨 酸、赖氨酸、组氨酸和色氨酸残基反应,从而减少必需氨基酸含量 ;同时交联后蛋白质也不利于酶的消化水解作用。 脂肪氧化酶也能使蛋白质发生交联反应,作用于面粉,可提高面团 形成能力和烘焙性能。

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蛋白水解作用
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采用蛋白酶对蛋白质进行轻微水解,可显著提高蛋白质溶解性能 ,改善表面/界面性质,水解使蛋白质柔性增大,易于在表面吸 附,增强乳化性及起泡能力。
蛋白质水解可能产生免疫调节肽、血管紧张素I转化酶抑制肽、 丝氨酸磷酸肽,它们存在于食品蛋白质氨基酸序列中,为非活性 状态,但在消化道被释放出来,成为生理调节因子,为食品蛋白 质营养价值增添新的内涵。

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物理改性
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物理改性是利用热能、机械能、声波能等进行蛋白质改性方法; 目前较为集中在热变性和挤压蒸煮过程研究; 温度升高对蛋白质中许多化学键都有所影响,故热处理关键是要控制好 反应条件使得在提高疏水性,同时蛋白质不会发生聚集沉淀。

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挤压组织化就是在高温、高压及高剪切作用条件下,蛋白质结构展开, 分子重新排列。

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一般来说,挤压引起蛋白质生物价降低要比其它形式热处理为大。

五、蛋白质工程在食品产业中的应用
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在实际生产中,可以应用蛋白质工程对一些生产中重要酶或蛋白质性
质加以改造,提高现有酶或蛋白质的工业实用性:

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提高酶的热稳定性(引入二硫键,改善酶热稳定性)。

改变酶的最适pH值条件;
提高酶的催化活性;

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溶菌酶是一种广泛应用于食品工业的酶制剂,其催化速率 随温度升高而升高,因此,它的热稳定性是提高其应用潜 力的重要标准。 蛋白质晶体结构研究表明,T4溶菌酶分子的一个重要特性是 在第97位和54位残基上是两个未形成二硫键的半胱氨酸,所 以,设想通过在分子中增加一对或数对二硫键,来提高酶 热稳定性。 采用定位突变技术使该菌肽链第9位和第164位氨基酸残基转 变为半胱氨酸,并形成一对二硫键,获得的突变体的酶活 性高于天然酶6%,熔点温度提高6.4度; 新引入的“工程二硫键”能够稳定两个结构域之间的相对 位置,进而稳定了由两个结构域所形成的活性中心。

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纤维素酶是一类水解纤维素中β-1,4-葡萄糖苷键的糖苷水解酶。 根据氨基酸的序列相关性,糖苷水解酶可分为82个家族,其中纤维 素酶占其中的13个家族。纤维素酶根据其催化功能的不同,又可分 为内切葡萄糖苷酶、外切葡萄糖苷酶和纤维二糖酶。 自1904年在蜗牛消化液中发现纤维素酶至今已有100多年。对纤维 素酶的研究分三个阶段: 第一个阶段是1980年以前,主要的工作是利用生物化学的方法对纤 维素酶进行分离纯化; 第二个阶段是从1980年到1988年,主要的工作是利用基因工程的 方法对纤维素酶的基因进行克隆和一级结构的测定; 第三阶段是从1988年至今,主要的工作是利用蛋白质工程的方法对 纤维素酶结构域的拆分、解析、功能氨基酸的确定、水解的双置换 机制的确定、分子折叠和催化机制关系的探讨。

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蛋白质工程的工作:
对潜在活性中心氨基酸残基进行基因定点突变; 体外分子定向进化; 对定点突变酶进行动力学的分析;

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通常是用基因定点突变技术对典型纤维素酶家族序列不变残基的确认和 三维构象的确认,并通过设计新的三维复合体来对酶进行修整和探索。 迄今为止,纤维素酶已经有10个家族(第5、6、7、8、9、12、26、 44、45、48家族)被克隆出来,其中第5、6、7、8、9、45家族已经 用蛋白质工程技术进行了研究。

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微生物脂肪酶是一类能催化水解、酯化、酯交换、转酯、醇解、酸解 以及氨解反应等多种化学反应的工业生物催化剂。
脂肪酶催化的化学反应具有化学选择、立体选择性、位点选择性、催 化活性高而副反应少、催化反应又不需要辅助因子等特点

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广泛应用于食品加工、油脂加工、新型生物材料、生物传感器、生物 医学、化妆品、杀虫剂、生物柴油、去污剂、皮革加工、造纸、生物 修复、医药、精细化工、去污剂的添加剂、造纸、皮革等诸多工业领 域;

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市场需求量大(仅洗涤剂添加剂一项,每年市场需求量就高达1 000吨) ,是大宗工业用酶制剂之一;
脂肪酶催化的化学反应工艺条件,通常是在各种有机溶剂介质(如生物 柴油生产中使用的短链醇)、极端酸碱(如废纸脱墨工业中的强碱性)等 条件下,容易导致天然脂肪酶的失活,生产成本的升高,从而限制了脂 肪酶的大规模应用。

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目前主要有两条途径提高脂肪酶对各种极端工艺条件的耐受性: 从极端环境微生物中筛选新型的能耐受极端工艺条件的脂肪酶 利用蛋白质工程技术改造和优化现有脂肪酶分子的性能。 极端微生物培养条件苛刻,极端微生物产生极端脂肪酶更具有不确定性(许多极 端微生物产生的脂肪酶并不属于极端脂肪酶),而且开发这类极端脂肪酶的周期 长,花费昂贵。 越来越多脂肪酶3D结构的阐明,结合生物信息学,利用蛋白质工程技术,快速 设计和改造现有脂肪酶分子,获得新型的高活性和高稳定性的脂肪酶分子,已有 许多成功的报道。 脂肪酶蛋白质工程技术包括脂肪酶的化学修饰和脂肪酶的分子进化两种方式。

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脂肪酶化学修饰
双功能聚合物的化学修饰
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双功能聚合物的化学修饰是指利用双功能聚合物如戊二醛等将酶蛋 白分子之间、亚基之间或在分子内不同肽链之间,共价交联形成交联酶 晶体,从而提高酶的稳定性。 用戊二醛制备的洋葱假单胞菌脂肪酶交联酶晶体,其转酯活性提高 了12倍。 单功能聚合物的化学修饰是将多糖或多聚物如PEG及其衍生物等活 化后,与脂肪酶的侧链氨基相互作用,从而将其偶联到酶分子上。 用多糖偶联C. antarctica(南极洲念珠菌)脂肪酶B后,70℃的 半衰期由18min提高到168min。

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单功能聚合物的化学修饰
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小分子修饰法 小分子修饰法是利用小分子化合物如醛、酮、羧酸、脂肪酸 等与脂肪酶表面暴露的游离羟基、酚羟基、巯基、羧基、氨基等 基团反应,从而改变脂肪酶的酶学性质。 利用脂肪酸修饰C. viscosum(染色粘性菌 )脂肪酶,该酶 的酯交换活性从0 mmol/(h·g)提高到270mmol/(h·g)。

脂肪酶的分子进化
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分子进化是在分子水平上应用基因工程手段对脂肪酶进行有针对的设计
或定向加工,以提高脂肪酶的活性和稳定性,或者创造出具有新功能的 脂肪酶。

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分子进化方法主要有理性设计、定向进化及多种突变技术的结合。利用
分子进化技术,提高微生物脂肪酶的稳定性,优化脂肪酶的催化活性, 取得了巨大的成功。

理性设计
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理性设计是根据已知脂肪酶的三维结构,利用生物信息学(如动力学模 拟)分析脂肪酶蛋白分子结构和功能的关系,确定可以替换或修饰的氨 基酸残基、替换氨基酸残基的类型、侧链修饰对脂肪酶催化性能的影 响,然后运用定点突变技术完成氨基酸残基的替换。 根据C. antarctica(南极洲念珠菌)脂肪酶B的3D结构特点,将 G×S×T保守序列中的T(苏氨酸)突变成G(甘氨酸),脂肪酶突变体的 热稳定性提高了4℃。
利用分子动力学模拟技术结合定点突变技术,C.antarctica脂肪酶B 活性中心的色氨酸残基突变为丙氨酸残基,有效地扩大了脂肪酶活性 中心的空间,对仲醇的催化活性提高了270倍。

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定向进化
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常用的定向进化方法包括两大类:随机突变和基因重组。
随机突变技术包括致错PCR、单分子PCR、化学诱变剂介 导的随机诱变、致突变菌株产生随机突变等;

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基因重组技术包括DNA改组,随机引物体外重组,交错延 伸重组等。

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随机突变
致错PCR技术

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致错技术是根据Taq DNA聚合酶缺乏校正功能,在PCR扩增过程中 存在一定频率的碱基错配特点而开发出来的随机突变技术。 ? 利用致错PCR技术对R.niveus(红泡刺藤)脂肪酶分子定向进化, 筛选到一个脂肪酶突变体的最适温度比野生脂肪酶的最适温度提高了 15℃。 ? 致错PCR技术虽然操作简便快速,但只能产生点突变的突变体,而 且有益突变频率低。

单分子PCR技术
? 单分子PCR技术是一种在极端条件下具有高度错配倾向的PCR技 术,其碱基错配频率为普通Taq酶的三倍,达2. 5×10-5/碱基/ 循环。 ? Kato应用单分子PCR技术体外进化B.cepacia(洋葱伯克霍尔 德菌)脂肪酶的对映体拆分活性,筛选到的脂肪酶突变体对映体 拆分活性提高了42倍。

基因重组
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DNA改组技术:以经过多代诱变的碱性脂肪酶产生菌扩展青霉
FS8486菌株和分离自新疆火焰山口土样的溜曲霉FS-132菌株作为原始 出发菌株,经过两轮基因组改组,得到脂肪酶产量提高了3. 2倍的突变 体。

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多种突变技术的混合体系:每种体外进化技术,均有
其自身的缺点和局限性,通过多种体外进化方法的组 合,可以有效克服技术上的局限性,提高阳性突变频 率。

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利用致错PCR技术和DNA改组技术快速筛选到一个

R.arrhizus(少根根霉 )脂肪酶突变体,其温度稳定
性较天然脂肪酶提高了12倍。

? 植酸酶可将植物性饲料中植酸及其盐分解为肌醇和磷酸,增加可利用磷 的含量,降低植酸对矿物质和蛋白质的亲和力,解除植酸的抗营养作用 ,从而增加动物对蛋白质和某些金属离子的吸收能力。
? 植酸酶在饲料中的推广和应用还相当有限,主要原因:

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(l)植酸酶在天然材料中的含量太低,难以大量生产;
(2)植酸酶的热不稳定性不能完全满足饲料加工、贮藏、使用的要求。

? 目前,用蛋白质工程手段在提高饲用植酸酶的表达量,改善热稳定性和 改良植酸酶催化性质等方面已取得较大进展。

植酸酶改性的策略
要获得具有新的功能和特性酶的方法有两种:
? 从大量自然存在的微生物中筛选能够产生期望性质的酶,通过基 因工程技术,在适合宿主中表达。 ? 运用蛋白质工程对已存在酶的DNA或氨基酸序列进行修饰改造。

定点突变提高植酸酶的表达量
? 植酸酶的生产菌株表达量低,难以获得大量产品,使生产成本太
高,利用高效表达系统作为生物反应器,大规模低成本地大量生 产植酸酶,无疑是解决这一问题行之有效的方法之一。

? 利用毕赤酵母表达植酸酶可以获得大量产品,表达量由原始菌株
的每毫升几微克提高到1-10毫克,并能在酵母中进行糖基化修饰 等蛋白质翻译后加工,提高酶的生物活性。

? 为了提高植酸酶在酵母中的表达率,可通过定点突变将部分在毕
赤酵母中低偏爱性的密码子替换为高偏爱性的密码子。 ? 姚斌等对在毕赤酵母中表达的植酸酶基因phyA2进行了Arg密码

子的优化突变,将4个Arg密码子(有3个编码Arg密码子是CGG,
1个是CGA)突变成高频使用的AGA, Arg密码子优化后其表达量 可达每毫升培养液15000u,比Arg秘密子没有优化的表达量提

高了近37倍。

改善植酸酶的热稳定性
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植酸酶熔点在56-63℃之间,加工饲料都需经过一个制粒工艺,在制 粒过程中有一个短暂的高温过程,温度一般在75-93℃,而一般植酸 酶的活性在此高温下将大幅度的不可逆地丧失;
饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性,因为饲料用酶最终的作 用场所是动物正常体温(37℃左右)的肠胃道中; 获得热稳定性改善的饲用酶,往往引起:(l)邻近氨基酸残基间氢键、 盐键和二硫键的形成;(2)增加疏水相互作用及离子间相互作用,或 α-螺旋、β-折叠、β-转角的稳定性等。

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改良饲用植酸酶的最适PH
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要使植酸酶能在畜禽体内产生有效的催化作用,就必须使酶与畜 禽的生理条件(体温及消化道的pH值)相适应。 不同的动物消化道的pH值不同,即使是一种动物在消化道的不 同部位pH值也不同,一般的pH值胃为1.5-3.5,小肠为5-7、大 肠为7左右。因此要求饲用酶对pH值有较大的适应范围。 pH值主要影响酶活性部位上关键残基的侧链基团或底物的解离 ,使酶与底物不能结合,或结合后不能进一步反应生成产物。

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可通过对氨基酸残基的置换,改变活性中心的氢键网,或改变氨基 酸残基的电子环境。从而改变催化基团的pKa值。
通过定点突变改变真菌和同序植酸酶的pH活性范围,用Lys、His 替换野生的A.fumigatus (烟曲霉菌 )植酸酶Gly277、Tyr282,将产 生第2个最适pH在2.8-3.4。 在同序植酸酶和A.fumigatus中K68A单点突变,以及在植酸酶进行 S140Y,D14lG双突变,以植酸为底物将降低最适声值0.5-1.0单位, 而酶的比活力没有明显变化。

思考题
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1.什么是蛋白质工程?它与基因工程有何 关联? 2.什么是定位突变技术?它包括哪些常用 方法?


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